一種處理液以及采用其測定鋁鹽吸附型疫苗中抗原含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及吸附型滅活疫苗中抗原解吸附 的處理液及所述抗原的含量測定方法。
【背景技術】
[0002] 乙型腦炎病毒抗原是乙型腦炎滅活疫苗中的主要有效成分，其有效含量與疫苗接 種后的保護效果直接相關，因此，其抗原含量是乙型腦炎滅活疫苗質量控制中的一項重要 檢測項目。
[0003] 目前，對乙型腦炎病毒抗原含量的檢測大多采用酶聯(lián)免疫吸附法，其原理是將可 溶性的乙型腦炎病毒單克隆抗體或高純度的多克隆抗體吸附在酶聯(lián)反應板上，使供試品中 的待檢抗原與其發(fā)生特異性結合，再加入酶標抗體，使其與吸附在酶聯(lián)反應板上的抗原結 合形成免疫復合物，通過酶反應底物在酶的作用下產(chǎn)生顯色反應，并根據(jù)顏色變化對供試 品中的抗原做定量分析。這種方法具有操作簡便、準確度高等優(yōu)點，但是其檢測結果易受供 試品中其他非抗原成分的干擾，出現(xiàn)假陽性或假陰性結果。并且，乙型腦炎滅活疫苗中的抗 原為滅活病毒抗原，在接種后誘導機體產(chǎn)生的免疫反應要弱于減毒疫苗，因此，為了使接種 者更有效的獲得免疫，常需要加入佐劑制備成吸附型疫苗，誘導機體對病毒抗原產(chǎn)生免疫 識別。鋁鹽佐劑是目前惟一可用于人體的佐劑，這類佐劑包括氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、 鋁佐劑。它們會與抗原表面攜帶的負電荷基團發(fā)生共價或配位結合，以顆粒的方式包裹抗 原，與可溶性抗原一起形成沉淀，從而使復合物更具免疫性。鋁鹽佐劑與抗原的結合屏蔽了 抗原表面的特異性結合位點，進而在抗原的體外檢測過程中，抗原無法與酶聯(lián)反應板或酶 標抗體上的特異性抗體相結合，從而導致抗原檢出量偏低或無法檢出。針對這一類吸附疫 苗還沒有成熟的抗原含量檢測方法，特別是對吸附乙型腦炎疫苗的病毒抗原檢測，也未見 文獻報道。
[0004] 目前國外對于鋁鹽吸附疫苗中的抗原含量檢測也僅處于研究階段。相關研究表明 鋁鹽佐劑與抗原之間的相互吸附作用主要是通過以下三種方式實現(xiàn)：靜電吸引力、疏水作 用以及配基交換作用。為了能夠準確測定吸附疫苗中的病毒抗原，需要首先破壞抗原與佐 劑之間的這三種相互作用力，使抗原先從佐劑上解離下來，暴露出抗原表面上相應的抗原 決定簇，再通過酶聯(lián)免疫吸附法或電泳等方法對其進行檢測。據(jù)文獻報道，一些金屬離子螯 合劑、表面活性劑、有機酸、乙二醇等物質可以針對抗原與佐劑之間存在的一種或幾種相互 作用力進行破壞，達到解離抗原的目的。因此，以這些化學物質為基礎設計的樣品處理液屢 見報道，主要有如下兩種樣品處理液：
[0005] 以不同濃度的表面活性劑(包括十六烷基磺酸鈉，曲通-100,西氯吡銨，鹽酸胍)作 為樣品處理溶液，其作用機理可能是通過表面活性劑與抗原的交聯(lián)作用使其從鋁佐劑上解 離下來。文獻表明，使用IOmM的陽離子表面活性劑西氯吡啶處理氫氧化鋁佐劑吸附的卵清 蛋白疫苗，其解離效果最好，卵清蛋白的回收率可達50%。但是，幾乎所有的表面活性劑都會 或多或少的對蛋白質的結構造成破壞，引起蛋白質變性，因此抗原回收率很少達到60%。同 時，不同蛋白質的理化性質不同，對同一種表面活性劑的耐受程度也會存在較大的差異。吸 附乙型腦炎滅活疫苗中的乙腦抗原在陽離子表面活性劑以及陰離子表面活性劑中均較易 受到破壞：實驗表明，使用5mM的西氯吡啶溶液或使用濃度為0. 1-5%的十二烷基磺酸鈉溶 液對鋁佐劑吸附乙型腦炎滅活疫苗處理5分鐘，都會對乙腦抗原表面的特異性靶點結構造 成損害，導致抗原無法檢出。在表面活性劑中，尿素屬于溫和變性劑，對抗原結構的影響較 小，但將其應用于吸附乙型腦炎滅活疫苗的解吸附，其抗原回收率也僅有20%左右，這表明 乙型腦炎病毒抗原的結構容易受到表面活性劑的破壞，表面活性劑并不適宜作為吸附乙型 腦炎滅活疫苗樣品的處理液。
[0006] 另一種樣品處理溶液為羊組織間液，使用該溶液孵育吸附型疫苗，相當于模擬吸 附型疫苗在體液環(huán)境中緩慢解離并釋放抗原的過程，這種樣品處理液與上述的表面活性劑 處理液相比，可以更加緩和的釋放抗原，也不會對抗原蛋白結構造成大規(guī)模破壞。但這種方 法的應用受限于抗原的理化性質，例如：對于與氫氧化鋁佐劑吸附系數(shù)為〇. 086的卵清蛋 白，需要反應4小時才能完全解吸附；對于與氫氧化鋁佐劑吸附系數(shù)為6的乙肝抗原，在作 用48小時后，其抗原解離率還不到1%。除此之外，羊組織間液還具有不易制備，成本較高， 檢測耗時長等缺點，難以推廣。因此，Stanley LHem等人針對羊組織間液中的主要有效成 分進行了進一步的研究，他們認為羊組織間液中含有的一些成分可以與鋁佐劑更強有力的 結合，從而解除鋁佐劑與抗原之間的配基交換作用，將抗原解離下來。但是，這種建立在模 擬體液環(huán)境下的樣品處理液，與羊組織間液一樣，僅能夠對鋁佐劑-抗原之間的配位交換 作用力起到一定程度的破壞作用，而對于含有多種相互作用力的鋁鹽佐劑-復合物，則起 不到很好的解吸附效果。實驗表明，使用這種樣品處理液對吸附乙型腦炎疫苗處理48小 時，其解吸附率僅達到30%。這表明乙型腦炎抗原與鋁鹽佐劑之間的吸附機制不僅僅是配基 交換作用，可能同時包含較強的疏水作用力、靜電吸引力。
[0007] 因此，有必要針對乙型腦炎抗原與鋁佐劑之間的強吸附特點，開發(fā)一種新型樣品 處理液，從而突破現(xiàn)有技術障礙，使其可以同時破壞抗原與佐劑之間較強的配位交換作用 力、疏水作用力以及靜電吸引力，在較短時間內(nèi)解離80%以上的抗原，并可以通過酶聯(lián)免疫 法或電泳等方法對解離后的乙型腦炎抗原進行準確定量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術問題是要克服現(xiàn)有方法還不能夠對吸附型乙型腦炎滅活疫 苗中的抗原含量進行體外檢測，以打破無法直接對該疫苗中抗原含量進行有效的質量控制 這一難題，最終目的在于提供一種準確、有效的方法檢測吸附型乙型腦炎滅活疫苗中的抗 原含量。
[0009] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于解吸附鋁鹽吸附型疫苗中的抗原的處理 液。本發(fā)明的另一個目的是提供采用該處理液檢測鋁鹽吸附型疫苗中抗原含量的方法。本 發(fā)明的又一個目的是提供該處理液在配制鋁鹽吸附型疫苗中抗原含量的檢測試劑中的用 途。
[0010] 為解決上述技術問題，本發(fā)明主要通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0011] 一方面，本發(fā)明提供一種用于解吸附鋁鹽吸附型疫苗中的抗原的處理液，所述處 理液為磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，并包含蛋白質以及一種或多種酸和/或它們的 鹽。本發(fā)明提供的這種處理液將會對鋁鹽吸附型滅活疫苗、特別是乙型腦炎滅活疫苗中的 抗原與鋁佐劑進行解吸附處理，使得被解吸附的抗原能夠用于采用酶聯(lián)免疫乙腦病毒抗原 檢測試劑盒或電泳方法對其含量進行測定。
[0012] 優(yōu)選地，所述處理液的pH為6. 5-9.0。優(yōu)選地，所述處理液為0.02-2. Omol/L pH6. 5-9. 0的磷酸鹽緩沖液；所述pH更優(yōu)選為7. 0-8. 5,進一步優(yōu)選為7. 0。
[0013] 在所述處理液中，所述酸為選自以下的有機酸：水合或非水合的檸檬酸或酒石酸； 所述鹽優(yōu)選為檸檬酸鈉或酒石酸鈉；
[0014] 優(yōu)選地，所述酸和/或它們的鹽在所述處理液中各自的濃度為100 - 1000 meq. /L。
[0015] 并且，所述蛋白質為白蛋白，優(yōu)選血清白蛋白；優(yōu)選地，所述蛋白質在所述處理液 中的濃度為10 - 30% (w/v)，優(yōu)選30% (w/v)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】,所述處理液為含有0. 05mol/L氯化鈉、1000 meq./L 檸檬酸和30%牛血清白蛋白的2. 0mol/L pH7. 0的磷酸鹽緩沖液。
[0017] 另一方面，本發(fā)明一種用于檢測鋁鹽吸附型疫苗中抗原含量的方法，所述方法包 括：采用本發(fā)明提供的上述處理液處理待檢測疫苗。
[0018] 優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：
[0019] (1)將待檢測疫苗配制成溶液，然后與所述處理液混勻后孵育；
[0020] (2)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測步驟（1)得到的混合液中的抗原含量。
[0021] 其中，所述疫苗優(yōu)選為乙腦滅活疫苗，所述抗原優(yōu)選為乙腦病毒抗原；