一種用于培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基及其制備方法，具體涉及一種用于培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)基及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1996年以來(lái)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)發(fā)展到能夠自由擴(kuò)大培養(yǎng)并且用于工業(yè)化生 產(chǎn)。許多生物活性物質(zhì)、疫苗、載體，如單克隆抗體、藥用蛋白質(zhì)、高職病性藍(lán)耳病疫苗等， 都可以通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)獲得。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品既能提高生物制品的質(zhì) 量，又能促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)、病毒培養(yǎng)技術(shù)等的發(fā)展。從當(dāng)前發(fā)展趨 勢(shì)來(lái)看，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、無(wú)血清培養(yǎng)，是近年世界范圍內(nèi)各大生物公司產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展 方向。
[0003] 目前，獸用疫苗很多都需要通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過(guò)程需要使用血清。 在病毒繁殖過(guò)程中，病毒裂解細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、細(xì)胞和培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)、糖類、脂類 及核酸等雜質(zhì)成分，以及細(xì)胞代謝副產(chǎn)物等，易使接種動(dòng)物產(chǎn)生過(guò)敏，持續(xù)發(fā)熱等副作用。 怎么樣減少疫苗副反應(yīng)，提高疫苗的安全性是目前所有獸用疫苗關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。在生產(chǎn) 過(guò)程中使用血清，由于血清成分復(fù)雜，多為白蛋白和免疫球蛋白其分子量相對(duì)較大，在很大 程度上影響病毒與這些雜蛋白的分離。
[0004] 現(xiàn)有的裂解疫苗制備方法中，通常采用連續(xù)離心、沉淀等方法，如公開(kāi)號(hào)為 CN103721251A的發(fā)明專利申請(qǐng)文件，一種流感病毒裂解疫苗的純化方法，將流感病毒株接 種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)收獲病毒液，病毒液經(jīng)滅活后進(jìn)行超濾濃縮，所得超濾液用KII連續(xù)流離心 機(jī)進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，得到超離液，對(duì)超離液進(jìn)行超濾透析去除蔗糖后進(jìn)行分子篩凝 膠層析，獲得的病毒純化液用裂解劑TritonX-IOO和去氧膽酸鈉進(jìn)行病毒裂解，裂解結(jié)束 后，通過(guò)超濾透析去除裂解劑，獲得的裂解液離心去除雜蛋白，收集上清經(jīng)過(guò)濾除菌后，即 得純化的流感病毒裂解疫苗原液。該方法雖然能夠很好的去除雜質(zhì)，但操作方法繁雜、步驟 多，增加了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種便于病毒繁殖、培養(yǎng)結(jié)束后去除雜質(zhì)的用于培養(yǎng)病毒 的培養(yǎng)基及其制備方法。
[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用于培養(yǎng)病毒（本發(fā)明中的培養(yǎng)病毒是指將病毒接種到宿主細(xì)胞后，移種到 培養(yǎng)基中，病毒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，最后使宿主細(xì)胞裂解的過(guò)程）的培養(yǎng)基，包括培養(yǎng) 液（此處的培養(yǎng)液是指現(xiàn)有技術(shù)中已有的能夠用于培養(yǎng)病毒的液體培養(yǎng)基，包括但不限于 DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和199培養(yǎng)基），其還包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成 分；所述培養(yǎng)液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照體積百分?jǐn)?shù)計(jì)分別為：培養(yǎng) 液85-96 %、氨基酸溶液2-5%、胎牛血清中的小分子成分2-10% ;所述胎牛血清中的小分 子成分的分子量< 300KDa ;
[0008] 所述氨基酸溶液的溶劑為培養(yǎng)液，溶質(zhì)由按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的如下組分組成：甘 氨酸0. 1-1 %、異亮氨酸0.5-1. 5 %、絲氨酸0-1 %、丙氨酸0. 1-1 %、苯丙氨酸0. 1-0. 3、酪 氨酸0. 2-2 %、纈氨酸0. 2-1 %、脯氨酸0-0. 5 %、半胱氨酸0. 1-1 %、亮氨酸0-1 %、色氨酸 0. 5-2%、蛋氨酸0. 5-1%、天冬酰胺0. 05-0. 3%、谷氨酰胺0. 5-2%、蘇氨酸0. 2-1. 2%、天 冬氨酸〇. 05-2%、谷氨酸0-0. 5%、賴氨酸0. 5-1. 5%、精氨酸0. 1-0. 5%和組氨酸0-0. 5%。
[0009] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述胎牛血清中的小分子成分的分子量< lOOKDa。
[0010] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述胎牛血清中的小分子成分的分子量< 30KDa。
[0011] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述培養(yǎng)液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按 照體積百分?jǐn)?shù)計(jì)分別為：培養(yǎng)液93%、氨基酸溶液2%、胎牛血清中的小分子成分5%;所述 胎牛血清中的小分子成分的分子量< 30KDa ;
[0012] 所述氨基酸溶液的溶劑為培養(yǎng)液，溶質(zhì)由按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的如下組分組成：甘 氨酸0. 3 %、異亮氨酸0. 7 %、絲氨酸0. 05 %、丙氨酸0. 1 %、苯丙氨酸0. 2 %、酪氨酸0. 2 %、 纈氨酸〇. 4 %、脯氨酸0. 03 %、半胱氨酸0. 2 %、亮氨酸0. 4 %、色氨酸0. 5 %、蛋氨酸0. 7 %、 天冬酰胺0. 06 %、谷氨酰胺1 %、蘇氨酸0. 3 %、天冬氨酸0. 08 %、谷氨酸0. 5 %、賴氨酸 1 %、精氨酸〇. 1 %和組氨酸0.2%。
[0013] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述培養(yǎng)液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按 照體積百分?jǐn)?shù)計(jì)分別為：培養(yǎng)液88%、氨基酸溶液2%、胎牛血清中的小分子成分10% ;所 述胎牛血清中的小分子成分的分子量< 30KDa ;
[0014] 所述氨基酸溶液的溶劑為培養(yǎng)液，溶質(zhì)由按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)的如下組分組成：甘 氨酸0. 1%、異亮氨酸0.5%、絲氨酸0. 1%、丙氨酸0.2%、苯丙氨酸0. 1%、酪氨酸0.2%、 纈氨酸〇. 3 %、脯氨酸0. 02 %、半胱氨酸0. 2 %、亮氨酸0. 2 %、色氨酸0. 6 %、蛋氨酸0. 6 %、 天冬酰胺0. 06%、谷氨酰胺0. 7%、蘇氨酸0. 3%、天冬氨酸0. 06%、谷氨酸0. 5%、賴氨酸 0.6%、精氨酸0· 1 %和組氨酸0.2%。
[0015] 本發(fā)明還提供該用于培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)基的制備方法，其由如下方法制成：分別取 配方量的培養(yǎng)液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到產(chǎn)品。
[0016] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制備：取胎牛 血清，然后用截留分子量為10-300KD的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，得到胎牛血清中的小 分子成分。進(jìn)一步優(yōu)選的方案為所述超濾膜的截留分子量為30-100KD。更進(jìn)一步優(yōu)選的方 案為所述超濾膜的截留分子量為30KD。
[0017] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述氨基酸溶液由如下方法制備：取配方量的甘氨酸、異 亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸，然后溶解 在配方量的溶劑（即培養(yǎng)液）中，得到氨基酸溶液。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的用于培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì) 胎牛血清進(jìn)行預(yù)處理，取太牛血清中的小分子成分，然后添加氨基酸溶液，與培養(yǎng)液進(jìn)行混 合，使得病毒繁殖、培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不會(huì)存在白蛋白和免疫球蛋白等分子量較大的物質(zhì)，能 夠降低后續(xù)疫苗純化的難度，病毒繁殖結(jié)束后，通過(guò)離心去除宿主細(xì)胞碎片，然后進(jìn)行簡(jiǎn)單 的超濾即可將去除外源性的小分子蛋白及其他物質(zhì)，節(jié)約了操作步驟、簡(jiǎn)化了疫苗純化的 工藝，降低了生產(chǎn)成本；此外，該培養(yǎng)基的制備方法簡(jiǎn)單、易操作，便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的需 要。
[0019] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】 [0020] 實(shí)施例1
[0021] 一種用于培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)基，包括DMEM培養(yǎng)基（培養(yǎng)液），其還包括：氨基酸溶液 和胎牛血清中的小分子成分；所述DMEM培養(yǎng)