通過由混合細菌種群進行的氨化從有機材料提取氮的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明大體設及一種通過使用微生物的混合種群進行微生物發(fā)酵或培養(yǎng)的過程， 從有機原材料中制備氨和/或錠的新方法。
【背景技術】
[0002] 氨（N&)是世界上最廣泛制備的化合物之一。2010年全球產量達到131兆公噸 (2012年美國地質調查局）。大部分制備的氨用于化學肥料，W向農作物提供生長所需的 氮。氨還用于制造塑料、合成橡膠和樹脂、炸藥、W及許多其他化合物。
[0003] 氮循環(huán)是氮在其不同的化學形式之間轉化過程。氮在有機大分子中的礦化，即有 機氮轉化為錠或氨，被稱為氨化。有機氮W氨的形式釋放是氮循環(huán)的一部分，其通過氨化細 菌完成。
[0004] 氨化可用于從有機廢料中釋放氮。例如，W全文并入本文作為參考的序列號為 13/722, 228的美國專利申請公開了一種氨化方法。在該'228申請的方法中，培養(yǎng)基中的有 機材料與水解酶接觸，W制備含有水解或部分水解的有機材料、適用于微生物發(fā)酵或培養(yǎng) 的培養(yǎng)基。該氨化在存在至少一種能夠氨化的微生物的情況下進行。該微生物可屬于例如 氣單胞菌屬（Aeromonas)、巧樣酸桿菌屬（Citrobacter)、梭菌屬（Clostridium)和腸球菌 屬巧ntrococcus)。該方法中錠的產率達到約800mg/升。
[0005][0006]因此，本領域仍長期需要另外的經濟的方法來從有機材料（例如有機廢料）中制 備氨。

【發(fā)明內容】

[0007] 相應地，本申請?zhí)峁┮环N用于從有機材料中制備氨或錠的方法，該方法包括如下 步驟：
[0008] 在好氧或厭氧條件下，在能夠氨化的混合細菌種群的存在下，發(fā)酵包括有機材料 的液體培養(yǎng)基，其中該發(fā)酵在一定條件下進行充足的時間，產生包括氨或錠的發(fā)酵產物；
[0009] 其中有機材料包括適用于轉化為氨或錠的含氮化合物。優(yōu)選地，該含氮化合物為 胺類或蛋白質。
[0010] 在本發(fā)明的某些實施方式中，該方法在溫度為30至60攝氏度的范圍內進行。更 優(yōu)選地，該方法在溫度為40至55攝氏度，或40至50攝氏度的范圍內進行。
[0011] 在本發(fā)明的某些實施方式中，該方法在抑值為約5至約11的范圍內進行。更優(yōu) 選地，該方法在抑值為約6至約9的范圍內進行。
[0012] 在本發(fā)明的某些實施方式中，該發(fā)酵過程可在厭氧或好氧條件下，在適合的反應 室或反應容器中進行一段時間，并且在對有機材料的高效減少有效的溫度范圍中進行。
[0013] 優(yōu)選地，該過程采用混合細菌種群進行，該混合細菌種群包括與選自HI、Cl、PI、 S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FIl的混合細菌種群基本相似的混合細菌種群。相對于選自HI、 Cl、P1、S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FI1中的混合細菌種群，該基本相似的混合細菌種群優(yōu)選 相關系數為0. 80,更優(yōu)選地相關系數為0. 90,甚至更優(yōu)選地相關系數為0. 95。
[0014] 在某些實施方式中，該混合細菌種群與S1的混合細菌種群（CBS保藏號136063) 基本相似。相對于S1的混合細菌種群，與S1基本相似的混合細菌種群優(yōu)選相關系數為 0. 80,更優(yōu)選地相關系數為0. 90,甚至更優(yōu)選地相關系數為0. 95。
[0015] 在另外的實施方式中，混合細菌種群中至少一半的細胞包括Sporanaerobacter acetigenes和 / 或若干種梭菌（Clostridiumspp.)。
[0016] 在另一實施方式中，混合細菌種群包括50-95%的Sporanaerobacteracetigenes 和3-35%的若干梭菌。該Sporanaerobacteracetigenes和/或若干種梭菌的累計含量 為70 %或更多。優(yōu)選地，該混合細菌種群包括50-90 %的Sporanaerobacteracetigene和 5-15%的若干種梭菌。
[0017] 在另一實施方式中，該Sporanaerobacteracetigenes和/或若干種梭菌的累計 含量為85%或更多。在另外的實施方式中，該混合細菌種群包括至少90%屬于梭菌目的細 困。
[0018] 優(yōu)選地，該發(fā)明的方法還包括從發(fā)酵產物中機械地或通過沉淀回收氨或錠。該氨 或錠可選擇地通過下列步驟回收：
[0019] (a)分離固體和液體發(fā)酵產物；
[0020] 化）收集包括氨或錠水的液體發(fā)酵產物，或收集在發(fā)酵過程或分離步驟（a)期間 釋放的氣體混合物；W及
[0021] (C)回收氨或錠。
[0022]在根據本發(fā)明的方法中，有機材料優(yōu)選為下列中的一種或多種：肉骨粉（MBM)、動 物粉、動物副產品、屠宰場廢物、乳清、城市廢物、食品和發(fā)酵工業(yè)廢水及其組合。該食品工 業(yè)廢水為例如動物副產品、動物粉或食物廢物。
[0023] 在又一實施方式中，本發(fā)明包括混合細菌種群，該混合細菌種群與選自H1、C1、P1、 S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FI1的混合細菌種群基本相似。優(yōu)選地，該混合細菌種群與S1的 混合細菌種群基本相似。
【附圖說明】
[0024] 圖1表明了實施例1中通過混合細菌種群A1、C1、化、P1、S1，測定肉骨粉（"MBM") 蛋白氮氨化的最佳溫度范圍。運些結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即各個溫度下解化7 天后的氨化效率。誤差條表示兩次生物重復之間的標準差（standarddeviation)。由A1、 Cl、化和P1氨化的最佳溫度范圍為37至55°C，S1的溫度范圍為37至60°C。"RT"表示室 溫。
[0025] 圖2表明了實施例1中通過混合細菌種群A1、C1、H1、P1和S1，測定MBM蛋白氮氨 化的最佳抑范圍。運些結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即50°C解化7天后的氨化效率。 誤差條表示兩次生物重復之間的標準差。由A1、C1、H1、P1和S1氨化的最佳抑范圍為6至 9。"N"表示化合物中轉化為畑3的氮。
[0026] 圖3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G和3H表明了實施例2中通過混合細菌種群H1、C1、P1、 SI和Al，不同有機材料的氨化效率。誤差條表示兩次生物重復之間的標準差，其中每次生 物重復進行Ξ次技術重復。有機材料：圖3A為魚產品，圖3B為肉雞產品，圖3C為牛/豬產 品，圖3D為生物乙醇糊，圖3E為肉骨粉1，圖3F為肉骨粉2,圖3G為魚粉，圖3H為羽毛粉。 該結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即在50°C解化不同時間段后的氨化效率。S1種群很突 出，它有效地氨化圖3D和3G所示的材料，然而H1快速地氨化圖3C、3D和3E所示的材料。 總之，與未接種的對照物相比，所有五種種群的氨化效率都有所提高。運個效果在圖3C、3D、 3E和3F中示出的材料中尤其明顯，"d"表示天數。
[0027] 圖4表明實施例4中魚副產品培養(yǎng)基和雞副產品培養(yǎng)基在生物反應器內，在巧(TC 不含細菌接種體W及使用P1細菌種群的氨化。該誤差條顯示Ξ次重復的氨測量值的標準 差。
[002引圖5說明在實施例5中用于誘發(fā)來自兩個不同廠商（MBM1和MBM2)的未滅菌的肉 骨粉（"MBM")中混合種群的溫度范圍的測定。該結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即在 不同溫度下解化7天后的氨化效率。誤差條表示兩次生物重復之間的標準差，除了MBM1在 45°C重復4次，在55°C重復7次。MBM2種群在室溫（RT)和70°C之間能有效誘發(fā)，但是MBM1 在50°C獲得最佳的有效氮轉化。"RT"表示室溫。
[0029] 圖6表明在下文討論部分中屠宰場副產品的氨化過程的實施例。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明提供了一種通過混合細菌種群進行氨化從有機材料提取氮的方法。有機材 料可為任意富含蛋白質的有機材料，例如源自動物或植物。為了更清楚地了解本發(fā)明，對下 列術語進行定義。除非另外指出，下列的術語如表明的進行使用和限定。貫穿說明書全文 可對其他術語進行定義。除非另外指出，所有單稱詞還涵蓋該詞的復數、主動語態(tài)和過去式 的形式。
[0031] 術語"含氮化合物"指通過本發(fā)明的方法，適用于轉化為氨或錠的氮化合物，例 如有機氮，包括胺類、蛋白質等等。運種有機材料的例子包括含胺的材料，例如蛋白質材 料，例如肉骨粉（MBM)、屠宰場廢物、乳清、城市廢物、魚粉、食品工業(yè)廢水，例如動物和植 物副產品，包括但不限于肉骨粉、魚、羽毛W及甜菜根、豆類、水果、制糖業(yè)廢物。本文所用 的術語"MBM""肉骨粉"由第142/2011號歐盟委員會條例巧uropeanUnionCommission Regulation)限定："肉骨粉指根據附錄IV第III章中陳述的其中一種加工方法，從種類1 或種類2材料的加工中獲得的動物蛋白"。
[0032] 本文所用的術語"動物粉"為由動物材料（比如屠宰場廢物）制得的粉。在下文 的實施例中，"動物粉"為粉狀材料。制造該粉的一種過程是將屠宰場廢物的水分抽出（即 進行干燥），然后娠磨干燥的固體。
[003引"源自植物的材料"如下文所限定。"生物乙醇糊（bioethanolmask) " (Stl公司， 芬蘭）指源自生物乙醇生產的發(fā)酵廢物。"大麥塊化arleybriquette) "(Senson公司，芬 蘭）為麥芽汁生產的副產品，并且"大麥糊化arleymask)"(Senson公司，芬蘭）為大麥酶 生產的副產品。"小麥塊（Wheatbriquette)"(化op化ergies公司，德國）和"油菜餅（Rape cake) " (Mildola公司，芬蘭）為生產來喂給動物的材料。
[0034] 本文所用的術語"動物飼料"指制備為喂給動物的食物。
[0035] 術語"發(fā)酵"或"發(fā)酵過程"指有機分子作為電子供體和電子受體的過程。該過程 與呼吸不同，呼吸中，來自營養(yǎng)分子的電子供給至氧氣（有氧呼吸）或其他無機分子/離 子，比如硝酸鹽、硫酸鹽、二氧化碳或Ξ價鐵離子（無氧呼吸）。在發(fā)酵中，營養(yǎng)分子降解為 小的有機分子，比如揮發(fā)性脂肪酸和醇類。此外，術語"發(fā)酵"用于描述在封閉容器中的生 長培養(yǎng)基上的微生物生長，該容器例如生物反應器或發(fā)酵器。
[0036] 術語"氨"指為氣態(tài)形式或W非電離形式溶解于培養(yǎng)基中的化合物畑3,該培養(yǎng)基 例如液體培養(yǎng)基。術語"錠"指離子NH/，其為NH3在例如水溶液中的離子形式。在水溶液 中，錠和氨處于平衡，該平衡取決于溫度和抑值，例如溫度越高，抑值越大，W氨的形式的 比例越大。所W，除非另外指出，關于本發(fā)明方法和/或氨化微生物及其產品，本文中所指 的"氨"應該被理解為包括關于該化合物的畑3和NH/兩種形式。例如，將氨化微生物作為 "氨產生"或"錠產生"進行討論，理解為包括根據特定培養(yǎng)基中的NH3/NH4+平衡，制備NH3和 /或NH/。作為"氨產生"或"錠產生"的氨化微生物的討論理解為根據特定培養(yǎng)基中的畑3/ 畑/平衡，包括NH3和/或NH/的產生。
[0037] 術語"氨化"指有機大分子中的氮的礦化，即有機氮轉化為錠或氨。該氨化由細 菌氨化實現，其包含蛋白質酶法水解為氨基酸，W及通過去氨基和消除反應，氮釋放為氨/ 錠。氨基酸的碳鏈發(fā)酵為有機酸，同時釋放二氧化碳和氨。
[0038] 術語"統一形式"，可于本文中在從發(fā)酵產物或培養(yǎng)產物中回收錠和氨的上下文中 所使用，指錠離子轉化為另外的化學形式，比如非離子氨（N&)和/或任意已知含氮化合 物，例如由氨與硝酸、硫酸、鹽酸、憐酸或其它化合物分別反應形成的化合物。
[0039] 氨化混合細菌種群包括種群H1、C1、P1、S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FI1及其各種 變形，其將在下文中詳細描述。
[0040] 用苯酪-氯仿-異戊醇從細菌培養(yǎng)物提取獲得DNA，其中細胞已被珠磨破壞，在該 DNA上進行混合種群H1、C1、P1、S1和A1的細菌群落分析。種群在無菌MBM培養(yǎng)基[每升 水含180g肉骨粉（MBM)]或動物源材料中，在37°C、50°C或55°C下培養(yǎng)四天。如Dowd等 2008a和Wolcott等2009所述，研究測試實驗室（美國德克薩斯州盧博克市）通過標簽編 碼FLX擴增子焦憐酸測序化TEFA巧進行細菌16S基因檢測，W及細菌多樣性數據分析。引 物 28F<GAGTTTGATCNTGGCTCAG'（沈QIDN0:1)和 519R<GTNTTACNGCGGCKGCTG，（SEQID NO:2)用于擴增16S可變區(qū)Vl-3 (其中"N"為A、T/U、G或C，并且其中Κ為T/U或G)。
[0041] 細菌多樣性分析披露了細菌屬于35個不同的屬（表1)。在總共的53個結果中，33 個在種水平上一致，而20個在屬水平上一致。表2示出每個種群中主要的細菌屬和種。屬 于第6-8屬的細菌形成所有種群的大部分。若干種梭菌和Sporanaerobacteracetigenes 在所有種群中為主要的。在55°C下培養(yǎng)的SI中，若干種喜熱菌（Caloramatorspp.)與若 干種梭菌一樣常見。
[0042] 用方程式山由表1中所示數據計算