用于檢測(cè)培養(yǎng)于含有egf或bfgf的培養(yǎng)基的脂肪源性干細(xì)胞的增殖和治療能力的標(biāo)記物 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于檢測(cè)標(biāo)記物的組合物及其檢測(cè)方法，所述標(biāo)記物能夠檢測(cè)培養(yǎng)于 含有表皮生長(zhǎng)因子巧G巧或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子化FG巧的培養(yǎng)基的脂肪源性干細(xì)胞 的增殖或治療潛能。
【背景技術(shù)】
[0002] 因?yàn)橹窘M織含有的干細(xì)胞比可W從等量的骨髓獲得的干細(xì)胞多1000倍，已經(jīng) 進(jìn)行各種研究來(lái)將脂肪組織源性干細(xì)胞（ASC)用作移植材料。而且，脂肪源性干細(xì)胞是多 能樣（multipotent1化e)骨髓源性干細(xì)胞因此能夠被分化為軟骨類、骨類、脂肪細(xì)胞、肌肉 細(xì)胞等。此外，脂肪源性干細(xì)胞在表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物方面與骨髓源性干細(xì)胞類似，并已經(jīng) 被報(bào)道不誘導(dǎo)針對(duì)體內(nèi)和體外自體移植或異體移植的免疫反應(yīng)，而是在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面 表現(xiàn)出潛能，從而獲得作為有效用于基于細(xì)胞治療的方法方面的關(guān)注。
[0003] 但是，如果使用常規(guī)已知基礎(chǔ)培養(yǎng)基通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)脂肪源性干細(xì) 胞，該細(xì)胞培養(yǎng)需要大量時(shí)間，從而使得難于獲得臨床有效數(shù)量的細(xì)胞。因此，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方 法在實(shí)際臨床應(yīng)用中具有低效率的缺點(diǎn)。在運(yùn)方面，本發(fā)明人目標(biāo)在于開發(fā)用于有效臨床 治療方法的培養(yǎng)方法，并確認(rèn)，相比于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的脂肪源性干細(xì)胞，在含有表 皮生長(zhǎng)因子巧G巧或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子化FG巧的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪源性干細(xì)胞 表現(xiàn)出優(yōu)異的臨床效果（申請(qǐng)公開號(hào)為10-2010-0118491的韓國(guó)專利）。但是，尚未提供與 在含有EGF或bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪源性干細(xì)胞的優(yōu)異臨床效果有關(guān)的設(shè)及分子生 物學(xué)特征的目標(biāo)分析。
[0004] 特別地，對(duì)于作為實(shí)際藥物具有高于一定水平的治療作用同時(shí)相比于在基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的干細(xì)胞表現(xiàn)出在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞的優(yōu)異的增殖和治療潛能的干細(xì) 胞治療劑的可重復(fù)生產(chǎn)，需要開發(fā)可被應(yīng)用于使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基通過(guò)改善的培養(yǎng)方法所獲得 的醫(yī)學(xué)效果如干細(xì)胞的分化潛能、增殖潛能和效力的質(zhì)量控制檢查的方法。特別地，為了開 發(fā)評(píng)估治療劑的質(zhì)量和細(xì)胞治療劑的產(chǎn)量提高的方法，需要能夠表示運(yùn)種提高的生物標(biāo)記 物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引技術(shù)問(wèn)題
[0006]與培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相比，當(dāng)培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，脂肪源性干細(xì)胞表現(xiàn)出 優(yōu)異的增殖潛能，使得其甚至在長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)之后仍然能夠維持干細(xì)胞的特征，并表現(xiàn)出 高治療效果W及分化潛能。在運(yùn)方面，本發(fā)明人目標(biāo)在于開發(fā)一種標(biāo)記物，其在培養(yǎng)于 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞和培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞之間顯示出 表達(dá)差異，并且本發(fā)明人觀察到在培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞中，1-酷基甘 油-3-憐酸0-酷基轉(zhuǎn)移酶9 (AGPAT9)、膜聯(lián)蛋白A10 (ANXA10)、膜島素樣生長(zhǎng)因子2結(jié)合蛋 白3(IGF2BP：3)和前列腺素E受體2(PTGE喲的基因表達(dá)提高，并且整合素αll(ITGAll)、P服C細(xì)胞調(diào)亡WTl調(diào)節(jié)子蛋白（PAWR) (P服CapoptosisWTlregulatorprotein)和分泌型 卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)的基因表達(dá)降低。因此，本發(fā)明人確認(rèn)，運(yùn)些基因可W被用于測(cè)量 培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的治療活性等W及增殖、免疫抑制潛能、分化潛能 等，并完成了本發(fā)明。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供檢測(cè)標(biāo)記物的組合物，所述標(biāo)記物能夠檢測(cè)培養(yǎng)于含有 表皮生長(zhǎng)因子巧G巧或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子化FG巧的培養(yǎng)基的脂肪源性干細(xì)胞的治 療潛能，所述組合物包括用于測(cè)量至少一種基因的mRNA或蛋白質(zhì)水平的試劑，所述至少一 種基因選自由1-酷基甘油-3-憐酸0-酷基轉(zhuǎn)移酶9 (AGPAT9)、膜聯(lián)蛋白A10 (ANXA10)、膜島 素樣生長(zhǎng)因子2結(jié)合蛋白3(IGF2BP3)、前列腺素E受體2(PTGER2)、整合素αliaTGAll)、 P服C細(xì)胞調(diào)亡WTl調(diào)節(jié)子（PAWR)和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2 (SFRP2)組成的組。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)標(biāo)記物的組合物，所述標(biāo)記物能夠檢測(cè)培養(yǎng) 于含有EGF或bFGF的培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的增殖潛能，所述組合物包括用于測(cè)量選 自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA1UPAWR和SFRP2 組成的組中至少一種基因的 mRNA或蛋白質(zhì)水平的試劑。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)標(biāo)記物的試劑盒，所述標(biāo)記物能夠檢測(cè)培養(yǎng) 于含有EGF或bFGF的培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的治療或增殖潛能，所述試劑盒包括用于 檢測(cè)該標(biāo)記物的組合物。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)脂肪源性干細(xì)胞的治療或增殖潛能的方 法，所述方法包括測(cè)量培養(yǎng)于含有EGF或bFGF的培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞中的選自由 AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR和SFRP2 組成的組中至少一種基因的mRNA 或蛋白質(zhì)水平的步驟。
[0012] 有益效果
[0013] 本發(fā)明提供能夠檢測(cè)培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的具有增強(qiáng)的臨床效果的脂肪源性干 細(xì)胞的標(biāo)記物，從而為證實(shí)脂肪源性干細(xì)胞的效果提供更加有效的數(shù)據(jù)。而且，本發(fā)明可W 被有效用作能夠檢測(cè)通過(guò)改善的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的脂肪源性干細(xì)胞的由增殖潛能、分化潛能 等代表的治療活性的標(biāo)記物。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1顯示在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
[0015]圖2顯示在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)差異。
[0016] 圖3顯示使用IIlumina24K忍片的培養(yǎng)于3組基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的細(xì)胞和培養(yǎng)于生 長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的微陣列結(jié)果。
[0017] 圖4顯示由RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR所證實(shí)的、收集自17個(gè)供體的脂肪源性干細(xì)胞中的 基因表達(dá)量的改變，其在圖3中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提高，其中RPL13A為對(duì)照基因。圖4A、4B、 4C和4D分別顯示APPAT9、ANXA10、IGF2BP3和PTGER2的結(jié)果，其在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中均提高。
[0018]圖5顯示由RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR所證實(shí)的、收集自17個(gè)供體的脂肪源性干細(xì)胞中 的基因表達(dá)量的改變，其在圖3中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中降低，其中RPL13A為對(duì)照基因。圖5A、5B 和5C分別顯示口GAll、PAWR和SFRP2的結(jié)果，其在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中均降低。
[0019] 圖6顯示在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的基因的蛋白質(zhì)改變。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明提供用于檢測(cè)標(biāo)記物的組合物，所述標(biāo)記物能夠檢測(cè)培養(yǎng)于含有EGF或 bFGF的培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞的治療潛能，所述組合物包括用于測(cè)量選自由AGPAT9、 ANXA10、IGF2BP3、PTGER2、ITGA11、PAWR和SFRP2組成的組中至少一種基因的mRNA或蛋白 質(zhì)水平的試劑。
[0021] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"脂肪源性干細(xì)胞（ASC)"是指分離自脂肪組織的干細(xì)胞，其能 夠分化成為大多數(shù)間充質(zhì)細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等，并且其 也被稱為前脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、多能脂肪源性的細(xì)胞、脂肪源性成體干細(xì)胞等。所述脂肪 源性干細(xì)胞可W源自包括豬、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、人類等哺乳動(dòng)物，其可W被移植到人類，但 不限于此。
[0022] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"能夠檢測(cè)培養(yǎng)于含有EGF或bFGF的培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì) 胞的治療潛能的標(biāo)記物"是指有機(jī)生物分子，所述有機(jī)生物分子在比較培養(yǎng)于不含EGF或 bFGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞和培養(yǎng)于含有EGF或bFGF的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪 源性干細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出表達(dá)水平的顯著差異。而且，與培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì) 胞相比，培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞具有優(yōu)異的治療潛能，如免疫抑制或分化 潛能等（申請(qǐng)公開號(hào)為10-2010-0118491的韓國(guó)專利）。因此，該術(shù)語(yǔ)是指能夠通過(guò)比較表 達(dá)水平與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)脂肪源性干細(xì)胞的治療潛能的標(biāo)記物，并具體為 選自由AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3、PTG邸2、UGA11、PAWR和SFRP2組成的組中至少一種基因， 與培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的脂肪源性干細(xì)胞相比，所述標(biāo)記物對(duì)于培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的脂 肪源性干細(xì)胞顯示提高的AGPAT9、ANXA10、IGF2BP3和PTGER2表達(dá)，W及降低的口GA11、 PAWR和SFRP2 表達(dá)。
[0023] 而且，本發(fā)明中所使用的基因的信息，可W從已知數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，所述數(shù)據(jù)庫(kù)如美 國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的GenBank等，并且其實(shí)例可W包括但不限于AGPAT9 (NM_032717. 3， NP_00124335