一種用于檢測乙型腦炎疫苗病毒抗原含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，其要點是：首先在96孔酶標板上包被乙腦病毒多克隆抗體，包被完成后每孔分別加入乙腦陽性、陰性對照及經(jīng)過梯度稀釋后的待檢樣品，37℃孵育后清洗酶標板，加入乙腦病毒E蛋白單克隆抗體，37℃孵育后清洗酶標板，加入辣根酶標記結(jié)合物，37℃孵育后清洗酶標板，加底物顯色液顯色，終止后酶標儀讀取OD值，計算P/N值，確定抗原含量。本發(fā)明可快速檢測乙腦抗原含量，以及鑒別乙腦疫苗的真?zhèn)?，并為乙腦疫苗的生產(chǎn)提供有利的數(shù)據(jù)支持。
【專利說明】—種用于檢測乙型腦炎疫苗病毒抗原含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物制劑的檢測方法，特別是涉及一種利用雙抗夾心ELISA原理快速檢測乙腦病毒抗原含量、鑒別乙腦疫苗真?zhèn)蔚挠糜跈z測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。特別適合應(yīng)用在乙型腦炎疫苗生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性乙型腦炎是由乙腦病毒引起、由蚊蟲傳播的一種急性傳染病。乙腦的病死率和致殘率高，是威脅人群特別是兒童健康的主要傳染病之一。我國是乙腦高流行區(qū)，在20世紀60年代和70年代初期全國曾發(fā)生大流行，70年代以后隨著大范圍接種乙腦疫苗，乙腦發(fā)病率明顯下降，近年來維持在較低的發(fā)病水平。由此可見乙腦疫苗在預(yù)防乙腦流行上起著重要作用。而乙腦病毒抗原作為乙腦疫苗的最主要成分，其含量對疫苗質(zhì)量起到至關(guān)重要的作用。
[0003]在現(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)并沒有公開乙腦病毒抗原含量檢測的方法，也查不到國外企業(yè)的相關(guān)報道。根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)實際的生產(chǎn)情況，迫切需要能有一種檢測乙腦病毒抗原含量的方法，以便有效的預(yù)知成品疫苗的抗原含量，為疫苗成品生產(chǎn)提供可靠的定量數(shù)值依據(jù)，并用于快速鑒別疫苗真?zhèn)巍?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，公開一種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法。本發(fā)明應(yīng)用ELISA雙抗體夾心原理,首先在96孔酶標板上包被乙腦病毒多克隆抗體，包被完成后每孔分別加入乙腦陽性、陰性對照及經(jīng)過梯度稀釋后的待檢樣品，37°C孵育后清洗酶標板，加入乙腦病毒E蛋白單克隆抗體，37°C孵育后清洗酶標板，加入辣根酶標記結(jié)合物，37°C孵育后清洗酶標板，加底物顯色液顯色，終止后酶標儀讀取OD值。計算P/N值，確定抗原含量。本發(fā)明可快速檢測乙腦抗原含量，以及鑒別乙腦疫苗的真?zhèn)?。并為乙腦疫苗的生產(chǎn)提供有利的數(shù)據(jù)支持。
[0005]本發(fā)明給出的技術(shù)方案是:這種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步驟:
[0006](I)兔抗乙型腦炎多克隆抗體制備
[0007]I)注射抗原制備(乳化)震蕩CFA (完全弗氏佐劑)或IFA (不完全弗氏佐劑)，4°C下與同體積的乙腦病毒純化原液在玻璃試管內(nèi)混合，直至乳狀劑形成，擠出一滴至冷水表面上，如在水面上舉成一滴，證明可以使用，如液滴分散，繼續(xù)混勻，將配置成的乳狀劑轉(zhuǎn)移至2.5ml注射器，準備注射；
[0008]2)免疫程序
[0009]注射前兔子耳源取血作為實驗血清空白對照:
[0010]初次免疫
[0011]注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量Iml/點，共注射5ml (使用CFA)注射病毒蛋白量約0.8mg ；
[0012]加強免疫(間隔一周)
[0013]注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.5ml/點，注射共2.5ml (使用IFA)注射病毒蛋白量約0.4mg。
[0014]加強免疫(間隔一周)
[0015]注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.2ml/點，注射共Iml (使用IFA)注射病毒蛋白量約0.2mg,
[0016]間隔一周后，心臟采血制備抗血清；
[0017]3)分離血清檢測抗體
[0018]將新鮮采集的血液，分裝至15ml無菌離心管中，室溫條件下斜面放置4小時，使血塊形成，4°C下放置過夜使血塊縮??；使用無菌槍頭剝離血塊，將血清轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，3000g離心lOmin，保留上清液，然后對血清中抗體進行檢測；
[0019]4)抗血清IgG純化
[0020]鹽析法粗體一硫酸銨沉淀
[0021]4-1在離心管中加入5ml血清和5ml 0.02mol/L,pH7.0磷酸鹽緩沖液，混勻，用槍頭吸取IOml SAS，邊滴加邊攪拌，使溶液飽和度達到50%，用滴管邊加邊攪拌，攪拌時不要過急以免產(chǎn)生過多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性，加完后在室溫放置4°C過夜，以3000r/min離心IOmin,白蛋白在上清液中,沉淀為球蛋白，棄去上清液,留下沉淀部分；
[0022]4-2將所得沉淀再溶于5ml 0.02mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液中，滴加2.7mlSAS,使溶液的飽和度達35%，加完后4°C放置20min，以3000r/min離心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀為IgG，棄去上清液，即獲得粗制的IgG沉淀；
[0023]4-3將獲得的粗IgG沉淀溶解于5ml 0.02mol/L, pH 7.0磷酸緩沖液中；
[0024]5)蛋白A親和純化
[0025]5-1柱平衡:用Binding buffer清洗柱,5-10個體積；
[0026]5-2上樣:使用注射器緩慢擠壓Iml樣品進入柱內(nèi)；
[0027]5-3清洗:使用Binding buffer清洗柱,5-10個柱體積；
[0028]5-4洗脫:使用Elution buffer洗脫柱，同時收集3個柱體積洗脫組分；
[0029]5-5合并洗脫組分，測定IgG的含量為5mg/ml和抗體活性；
[0030](2) ELISA方法的建立(方陣滴定)
[0031]將兔抗乙腦病毒多克隆抗體不同稀釋濃度(5 μ g/ml, 10 μ g/ml)包被96孔板，200 μ I/孔，用封口膜封好，置于濕盒中37°C 3小時，然后4°C過夜，取出倒空板，加300 μ I/孔封閉液，用封口膜封嚴后置于濕盒中37°C I小時，最后倒空板，用封口膜封好，置于_70°C保存；
[0032]樣品以2倍法稀釋256\512\1024三個稀釋度，將預(yù)先包被好的酶標板從_70°C冰箱中取出，用洗板機清洗4次，洗液300 μ I/孔，倒空板，加樣200 μ I/孔，空白孔由稀釋液代替，用封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ；
[0033]取出板，洗板機清洗5次，洗液300 μ I/孔，加乙腦病毒E蛋白單克隆抗體(稀釋度分別10-410-5)200 μ I/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ；
[0034]取出板，洗板機清洗5次，洗液300 μ I/孔，加辣根酶標記山羊抗小鼠過氧化物(稀釋度分別10_410_5)200 iil/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育60min ；
[0035]取出板，洗板機清洗6次，洗液300 ill /孔，加0PD顯色液，200 yl /孔，室溫下避光 反應(yīng)30min ；
[0036]顯色后H2S04終止液，50 u 1/孔，使用酶標儀，并在492nm測定各孔0D值。
[0037](3)具體實驗樣品檢測
[0038]將兔抗乙腦病毒多克隆抗體（濃度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200 yl， 用封口膜封好，置于濕盒中37°C 3小時，然后4°C過夜后取出倒空板，加300 yl/孔封閉液， 再用封口膜封好置于濕盒中37V 1小時，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70°C保存；
[0039]樣品以2倍法稀釋（64、128、256、512)，將預(yù)先包被好的酶標板從_70°C冰箱中取 出，洗板機清洗4次，洗液300 y 1/孔，倒空板，加樣200 ii 1/孔，由低稀釋度往高稀釋度加， 每次實驗設(shè)空白對照、陽性對照、陰性對照各兩孔，加樣后酶標板用封口膜密封，置于37°C 濕盒中鮮育90min ；
[0040]取出酶標板，洗板機清洗5次，洗液300 u 1/孔，將稀釋度為10_4的乙腦病毒E蛋 白單克隆抗體加到酶標板上，200 yl/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ；
[0041]取出酶標板，洗板機清洗5次，洗液300 u 1/孔，將稀釋度10-5的辣根酶標記山羊 抗小鼠過氧化物加到酶標板上，200 yl/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育60min ；
[0042]取出酶標板，洗板機清洗6次，洗液300 ill/孔。加入0PD顯色液，200 yl/孔，室 溫下避光反應(yīng)30min ；
[0043]顯色后加50 u 1/孔終止液，設(shè)定相應(yīng)的空白，酶標儀492nm測定；
[0044]結(jié)果判定：
[0045]當陰性對照0D值< 0. 1，陽性對照0D值≤1. 0時，該試驗成立；
[0046]若陰性對照平均0D值< 0. 05，按0. 05計算；
[0047]若陰性對照平均0D值> 0. 05，按實際0D值計算；
[0048]當P/N≤2. 1時，則判定樣品在該稀釋度下呈陽性，并確定呈陽性的最大稀釋度；
[0049]其中：P是樣品平均0D值 N是陰性對照平均0D值。
[0050]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0051]在現(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)并沒有公開乙腦病毒抗原含量檢測的方法，也查不到國外企 業(yè)的相關(guān)報道。建立此方法可以根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)實際的生產(chǎn)情況，有效的預(yù)知成品疫苗的 抗原含量，為疫苗成品生產(chǎn)提供可靠的定量數(shù)值依據(jù)，并能快速鑒別疫苗真?zhèn)?，縮短實驗時 間，幾小時內(nèi)出結(jié)果，不使用實驗動物，節(jié)省實驗資金，特別適用于快速鑒別疫苗真?zhèn)巍?br> 【具體實施方式】
[0052]實施例1
[0053]這種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，有以下步驟：
[0054]一兔抗乙型腦炎多克隆抗體制備
[0055]1.注射抗原制備（乳化）震蕩CFA(完全弗氏佐劑）或IFA (不完全弗氏佐劑）。 4°C下與同體積的乙腦病毒純化原液在玻璃試管內(nèi)強力混合。直至乳狀劑形成。擠出一滴 至冷水表面上，如在水面上舉成一滴，證明可以使用。如液滴分散，繼續(xù)混勻。將配置成的 乳狀劑轉(zhuǎn)移至2. 5ml注射器，準備注射。[0056]2免疫程序
[0057]注射前兔子耳源取血作為實驗血清空白對照
[0058]初次免疫
[0059]注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量Iml/點。共注射5ml (使用CFA)注射病毒蛋白量約0.8mg。
[0060]加強免疫(間隔一周)
[0061]注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近。為皮下、肌肉注射5點。注射劑量0.5ml/點。注射共2.5ml (使用IFA)注射病毒蛋白量約0.4mg。
[0062]加強免疫(間隔一周)
[0063]注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近。為皮下、肌肉注射5點。注射劑量0.2ml/點。注射共Iml (使用IFA)注射病毒蛋白量約0.2mg
[0064]間隔一周后，心臟采血制備抗血清。
[0065]3.分離血清檢測抗體
[0066]將新鮮采集的血液，分裝至15ml無菌離心管中，室溫條件下斜面放置4小時，使血塊形成，4°C下放置過夜使血塊縮小。使用無菌槍頭剝離血塊。將血清轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，3000g離心lOmin，保留上清液。然后對血清中抗體進行檢測。(見表1)
[0067]表1:血清中抗體測定結(jié)果
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測乙型腦炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步驟: (1)兔抗乙型腦炎多克隆抗體制備 1)注射抗原制備 震蕩CFA (完全弗氏佐劑)或IFA (不完全弗氏佐劑)，4°C下與同體積的乙腦病毒純化原液在玻璃試管內(nèi)混合，直至乳狀劑形成，擠出一滴至冷水表面上，如在水面上舉成一滴，證明可以使用，如液滴分散，繼續(xù)混勻，將配置成的乳狀劑轉(zhuǎn)移至2.5ml注射器，準備注射； 2)免疫程序 注射前兔子耳源取血作為實驗血清空白對照: 初次免疫 注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量Iml/點，共注射5ml (使用CFA)注射病毒蛋白量0.8mg ； 加強免疫(間隔一周) 注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.5ml/點，注射共2.5ml (使用IFA)注射病毒蛋白量0.4mg ； 加強免疫(間隔一周) 注射部位為兩肩后側(cè)及兩髖附近，為皮下、肌肉注射5點，注射劑量0.2ml/點，注射共Iml (使用IFA)注射病毒蛋白量0.2mg， 間隔一周后，心臟采血制備抗血清； 3)分離血清檢測抗體 將新鮮采集的血液，分裝至15ml無菌離心管中，室溫條件下斜面放置4小時，使血塊形成，4°C下放置過夜使血塊縮??；使用無菌槍頭剝離血塊，將血清轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，3000g離心lOmin，保留上清液，然后對血清中抗體進行檢測； 4)抗血清IgG純化 鹽析法粗體-硫酸銨沉淀 4-1在離心管中加入5ml血清和5ml 0.02mol/L, ρΗ7.0磷酸鹽緩沖液，混勻，用槍頭吸取IOml SAS，邊滴加邊攪拌，使溶液飽和度達到50%，用滴管邊加邊攪拌，攪拌時不要過急以免產(chǎn)生過多泡沫，致使蛋白質(zhì)變性，加完后在室溫放置4°C過夜，以3000r/min離心IOmin,白蛋白在上清液中,沉淀為球蛋白，棄去上清液,留下沉淀部分； 4-2將所得沉淀再溶于5ml 0.02mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液中，滴加2.7mlSAS,使溶液的飽和度達35%，加完后4°C放置20min，以3000r/min離心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀為IgG，棄去上清液，即獲得粗制的IgG沉淀； 4-3將獲得的粗IgG沉淀溶解于5ml0.02mol/L, pH 7.0磷酸緩沖液中； 5)蛋白A親和純化 5-1柱平衡:用Bindingbuffer清洗柱，5_10個體積； 5-2上樣:使用注射器緩慢擠壓Iml樣品進入柱內(nèi)； 5-3清洗:使用Binding buffer清洗柱,5-10個柱體積； 5-4洗脫:使用Elution buffer洗脫柱，同時收集3個柱體積洗脫組分； 5-5合并洗脫組分，測定IgG的含量為5mg/ml和抗體活性； (2)ELISA方法的建立將兔抗乙腦病毒多克隆抗體不同稀釋濃度(Syg/miaOyg/ml)包被96孔板，200 μl/孔，用封口膜封好，置于濕盒中37°C 3小時，然后4°C過夜，取出倒空板，加300 μl/孔封閉液，用封口膜封嚴后置于濕盒中37°C l小時，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70°C保存；樣品以2倍法稀釋256\512\1024三個稀釋度，將預(yù)先包被好的酶標板從_70°C冰箱中取出，用洗板機清洗4次，洗液300 μl/孔，倒空板，加樣200 μl/孔，空白孔由稀釋液代替，用封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ； 取出板，洗板機清洗5次，洗液300 μ l/孔，加乙腦病毒E蛋白單克隆抗體(稀釋度分別10_410_5)200 μl/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ； 取出板，洗板機清洗5次，洗液300 μ l/孔，加辣根酶標記山羊抗小鼠過氧化物(稀釋度分別10_410_5)200 μl/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育60min ； 取出板，洗板機清洗6次，洗液300 μl/孔，加OPD顯色液，200 μl/孔，室溫下避光反應(yīng)30min ； 顯色后H2SO4終止液，50 μ l/孔，使用酶標儀，并在492nm測定各孔OD值； (3)具體實驗樣品檢測 將兔抗乙腦病毒多克隆抗體(濃度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200 μ 1，用封口膜封好，置于濕盒中37°C 3小時，然后4°C過夜后取出倒空板，加300 μl/孔封閉液，再用封口膜封好置于濕盒中37°C1小時，最后倒空板，用封口膜封好，置于_70°C保存； 樣品以2倍法稀釋(64、128、256、512)，將預(yù)先包被好的酶標板從-70°C冰箱中取出，洗板機清洗4次，洗液300 μ l/孔，倒空板，加樣200 μ l/孔，由低稀釋度往高稀釋度加，每次實驗設(shè)空白對照、陽性對照、陰性對照各兩孔，加樣后酶標板用封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ； 取出酶標板，洗板機清洗5次，洗液300 μ I/孔，將稀釋度為10_4的乙腦病毒E蛋白單克隆抗體加到酶標板上，200 μ l/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育90min ； 取出酶標板，洗板機清洗5次，洗液300 μ l/孔，將稀釋度10_5的辣根酶標記山羊抗小鼠過氧化物加到酶標板上，200 μ l/孔，封口膜密封，置于37°C濕盒中孵育60min ； 取出酶標板，洗板機清洗6次，洗液300 μl/孔。加入OPD顯色液，200 μ l/孔，室溫下避光反應(yīng)30min ； 顯色后加50 μ l/孔終止液，設(shè)定相應(yīng)的空白，酶標儀492nm測定； 結(jié)果判定: 當陰性對照OD值≤0.1，陽性對照OD值≥1.0時，該試驗成立； 若陰性對照平均OD值≤ 0.05，按0.05計算； 若陰性對照平均OD值> 0.05,按實際OD值計算； 當P/N≥2.1時，則判定樣品在該稀釋度下呈陽性，并確定呈陽性的最大稀釋度； 其中:P是樣品平均OD值N是陰性對照平均OD值。
【文檔編號】G01N33/569GK103777022SQ201210398684
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】高旭哲, 戰(zhàn)辛, 劉暢, 張玥 申請人:遼寧成大生物股份有限公司