用于流感診斷的方法和試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001] 巧關申請的香叉引用
[0002] 本申請要求2013年4月1日提交的名稱為"床旁（P0C)流感抗病毒易感性測 試（PointOfCareInfluenzaAntiviralSusceptibilityTest)"的美國臨時申請第 61/807, 185號的權益，其通過引用W其全文并入本文。
技術領域
[0003] 本文提供的一些實施方式設及用于床旁流感測試的方法、組合物、裝置和系統(tǒng)。一 些實施方式設及組合分析。在一些實施方式中，鑒別A型流感或B型流感的分析與測定流 感神經(jīng)氨酸酶對抗病毒藥物的敏感性的分析組合。
【背景技術】
[0004] 流感為公共健康的持續(xù)和嚴重威脅。每年，流感相關疾病在美國導致大約200, 000 例住院和36, 000例死亡。從國家影響視角來看，2010年源于流感的總經(jīng)濟成本估計為290 億美元。流感的抗病毒療法在W及時方式給予為治療或給予用于預防時有效。若干研究得 出神經(jīng)氨酸酶藥物減少癥狀持續(xù)時間的結論。特敏福（Tamiflu)和瑞樂沙巧elenza)均在 針對季節(jié)性流感的預防中80%有效。當治療患有流感的患者時，推薦的是患者在癥狀的48 小時內(nèi)開始治療且延遲越小越好。即時診斷和開始抗病毒治療導致最佳患者結果。
[0005] 基于對M2通道阻斷劑的廣泛抗性，推測廣泛使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑可能最后導 致在季節(jié)性或大流行流感病毒中出現(xiàn)其抗性并非不合理。已在臨床研究期間鑒別多種抗神 經(jīng)氨酸酶抑制劑突變體。在Ξ年期間的監(jiān)測中，分離了八種對奧司他韋的易感性具有> 10 倍降低的病毒變體。當考慮用于季節(jié)性流感管理的基于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的藥物的質(zhì)量分 布時，運些發(fā)現(xiàn)應引起暫停。在2007-2008冬季期間出現(xiàn)傳染性奧司他韋抗性流感病毒和 在服N1和大流行流感化N1中檢測到奧司他韋抗性（2009)之后，WHO在2010年于香港召 開關于抗病毒抗性的第一屆全球磋商會。此磋商會的關鍵結果是在臨床環(huán)境中或作為國家 監(jiān)測的部分而W正式狀態(tài)報導對流感的抗病毒抗性的要求。此外，一些抗病毒劑（如奧司 他韋）引起不良事件，使得僅在需要時開處方是重要的。各種抗病毒藥物的覆蓋范圍可W 隨著提供商而變化且具有對于患者的不同成本。醫(yī)師有責任僅在需要時開處方。盡管成本 次于有效性，如果患者可W用較不昂貴的藥物對付過去，那么醫(yī)師有義務使患者了解該選 項。因此，對于可W提供特異性菌株的診斷W避免不良事件、減緩抗藥性的演化且為患者和 美國保健系統(tǒng)產(chǎn)生節(jié)約的床旁測試存在未滿足的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文提供的方法、試劑盒、系統(tǒng)和組合物的一些實施方式包括檢測流感病毒的方 法，其包括：(a)使樣品與適于檢測A型流感病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析緩 沖劑接觸，進而獲得免疫分析測試樣品；化）使免疫分析測試樣品的第一部分與包括檢測A 型或B型流感的免疫分析的測試物接觸，進而檢測樣品中A型或B型流感的存在或不存在； (C)使免疫分析測試樣品的第二部分與包括神經(jīng)氨酸酶分析緩沖劑的基質(zhì)接觸，進而獲得 神經(jīng)氨酸酶測試樣品；W及（d)使神經(jīng)氨酸酶測試樣品接觸神經(jīng)氨酸酶分析物，進而檢測 樣品中神經(jīng)氨酸酶的存在。在一些實施方式中，免疫分析緩沖劑與用于神經(jīng)氨酸酶活性的 分析不相容。在一些實施方式中，免疫分析緩沖劑抑制神經(jīng)氨酸酶活性。在一些實施方式 中，步驟（C)和（d)在相同容器中進行。
[0007] 本文提供的一些實施方式包括檢測流感病毒的方法，其包括：(a)使樣品與適于 神經(jīng)氨酸酶分析的神經(jīng)氨酸酶分析緩沖劑接觸，進而獲得神經(jīng)氨酸酶測試樣品；化）使神 經(jīng)氨酸酶測試樣品的第一部分與包括檢測A型或B型流感的免疫分析的測試物接觸，其中 神經(jīng)氨酸酶測試樣品接觸包含免疫分析緩沖劑的基質(zhì)，進而獲得免疫分析測試樣品且檢測 樣品中A型或B型流感的存在或不存在；和（C)使神經(jīng)氨酸酶測試樣品的第二部分與神經(jīng) 氨酸酶分析物接觸，進而檢測樣品中神經(jīng)氨酸酶的存在。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分 析緩沖劑與檢測A型或B型流感的免疫分析不相容。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析 緩沖劑抑制抗體與選自A型流感和B型流感的抗原的特異性結合。在一些實施方式中，基 質(zhì)包括凍干或干燥的免疫分析緩沖劑。在一些實施方式中，步驟（C)在包含多個室的容器 中進行。
[0008] 在檢測流感病毒的方法的一些實施方式中，容器包括多個室。在一些實施方式中， 容器包括包含基質(zhì)的室，和包含用于神經(jīng)氨酸酶分析的試劑的室。在一些實施方式中，基質(zhì) 包含交聯(lián)多糖。在一些實施方式中，基質(zhì)選自葡聚糖凝膠和瓊脂糖。
[0009] 在一些實施方式中，免疫分析測試樣品和神經(jīng)氨酸酶測試樣品通過選自重力、毛 細作用和擴散的一種或多種力在容器中移動。
[0010] 在一些實施方式中，容器包括套筒。在一些實施方式中，容器包含適于使用光電倍 增器讀取的多孔套筒。在一些實施方式中，光電倍增器選自光電倍增管和微光電倍增管。在 一些實施方式中，光電倍增器為便攜式的。在一些實施方式中，光電倍增器在適合于初級護 理醫(yī)師辦公室的便攜式讀取器中。在一些實施方式中，光電倍增管表面為圓形且具有約6mm 至IJ9mm的直徑，或微光電倍增管為矩形且具有約1mm至IJ3mm的尺寸。
[0011] 在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析包括測定神經(jīng)氨酸酶對測試化合物的敏感 性。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析包括：(a)獲得抑制值比率，其中比率包括與不存 在測試化合物情況下相比的神經(jīng)氨酸酶活性水平的存在測試化合物情況下的神經(jīng)氨酸酶 活性水平；和化）比較抑制值與抑制闊值的比率，進而測定神經(jīng)氨酸酶活性對測試化合物 的敏感性。在一些實施方式中，抑制闊值通過檢測A型或B型病毒確定。在一些實施方式 中，如果檢測A型病毒，那么使用第一抑制闊值，且如果檢測B型病毒，那么使用第二抑制闊 值。在一些實施方式中，第一闊值比第二闊值低。在一些實施方式中，抑制闊值通過測試化 合物確定。
[0012] 一些實施方式也包括選擇用于治療流感的測試化合物。
[0013] 在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析包含包括含信號傳導酶的雙酶分析。在一些 實施方式中，神經(jīng)氨酸酶活性產(chǎn)生用于信號傳導酶的底物。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶 分析包括N-乙酷基神經(jīng)氨酸和巧光素或其衍生物的綴合物。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸 酶活性產(chǎn)生用于信號傳導酶的抑制劑。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析包括N-乙酷基 神經(jīng)氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的綴合物。在一些實施方式中，信號傳導酶包括巧光素 酶。在一些實施方式中，免疫分析緩沖劑抑制巧光素酶活性。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸 酶活性水平使用光電倍增管測量。
[0014] 在一些實施方式中，測試化合物為抗病毒藥物。在一些實施方式中，測試化合物 為選自W下的抗病毒藥物：奧司他韋（Oseltamivir)、扎那米韋狂anamivir)、拉那米韋 (Xanamivir)和帕拉米韋（Peramivir)。
[0015] 在一些實施方式中，免疫分析包括夾屯、分析。
[0016] 在一些實施方式中，樣品獲自受試者。在一些實施方式中，受試者疑似患有流感。 在一些實施方式中，受試者為人類。
[0017] 本文提供的一些實施方式包括選擇用于流感病毒的治療的方法，其包括：(a)使 樣品與適于檢測A型流感病毒或B型流感病毒的免疫分析的免疫分析緩沖劑接觸，進而獲 得免疫分析測試樣品；化）使免疫分析測試樣品的第一部分與包含檢測A型或B型流感的 免疫分析的測試物接觸，進而檢測樣品中A型或B型流感的存在或不存在；（C)使免疫分析 測試樣品的第二部分與包含神經(jīng)氨酸酶分析緩沖劑的基質(zhì)接觸，進而獲得神經(jīng)氨酸酶測試 樣品；（d)使神經(jīng)氨酸酶測試樣品與神經(jīng)氨酸酶分析物接觸，進而測定神經(jīng)氨酸酶測試樣 品的神經(jīng)氨酸酶對測試化合物的敏感性，所述測定包括：（i)獲得抑制值比率，其中比率包 括與不存在一種或多種測試化合物情況下的神經(jīng)氨酸酶活性水平相比的存在一種或多種 測試化合物情況下的神經(jīng)氨酸酶活性水平，和（ii)比較抑制值與抑制闊值的比率，進而測 定神經(jīng)氨酸酶活性對測試化合物的敏感性；和（e)從經(jīng)測定抑制神經(jīng)氨酸酶活性的一種或 多種測試化合物選擇測試化合物。在一些實施方式中，免疫分析緩沖劑與用于神經(jīng)氨酸酶 活性的分析不相容。在一些實施方式中，免疫分析緩沖劑抑制神經(jīng)氨酸酶活性。在一些實 施方式中，步驟（C)和（d)在相同容器中進行。
[0018] 本文提供的一些實施方式包括選擇用于流感病毒的治療的方法，其包括：(a)使 樣品與適于神經(jīng)氨酸酶分析的神經(jīng)氨酸酶分析緩沖劑接觸，進而獲得神經(jīng)氨酸酶測試樣 品；化）使神經(jīng)氨酸酶測試樣品的第一部分與包含檢測A型或B型流感的免疫分析物接觸， 其中神經(jīng)氨酸酶測試樣品與包含免疫分析緩沖劑的基質(zhì)接觸，進而獲得免疫分析測試樣品 和檢測樣品中A型或B型流感的存在或不存在；和（C)使神經(jīng)氨酸酶測試樣品的第二部分 與神經(jīng)氨酸酶分析物接觸，進而測定神經(jīng)氨酸酶測試樣品的神經(jīng)氨酸酶對測試化合物的敏 感性，所述測定包括：（i)獲得抑制值比率，其中比率包含相比于不存在一種或多種測試化 合物情況下神經(jīng)氨酸酶活性水平的存在一種或多種測試化合物情況下的神經(jīng)氨酸酶活性 水平，和（ii)比較抑制值與抑制闊值的比率，進而測定神經(jīng)氨酸酶活性對測試化合物的敏 感性；和（e)從經(jīng)測定抑制神經(jīng)氨酸酶活性的一種或多種測試化合物中選擇測試化合物。 在一些實施方式中，基質(zhì)包含凍干或W其他方式干燥的免疫分析緩沖劑。在一些實施方式 中，步驟（C)在相同容器中進行。在一些實施方式中，步驟（C)在包含多個室的容器中進行。
[0019] 在選擇用于流感病毒的治療的方法的一些實施方式中，抑制闊值通過檢測A型或 B型病毒確定。在一些實施方式中，如果檢測A型病毒，那么使用第一抑制闊值，且如果檢測 B型病毒，那么使用第二抑制闊值。在一些實施方式中，第一闊值比第二闊值低。
[0020] 在一些實施方式中，容器包括適于使用光電倍增管或微光電倍增管讀取的多孔條 帶或套筒。在一些實施方式中，光電倍增管微光電倍增管為便攜式的。在一些實施方式中， 光電倍增管在適合于初級護理醫(yī)師辦公室的便攜式讀取器中。在一些實施方式中，光電倍 增管表面為圓形且具有約6mm到9mm的直徑，或微光電倍增管為矩形且具有約1mm到3mm的尺寸。
[0021] 一些方法也包括選擇用于治療流感的測試化合物。
[0022] 在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析包括含信號傳導酶的雙酶分析。在一些實施 方式中，神經(jīng)氨酸酶活性產(chǎn)生用于信號傳導酶的底物。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析 包括N-乙酷基神經(jīng)氨酸和巧光素或其衍生物的綴合物。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶活 性產(chǎn)生用于信號傳導酶的抑制劑。在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶分析包括N-乙酷基神經(jīng) 氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的綴合物。在一些實施方式中，信號傳導酶包括巧光素酶。
[0023]在一些實施方式中，神經(jīng)氨酸酶活性水平使用光電倍增管測量。
[0024]在一些實施方式中，測試化合物為抗病毒藥物。在一些實施方式中，測試化合物 是選自W下的抗病毒藥物：奧司他韋（Oseltamivir)、扎那米韋狂anamivir)、拉那米韋 (Xanamivir)和帕拉米韋（Peramivir)。
[00巧]在一些實施方式中，免疫分析包含夾屯、分析。
[0026]在一些實施方式中，樣品獲自受試者。在一些實施方式中，受試者疑似患有流感。 在一些實施方式中，受試者為人類。在一些實施方式中，受試者樣品獲自受試者，且受試者 被建議服用選定測試化合物W治療流感。在一些實施方式中，受試者樣品獲自受試者，且受 試者被提供有選定測試化合物W治療流感。
[0027]-些實施方式包括檢測流感病毒的診斷系統(tǒng)，其包括：用于測定樣品中神經(jīng)氨酸 酶活性的套筒，其中套筒經(jīng)配置W將包含對于測定不相容的緩沖劑的樣品處理為包含對于 測定相容的緩沖劑的樣品；用于檢測樣品中A型或B型流感的測試物，其中測試物經(jīng)配置W 將包含對于檢測不相容的緩沖劑的樣品處理為包含對于檢測相容的緩沖劑的樣品；經(jīng)配置 W測量來自測試的信號的第一檢測器；和經(jīng)配置W測量來自套筒的信號的第二檢測器。
[0028]在一些實施方式中，套筒包括基質(zhì)室，所述基質(zhì)室包括含有對于測定相容的緩沖 劑的套筒基質(zhì)，和包含用于神經(jīng)氨酸酶活性測定的試劑的試劑室。在一些實施方式中，套筒 基質(zhì)包含交聯(lián)多糖。在一些實施方式中，套筒基質(zhì)選自葡聚糖凝膠和瓊脂糖。
[0029]在一些實施方式中，基質(zhì)室和套筒室流體連通，使得施用到基質(zhì)室的樣品從基質(zhì) 室流動到試劑室。在一些實施方式中，樣品通過選自重力、毛細作用和擴散的一種或多種力 在套筒中流動。
[0030]在一些實施方式中，套筒包含適于使用光電倍增管或微光電倍增管讀取的多孔套 筒。
[0031]在一些實施方式中，測試包括免疫分析。在一些實施方式中，免疫分析為夾屯、分 析。在一些實施方式中，測試包括含對于檢測相容的緩沖劑的基質(zhì)。在一些實施方式中，基 質(zhì)包含硝化纖維素。在一些實施方式中，對于檢測相容的緩沖劑經(jīng)凍干或干燥。
[0032]在一些實施方式中，第一檢測器包括光度計。在一些實施方式中，第一檢測器包括 反射率讀取器。在一些實施方式中，第二檢測器包括光電倍增管或微光電倍增管。在一些 實施方式中，裝置包括第一和第二檢測器。在一些實施方式中，第一和第二檢測器相同。
[0033]在一些實施方式中，裝置為便攜式的。在一些實施方式中，裝置為手持式的。
[0034]-些實施方式包括用于檢測流感病毒的試劑盒，其包括：用于測定樣品中的神經(jīng) 氨酸酶活性的套筒，其中套筒經(jīng)配置W將包含對測定不相容的緩沖劑的樣品處理為包含對 測定相容的緩沖劑的樣品；和用于檢測樣品中的A型或B型流感的測試物，其中測試物經(jīng)配 置W將包含對檢測不相容的緩沖劑的樣品處理為包含對檢測相容的緩沖劑的樣品。一些實 施方式包括經(jīng)配置W測量來自測試的信號的第一檢測器；和經(jīng)配置W測量來自套筒的信號 的第二檢測器。一些實施方式包括用于神經(jīng)氨酸酶活性分析的試劑。在一些實施方式中， 神經(jīng)氨酸酶活性分析試劑選自：巧光素酶，N-乙酷基神經(jīng)氨酸和巧光素或其衍生物、N-乙 酷基神經(jīng)氨酸和Ξ氣甲基酬或其衍生物的綴合物，和抗病毒藥物。在一些實施方式中，抗病 毒藥物選自：奧司他韋、扎那米韋、拉那米韋和帕拉米韋。一些實施方式包括用于免疫分析 的試劑。在一些實施方式中，免疫分析試劑選自：對A型流感抗原特異的抗體，和對B型流 感抗原特異的抗體。
[0035] -些實施方式包括用于雙酶流感神經(jīng)氨酸酶敏感性分析的經(jīng)遮蔽抑制劑化合物， 其具有式（I)結構：
[0036]
[0037] 其中辦、護和33各自獨立地為氨或(：15烷基；11為0、1、2或3;1?%-畑2)">"= 0)CF3;m為 0 或 1;X為-S做或-CH(R5) - ;R5 為-S(0),邸3;且Z為 0、1 或 2。
[0038] 在一些實施方式中，式（I)化合物選自：
[0039]
[0040]

【附圖說明】
[0041] 圖1描繪用于威利特（Veritor)系統(tǒng)（百克頓-迪金森公司度ectonDickinson)) 的免疫分析測試條帶和讀取器的實施方式。
[0042] 圖2描繪組合側流免疫分析和藥物易感性分析的工作流的實施方式。
[0043]圖3描繪測定藥物易感性分析中的信號比率的實施方式。
[0044] 圖4描繪經(jīng)遮蔽抑制劑的合成的實施方式。
[0045] 圖5描繪用于動態(tài)流神經(jīng)氨酸酶分析的套筒的實施方式。
[0046] 圖6為使用便攜式讀取器測量的巧光對照的相對光單位和濃度的圖示。
[0047] 圖7為神經(jīng)氨酸酶分析的相對光單位的圖示，且表明雙酶分析選擇用于治療的最 佳ΝΑ基抗病毒劑的能力。在實例中，瑞樂沙巧elenza)表現(xiàn)優(yōu)于特敏福（Tamiflu)。
[0048] 圖8為各種稀釋度的各種A型流感病毒的抑制值的圖示，且表明存在可用于辨別 流感A抗藥菌株與流感A藥物敏感菌株的相異抑制值，其不同于流感B菌株的值，且BD具 有在AST測試跟隨提供A/B分型的常規(guī)流感ID測試時在P0C環(huán)境中作出判斷的能力。
[0049] 圖9為各種稀釋度的各種B型流感病毒的抑制值的圖示，且表明存在可用于辨別 流感B抗藥菌株與流感B藥物敏感菌株的相異抑制值，其不同于流感A菌株的值，且BD具 有在AST測試跟隨提供A/B分型的常規(guī)流感ID測試時在P0C環(huán)境中作出判斷的能力。
[0050] 圖10為各種稀釋度的病毒混合物的抑制值的圖示，且表明本文所述技術在抗藥 菌株存在于混合培養(yǎng)物中時標記其存在的能力。甚至更顯著的為顯示標記具有pH敏感性 NA的高度抗藥性流感的能力。
[0051] 圖11顯示用于抗病毒易感性測試的雙酶級聯(lián)的實施方式中的示例性神經(jīng)氨酸酶 底物NANA-CF3 (經(jīng)遮蔽抑制劑）和Ξ氣酬（游離抑制劑）的化學結構。
[0052] 圖12描繪設及經(jīng)遮蔽和游離抑制劑的完整雙酶級聯(lián)的實施方式。
[0053] 圖13為兩種不同雙酶分析的圖示，且表明可W用雙酶檢測化學反應實現(xiàn)的敏感 性的范圍。
[0054]圖14描繪免疫分析側流測試條帶的實施