用于李斯特菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以及檢測李斯特菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于培養(yǎng)包括李斯特菌（Listeria?spp.）的微生物的方法的，包含非螯合鎂離子和除氧劑的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可以用于培養(yǎng)樣品以檢測樣品中細菌的存在。本發(fā)明還公開了包含用于補充培養(yǎng)基的無鎂螯合緩沖液和除氧劑的配方。
【專利說明】用于李斯特菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以及檢測李斯特菌的方

法【背景技術】
[0001]1.【技術領域】
[0002]本發(fā)明公開的主題涉及用于培養(yǎng)微生物和檢測微生物的培養(yǎng)基和方法。
[0003]2.相關文獻
[0004]美國專利申請N0.10\597909，用于李斯特菌(LISTERIA spp.)的選擇性生長培養(yǎng)基，申請日2005年2月12，，公開了包括氯化鋰和選擇試劑的成分。
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【發(fā)明內容】

[0020]在一個實施例中公開的培養(yǎng)基中，包含具有生物有效濃度的非螯合鎂離子和除氧劑。
[0021]在另一些的實施例中，所述除氧劑選自由丙酮酸鹽、過氧化氫、巰基乙酸鹽、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS組成的組。
[0022]在另一些實施例中，所述培養(yǎng)基進一步包含具有生物有效濃度的鋰鹽；或鐵(III)鹽；或鋰鹽和鐵(III)鹽。
[0023]在另一些實施例中，所述培養(yǎng)基進一步包含選擇劑。
[0024]在另一些實施例中，所述培養(yǎng)基進一步包含基本無鎂的螯合緩沖液。
[0025]在另一些實施例中，所述培養(yǎng)基用于培養(yǎng)李斯特菌(Listeria spp.)。
[0026]在另一些實施例中，
[0027]所述鐵(III)鹽的濃度大于約0.05g/L ；
[0028]所述鋰鹽以大于約0.lg/L的濃度存在；
[0029]所述鎂鹽以大于約0.lg/L的濃度存在；并且所述除氧劑以大于約0.lg/L的濃度存在。
[0030]在一些實施例中，所述培養(yǎng)基進一步包含選擇劑。
[0031]在一個具體實施例中公開了用于培養(yǎng)生物樣品的方法，所述方法包含:在包含具有生物有效濃度的非螯合鎂離子和除氧劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述生物樣品。
[0032]在所述方法的一些實施例中，所述培養(yǎng)基包含鋰鹽；或鐵(III)鹽；或鋰鹽和鐵(III)鹽。
[0033]在所述方法的另一些實施例中，所述培養(yǎng)基進一步包含選擇劑。
[0034]在所述方法的另一些實施例中，
[0035]所述鐵(III)鹽以大于約0.05g/L的濃度存在；
[0036]所述鋰鹽以大于約0.lg/L的濃度存在；
[0037]所述鎂鹽以大于約0.lg/L的濃度存在；并且
[0038]所述除氧劑以大于0.lg/L的濃度存在。
[0039]在一些具體實施例中，所述方法用于培養(yǎng)李斯特菌(Listeria spp.)。
[0040]在一個實施例中公開了一種用于檢測樣品中的細菌的方法，所述方法包含培養(yǎng)所述樣品的步驟，所述樣品中存在具有生物有效濃度的:a)非螯合鎂離子，和b)除氧劑。
[0041]在所述方法的一個實施例中，所述除氧劑選自由丙酮酸鹽、過氧化氫、巰基乙酸鹽、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS組成的組。
[0042]在所述方法的一個實施例中，所述培養(yǎng)在下列物質存在的情況下進行:
[0043]a)鋰鹽；或
[0044]b)鐵(III)鹽；或
[0045]c)鋰鹽和鐵(III)鹽。
[0046]在所述方法的一個實施例中，所述培養(yǎng)在選擇劑存在的情況下進行。
[0047]在所述方法的一個實施例中,所述細菌是李斯特菌(Listeria spp.)。
[0048]在一個實施例中公開了一種用于補充培養(yǎng)基的配方，所述配方包含無鎂螯合緩沖液和除氧劑。
[0049]在另一些實施例中，所述配方還包含具有生物有效濃度的:
[0050]a)鋰鹽；或
[0051]b)鐵(III)鹽；或
[0052]c)鋰鹽和鐵(III)鹽
[0053]在另一些實施例中，公開了用所述配方培養(yǎng)李斯特菌的用途。
[0054]在一個具體實施例中，公開了適于稀釋的用于制作液體培養(yǎng)基的粉末狀培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含具有生物有效濃度的非螯合鎂離子和除氧劑。
[0055]在所述粉末培養(yǎng)基的另一些實施例中，稀釋過的培養(yǎng)基進一步包含具有生物有效濃度的:
[0056]a)鋰鹽；或
[0057]b)鐵(III)鹽；或
[0058]c)鋰鹽和鐵(III)鹽。
[0059]在一個具體實施例中，公開了用于培養(yǎng)李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包括除氧劑和無鎂螯合緩沖液。
[0060]此處所述 主題的特征和益處將通過以下詳細描述的優(yōu)選實施例的詳細描述而變得更加明顯，如附圖所示。公開和請求保護的主題可在各方面進行修改，只要不脫離權利要求的范圍，都是可以實現的。因此，附圖和說明書實質上是用于解釋性的，而不是限制性的且所述主題的全部范圍記錄在權利要求書中。
[0061]優(yōu)選實施例的詳細說明[0062]術語
[0063]在本公開中，“包含”一詞被用在非限制性句子中表示緊接著該詞的內容被包括進來，但是沒有特別提及的內容不代表被排除了。能被理解的是在包含或可能包含特定特征或變量或參數的具體實施例中，一些實施例可能由或基本上由這些特征或變量或參數組成。采用不定冠詞“一種”限定的某種元素不排除多種該元素存在的可能，除非上下文明確限定一種和只有一種該兀素。
[0064]本公開中,通過端點表示的數值范圍包括此范圍內所有的數,包括所有完整的數，所有整數，所有的小數(例如，I到5包括1、1.5、2、2.75,3,3.80、4和5等)。
[0065]本公開中，單數形式“一個”和“所述”包括對復數的指代除非上下文內容明確限定指代其它的。因此，例如，包含“一種化合物”配方的表述包括表示兩種或以上化合物的混合物。
[0066]本公開中，“或者”一詞采用包括“和/或”的含義，除非上下文另有明確規(guī)定。
[0067]本公開中，除非另有指明，說明書和權利要求書中列出的用于表示數量或組成成分、特性測量值等的所有數值可在所有情況下理解為采用“大約” 一詞進行修飾后的意思。因此，除非根據上下文有相反的或必要的指示，本公開中列出的數值參數為基于所需特性的可變化的近似值，本領域技術人員利用本公開的內容并根據測量和定量的不準確性可試圖獲得所述特性。在不限制 等同原則適用于權利要求的范圍的情況下，每個數值參數應至少根據已報道的重要數值的數量以及利用普通的四舍五入方法進行分析。盡管本公開寬范圍中列出的數值范圍和參數為近似值，它們在具體實施例中所列的數值僅廣義地理解到一定程度，該程度與使本公開的有效性以及公開和請求保護的主題與現有技術的區(qū)別是一致的。
[0068]本公開中，術語“P0D”表示差異概率，且術語“dPOD”表示差異概率方面的差異。
[0069]本公開中，“靈敏度”或“靈敏度比率”的定義為:靈敏度比率=(Actero李斯特菌法得到的陽性環(huán)境樣品數/ 二代擴繁得到的陽性環(huán)境樣品數)X100%。
[0070]本公開中，“特異性”或“特異性比率”的定義為:特異性比率=(Actero李斯特菌法得到的陰性環(huán)境樣品數/ 二代擴繁得到的陰性環(huán)境樣品數)X100%。
[0071]本公開中，“方法一致性”的定義為:方法一致性=[1 -1 (Actero李斯特菌法得到的真陽性和真陰性檢測樣品數-參考方法得到的真陽性和真陰性檢測樣品數)/總樣品數
]X 100%O
[0072]本公開中，“精確性”的定義為:精確性[ActeiO李斯特菌法得到的陽性檢測樣品數/參考方法得到的陽性檢測樣品數]X 100%。
[0073]本公開中，“培養(yǎng)基”、“肉湯”、“培養(yǎng)液”等均涉及適于培養(yǎng)所需微生物(可能是細菌或微生物菌株或品種)的營養(yǎng)混合物。在特定的實施例中，培養(yǎng)基可能包含水、瓊脂、蛋白質、氨基酸、酪蛋白水解物、鹽、脂類、碳水化合物、鹽、礦物質和PH緩沖液的一種或多種以及可能含有提取物例如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨和麥芽提取物并可能包含LB培養(yǎng)基。在實施例中，培養(yǎng)基可能是簡單的、復雜的或限定的培養(yǎng)基并且可能是擴繁培養(yǎng)基并且可能以不同方式進行補充，這些方式為本領域技術人員所熟知。在實施例中，培養(yǎng)基可能包含MOPS緩沖液、鐵(III)鹽比如檸檬酸鐵，鎂鹽比如硫酸鎂，鋰鹽比如氯化鋰并且可能包含丙酮酸鹽。在實施例中，培養(yǎng)基可能包含或由本文所定義的任何核心培養(yǎng)基組成。在實施例中，培養(yǎng)基可能是簡單的、復雜的或限定的培養(yǎng)基并且可能是擴繁培養(yǎng)基并且可能以不同方式進行補充，這些方式為本領域技術人員所熟知。“Actero/李斯特菌”和“ALEM”肉湯、培養(yǎng)基、擴繁培養(yǎng)基等被用作基于實施例的培養(yǎng)基的一般用詞。
[0074]在實施例中，培養(yǎng)基含有可能是無鎂螯合緩沖液的pH緩沖液。在一個系列的實施例中，所述PH緩沖液是MOPS鈉鹽和MOPS游離酸的混合物，但是在替代實施例中一系列其他緩沖液如碳酸鹽和磷酸鹽溶液也是可用的并且本領域技術人員能夠輕易地選擇使用并獲得所需的培養(yǎng)基PH值。
[0075]在實施例中，培養(yǎng)基可能以粉末或濃縮物的形式被提供，通常也被稱為“粉末培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基粉末”、“培養(yǎng)基濃縮物”、“濃縮培養(yǎng)基”等，它包含多種成分并適于與定量的水結合提供具有所需濃度的特定成分的液體培養(yǎng)基。這樣的粉末培養(yǎng)基或濃縮培養(yǎng)基可能是完整的，這意味著只需在使用前將它溶于適量的水(一般是無菌水)。作為選擇，在實施例中另一種情況是，粉末或濃縮培養(yǎng)基可能是不完整的，這意味著需要添加額外的成分來獲得適于使用的完整的培養(yǎng)基。在實施例中，粉末或濃縮的培養(yǎng)基也包括濃縮的至少部分水合的培養(yǎng)基，它在溶解后形成用于培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基。除非文章另有要求，本文所用的“培養(yǎng)基”可以理解為不僅包括成分濃度適合培養(yǎng)細菌和微生物的最終培養(yǎng)基，還包括適于稀釋的粉末或濃縮培養(yǎng)基。
[0076]本公開中，“除氧劑”表示能去除或失活游離氧或氧自由基的化學制品。在特定的實施例中，除氧劑選自由丙酮酸鹽、過氧化氫、巰基乙酸鹽或化合物、L_(+)_半胱氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸、oxyrase?酶(Patel，1995),Na2S和FeS組成的組。在特定的實施例中，除氧劑是左旋的(L)或右旋的(D)形式的并且可能是外消旋形式的或這幾種的混合物。本領域技術人員能熟練選擇這些 試劑并基于所討論的實施例根據其生物兼容性對這些除氧劑進行選擇。在實施例中，當除氧劑或任何其他與本公開有關的試劑為鹽時，任何生物有效的和兼容的鹽都是可用的并且本領域技術人員能熟練的識別和避免使用不適合的鹽。在實施例中，鹽為鈉鹽或鉀鹽。
[0077]在本公開中，“丙酮酸鹽”表示和包括所有丙酮酸(也叫2-氧代丙酸)的所有鹽類和任何包含丙酮酸鹽陰離子的化合物和任何它們的生物有效異構體或替代物。在實施例中，丙酮酸鹽是丙酮酸鈉或丙酮酸鉀。本領域技術人員能熟練的識別和避免使用不具有生物有效性或不適合的鹽類，比如有毒性的鹽類。
[0078]本領域技術人員可以輕而易舉地意識到應當避免使用對目標細菌致命或有毒的鹽和其他化合物且本領域技術人員能夠很容易地識別這種鹽和化合物。
[0079]在本公開中，堿金屬為鋰、鈉、鉀、銣、鈣和鈁中的任何一種以及堿金屬鹽并且堿金屬鹽為前述中任何一種堿金屬的生物可接受的鹽類。在實施例中，鹽是可溶解的并且可能是有機或無機的，并且根據實施例可能是氯化物、磷酸鹽、硝酸鹽、磷酸氫鹽、丙酮酸鹽、醋酸鹽。
[0080]本公開中，動詞“緩沖”指以本領域技術人員顯而易見的方式使溶液的pH穩(wěn)定在預定范圍內，所述溶液可能是培養(yǎng)基。名詞“緩沖”表示適于穩(wěn)定溶液PH的化學藥品。
[0081]本公開中，“鹽”指可溶的鹽或在相應條件下基本或部分可溶的鹽。
[0082]本公開中，關于“生長”或“培養(yǎng)”樣品或微生物表示一個過程，即將樣品或微生物放置在適宜或基本適宜維持或促進生長或分化一種或多種目標微生物的條件下的過程。這些術語可以理解為包括一種情況，其中樣品被暴露于目的微生物是否真實存在或能被檢測到的相關條件下。
[0083]本公開中，“鹽”指任何生物相容的鹽，它是可溶的或基本可溶的或在適宜培養(yǎng)條件下的溶解程度能達到所需生物有效性。
[0084]本公開中，“無鎂螯合緩沖液”或“基本無鎂螯合緩沖液”表示基本不含來自溶液的螯合的或螯合溶解的鎂離子的緩沖液或者鎂離子含量未達到生物顯著程度的緩沖液。在特定實施例中，無鎂螯合緩沖液是或包含3-(N-嗎啉)丙磺酸，也指3-嗎啉代丙烷-1-磺酸、3-(N-嗎啉)丙磺酸、3-(N-嗎啉)propansulfonic酸、4-嗎啉丙磺酸和“M0PS”，或者無鎂螯合緩沖液是或包含MOPS鈉鹽和MOPS游離酸的混合物。在替代實施例中，可以利用無鎂螯合緩沖液生物可接受的范圍，且本領域技術人員容易識別和選擇該范圍。在某些實施例中，這種緩沖液可被替代或者是MOPS的化學修飾形式。類似地，“未螯合的”或“非螯合的”表示離子或化學成分在溶液中為基本游離狀態(tài)。
[0085]本公開中，“基礎”或“核心”培養(yǎng)基或肉湯指包含某些為本領域技術人員所熟知的基本需要的成分的部分培養(yǎng)液，并且它的具體組成是可以變動的只要仍然適合于支持任何目標微生物的生長。因此在實施例中，核心培養(yǎng)基包含鹽、緩沖液和蛋白提取物，并且在實施例中，核心培養(yǎng)基包含碳酸鹽或磷酸鹽或MOPS緩沖液或可能包含鈉鹽、鎂鹽和鈣鹽。在實施例中，I升核心培養(yǎng)基的配方如表1所不。然而，在替代實施例中，核心培養(yǎng)基包含水、瓊脂、蛋白質、氨基酸、酪蛋白水解物、鹽類、脂類、碳水化合物、鹽、礦物質和PH緩沖液中的一種或多種，并且在實施例中核心培養(yǎng)基包含提取物比如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨和麥芽提取物，并且在實施例中，培養(yǎng)基是或者包含LB培養(yǎng)基；低鹽LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%酵母提取物和0.5%NaCl )，SOB培養(yǎng)基(2%蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl、2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgSO4), SOC 培養(yǎng)基(2% 蛋白胨、0.5% 酵母提取物、IOmM NaCl,2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM Glucose)，超級肉湯(3.2%蛋白胨、2%酵母提取物和0.5%NaCl)，2xTY培養(yǎng)基(1.6%蛋白胨、1%酵母提取物和0.5%NaCl)，TB培養(yǎng)液(1.2%蛋白胨、2.4%酵母提取物、72mM K2HPO4,17mM KH2PO4和0.4%甘油)，LB米勒培養(yǎng)液或LB倫諾克斯培養(yǎng)液(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和l%NaCl)。
[0086]表1:基礎培養(yǎng)基的一般成分
[0087]
【權利要求】
1.培養(yǎng)基，包含具有生物有效濃度的: a)非螯合鎂離子；和 b)除氧劑。
2.根據權利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述除氧劑選自由丙酮酸鹽、過氧化氫、巰基乙酸鹽、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS組成的組。
3.權利要求1中的培養(yǎng)基，進一步包含具有生物有效濃度的: a)鋰鹽；或 b)鐵(III)鹽；或 c)鋰鹽和鐵(III)鹽。
4.根據權利要求3所述的培養(yǎng)基，進一步包含選擇劑。
5.根據權利要求1所述的培養(yǎng)基，進一步包含基本無鎂螯合緩沖液。
6.權利要求1的所述培養(yǎng)基用于培養(yǎng)李斯特菌(Listeriaspp.)。
7.根據權利要求2所述的培養(yǎng)基，其中 所述鐵(III)鹽以大于約0.05g/L的濃度存在； 所述鋰鹽以大于約0.lg/L的濃度存在； 所述鎂鹽以大于約0.lg/L的濃度存在； 所述除氧劑以大于約0.lg/L的濃度存在。
8.根據權利要求7所述的培養(yǎng)基，進一步包含選擇劑。
9.用于培養(yǎng)生物樣品的方法，所述方法包括在具有生物有效濃度的非螯合鎂離子和除氧劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述生物樣品。
10.根據權利要求9中所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含: a)鋰鹽；或 b)鐵(III)鹽；或 c)鋰鹽和鐵(III)鹽。
11.根據權利要求9所述的方法，所述培養(yǎng)基進一步包含選擇劑。
12.根據權利要求10所述的方法，其中 所述鐵(III)鹽以大于約0.05g/L的濃度存在； 所述鋰鹽以大于約0.lg/L的濃度存在； 所述鎂鹽以大于約0.lg/L的濃度存在； 所述除氧劑以大于約0.lg/L的濃度存在。
13.權利要求11所述的方法用于培養(yǎng)李斯特菌(Listeriaspp.)。
14.在樣品中檢測細菌的方法，所述方法包含在具有生物有效濃度的: a)非螯合鎂離子；和 b)除氧劑存在的情況下培養(yǎng)所述樣品的步驟。
15.根據權利要求14所述的培養(yǎng)基，其中所述除氧劑選自由丙酮酸鹽、過氧化氫、巰基乙酸鹽、半胱氨酸、oxyrase?、Na2S和FeS組成的組。
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述培養(yǎng)在以下成分存在的情況下發(fā)生: a)鋰鹽；或 b)鐵(III)鹽；或c)鋰鹽和鐵(III)鹽。
17.根據權利要求14所述的方法，其中所述培養(yǎng)在選擇劑存在的情況下進行。
18.根據權利要求14所述的方法，其中所述細菌是李斯特菌。
19.用于補充培養(yǎng)基的配方，所述配方包含無鎂離子螯合緩沖液和除氧劑。
20.根據權利要求18所述的配方，進一步包含具有生物有效濃度的: a)鋰鹽；或 b)鐵(III)鹽；或 c)鋰鹽和鐵(III)鹽。
21.權利要求18中的配方培養(yǎng)李斯特菌的用途。
22.適于稀釋以獲得包含具有生物有效量的非螯合鎂離子和除氧劑的液體培養(yǎng)基的粉末培養(yǎng)基。
23.根據權利要求21所述的粉末培養(yǎng)基，其中所述稀釋的培養(yǎng)基進一步包含具有生物有效量的: a)鋰鹽；或 b)鐵(III)鹽；或 c)鋰鹽和鐵(III)鹽 。
24.用于培養(yǎng)李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包含除氧劑和無鎂離子螯合緩沖液。
【文檔編號】C12N1/00GK103748211SQ201280034383
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年7月11日 優(yōu)先權日:2011年7月13日
【發(fā)明者】馬汀內茲·加布里耶拉, 克拉沃·戴維, 馬杜羅·萊拉 申請人:食品安全測試系統公司