專利名稱：：一種動物細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是一種動物細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法中，一般必須使用終濃度至少10體積％的動物血清，才能保證細(xì)胞的正常生長傳代。然而動物血清是成分不明確的復(fù)雜混合物。一方面動物血清含有例如，攜帶激素、礦物質(zhì)、微量元素、脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；細(xì)胞貼壁因子和擴(kuò)散因子等可以促進(jìn)細(xì)胞生長、穩(wěn)定解毒、維持培養(yǎng)基的pH值，并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但另一方面，動物血清存在很多問題例如，添加及補(bǔ)充過程中導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值變化大，存儲過程中易受其他微生物污染，低溫貯存解凍后易產(chǎn)生沉淀，不同批次差異大，成本高，以及難以從細(xì)胞下游產(chǎn)品中去除、安全性差等。因此存在動物細(xì)胞培養(yǎng)中盡量不用或少用動物血清的趨勢。現(xiàn)有技術(shù)一般通過額外添加胰島素、重組胰島素、人源轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、細(xì)胞因子、生長因子等重組蛋白和動物來源成分，來降低使用動物血清的量，例如CN1723277中公開了一種源自肌肉組織的祖細(xì)胞/干細(xì)胞的培養(yǎng)基組合物，該組合物中添加了胰島素、FGF型生長因子，通過使用這樣的培養(yǎng)基組合物的培養(yǎng)方法，可以降低人血清的使用量。但是重組蛋白和動物來源成分對生物制品(比如疫苗)的安全性有很大影響，比如重組蛋白和動物來源成分引起過敏反應(yīng)等。綜上，一種新的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，可以使用終濃度小于10體積％的動物血清，就能促進(jìn)動物細(xì)胞生長。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有動物細(xì)胞培養(yǎng)方法中必須使用高含量動物血清(比如，終濃度至少10體積°/。的動物血清)，才能促進(jìn)動物細(xì)胞生長、安全性差的缺點(diǎn)，提供一種新的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法使用低含量的動物血清濃度就能促進(jìn)動物細(xì)胞生長、安全性好。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在動物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將動物細(xì)胞培養(yǎng)基按照表1的組分和含量范圍進(jìn)行調(diào)整，則可僅使用低含量動物血清(終濃度1至小于10體積％)，就能達(dá)到同時(shí)使用重組蛋白、動物來源成分和低含量動物血清(終濃度1體積°/。至小于10體積％)、或者使用高含量動物血清的同樣的促進(jìn)細(xì)胞生長作用。本發(fā)明提供了一種動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括將動物細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有終濃度1至小于10體積％的動物血清，每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下表1所示的組分表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與現(xiàn)有的通過引入重組蛋白或動物來源組分來降低動物血清用量的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，由于本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，無需額外引入蛋白成分(例如重組蛋白、植物蛋白或動物來源組分如細(xì)胞因子等)，使用低含量動物血清就能達(dá)到與使用高含量動物血清持平甚至更好的促進(jìn)動物細(xì)胞生長的作用，因此本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法不產(chǎn)生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好且成本低。用本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞，不同批次差異小，成本低，利于分離細(xì)胞下游產(chǎn)品、安全性好，適于用作生產(chǎn)疫苗等生物制品的病毒宿主、表達(dá)載體等。圖1為實(shí)施例1的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)72小時(shí)的Vero細(xì)胞的照片；圖2為對比例1的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)72小時(shí)的Vero細(xì)胞的照片；圖3為對比例2的動物物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)72小時(shí)的Vero細(xì)胞的照片；圖4為對比例3的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)72小時(shí)的Vero細(xì)胞的照片；圖5為實(shí)施例2的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)72小時(shí)的CHO細(xì)胞的照片。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括將動物細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有終濃度1至小于10體積％的動物血清，每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下表1所示的組分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>優(yōu)選所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有終濃度1至小于5體積％的動物血清，每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下表2所示的組分<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>更優(yōu)選每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基還可以包括1-3毫克的亞油酸、1-3毫克的維生素D2、1-3毫克的維生素K3和2-10毫克的酚紅中的一種或幾種。其中，亞油酸、維生素D2、維生素K3可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的生長；酚紅作為pH值指示劑加入，可以通過目測隨時(shí)掌握細(xì)胞的生長情況。更優(yōu)選所述細(xì)胞干粉組合物還包括1.5-2毫克的亞油酸、1.5-2毫克的維生素D2、1.5-2毫克的維生素K3和3-5毫克的酚紅中的一種或幾種。制備本發(fā)明所用細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，可以將包括將動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物分散在載劑中，然后^t動物血清，過濾滅菌。所述載劑可以選自本領(lǐng)域用作培養(yǎng)細(xì)胞的各種載劑，優(yōu)選選自蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水和超純水中的一種或幾種，更優(yōu)選所述載劑為注射用水和/或超純水。所述載劑的用量為600000-1500000重量份，優(yōu)選為800000-1200000重量份，更優(yōu)選為1000000重量份。所述載劑的單位重量份與表1和表2中各個(gè)組分所釆用的單位重量份相同。所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉的制備方法上述培養(yǎng)基組分的動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物散在分散劑中，移除所得混合物中的分散劑。所述動物細(xì)胞培養(yǎng)基比如攪拌、超聲振蕩等。制備本發(fā)明所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物可以使用干法和濕法兩類方法。所謂干法指在干燥的條件下混合固體組分的粉末(比如利用球磨機(jī)球磨混合)。使用干法時(shí)，優(yōu)選首先按照構(gòu)成培養(yǎng)基干粉組合物的各個(gè)組分的性質(zhì)對它們分別干燥。比如將無水磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水石克酸鎂、氯化鈉、無水磷酸氬二鈉、無水磷酸二氬鉀可以在100-120°C，優(yōu)選100-105。C下干燥1-5小時(shí)；將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-月肅氨酸、L-絲氨酸、L一色氨酸、L一蘇氨酸、L一纈氨酸、L—酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽在30-80。C優(yōu)選35-50。C下干燥1-3小時(shí)；無水磷酸二氬鉀將四水合硝酸4丐、谷胱甘肽、七水石克酸亞鐵、七水合硫酸鋅、丙酮酸鈉放入真空干燥箱內(nèi)抽真空干燥10小時(shí)以上。所謂濕法指將可以形成動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物的固體組分與分散劑混合，然后移除所得混合物的分散劑。還可以將干法與濕法結(jié)合，即將一部分固體組分用濕法混合，移除分散劑后，用干法與其余部分的固體組分混合。所述分散劑可以選自本領(lǐng)域用于制備動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物的各種混合，一般對M劑沒有特別的要求，只要不引入新的影響細(xì)胞生長的離子、污染雜質(zhì)(如內(nèi)毒素、微生物等)，不改變該動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物溶于載劑后的適宜細(xì)胞生長的pH值范圍、在不破壞培養(yǎng)基組分的前提下容易去除即可。因此所述分散劑優(yōu)選選自蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水、超純水、能與水以任意比互溶的醇、堿性水溶液和酸性水溶液中的一種或幾種，其中所述堿性水溶液為氨水或者本發(fā)明所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物中出現(xiàn)的陽離子的堿的水溶液，所述酸性水溶液為本發(fā)明中所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物出現(xiàn)的酸根離子的酸的水溶液。所述能與水以任意比互溶的醇可以為乙醇、曱醇、丙醇中的一種或幾種。所述堿性水溶液優(yōu)選氫氧化鈉的水溶液、氫氧化鉀的水溶液、氫氧化釣的水溶液、氨水、堿性氨基酸的水溶液中的一種或幾種，最優(yōu)選氫氧化鈉的水溶液。所述酸性水溶液優(yōu)選鹽酸溶液、-琉酸的水溶液、硝酸的水溶液、有機(jī)酸(碳酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、丙酮酸、磷酸、酸性氨基酸)的水溶液中的一種或幾種，最優(yōu)選鹽酸的水溶液。本發(fā)明對所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物中各個(gè)組分加入到分散劑中的順序沒有特別的要求。此外，可以將各種組分分散在同一種分散劑中，也可以將不同組分分散在不同的分散劑中，然后混合得到的分散體。優(yōu)選后者，例如優(yōu)選將胸普、次黃噤呤分散于1-10重量％的氫氧化鈉的水溶液(氫氧化鈉的水溶液優(yōu)選用重蒸水配制)中，可以適當(dāng)加熱至60°C;將親脂性物質(zhì)(如維生素K3、維生素D2)先分散于低沸點(diǎn)親水小分子有機(jī)溶劑(如乙醇)中。對于所用培養(yǎng)基組合物中含量很少的組分(比如含量不超過10重量份的組分)，在制備時(shí)，可以先用分散劑配制該組分的高濃度液體分散體，然后按照最終培養(yǎng)基干粉組合物中該組分所需的定量以該高濃度液體分散體的形式使該組分與其他組分混合。所用分散劑的溫度不應(yīng)高于被分散組分的最低分解溫度。所述分散劑的用量沒有特別的限制，只要能使培養(yǎng)基干粉組合物的組分與分散劑形成均一穩(wěn)定的分散體即可；另外，在滿足前述條件的前提下，出于能耗的考慮，分散劑的用量越少越好。可以采用本領(lǐng)域常用的方法除去分散劑，比如干燥。所述干燥可以為加熱、真空干燥、真空冷凍干燥、干燥劑(如硅膠、氧化鋁凝膠、分子篩、活性炭、骨炭、木炭、活性白土、五氧化磷、生石灰、氯化鈣等)吸濕等。制備本發(fā)明所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基組合物還可以包括將上述動物細(xì)胞培養(yǎng)基組分和動物血清，分散在相同的載劑中，然后過濾滅菌；或者使所述組分和動物血清分別^t在不同載劑中，然后混合不同的M體，然后過濾滅菌。對于所述培養(yǎng)基組合物組分中含量很少的組分(比如含量不超過10重量份的組分)，在制備時(shí)，可以先用載劑配制該組分的高濃度液體分散體，然后按照最終液體培養(yǎng)基中組分所需的定量以該高濃度液體分散體的形式添加該組分。所用載劑的溫度不應(yīng)高于被分散組分的最低分解溫度。所述過濾滅菌的方法為本領(lǐng)域7>知，可以采用孔徑不大于0.22iam的濾菌膜，進(jìn)行一次或幾次過濾。所述動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物在載劑中的分散可以通過本領(lǐng)域常用的各種分歉方法實(shí)現(xiàn)，比如攪拌、超聲振蕩等。所述動物細(xì)胞培養(yǎng)基組合物中動物血清的終濃度可以為1體積％至小于10體積％，優(yōu)選為1體積％至5體積％,更優(yōu)選為3體積％至5體積％。所述動物血清可以是牛血清(如胎牛血清)、馬血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一種或幾種。由于本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，只涉及對所用動物細(xì)胞培養(yǎng)基的改進(jìn)，因此動物細(xì)胞培養(yǎng)的其它方面沒有特別的限制。例如，所述細(xì)胞的接種量可以為103-108個(gè)/毫升培養(yǎng)基，優(yōu)選為所述細(xì)胞的接種量為105-106個(gè)/毫升培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)的條件包括30-37。C的溫度濕度、90-98%的濕度和3-8體積％的二氧化碳，優(yōu)選包括35-37t:的溫度、92-96%的濕度和4-6體積％的二氧化碳。本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法對能夠培養(yǎng)的細(xì)胞沒有特別的限制，可以培養(yǎng)體細(xì)胞、生殖細(xì)胞，癌細(xì)胞、正常細(xì)胞以及經(jīng)過基因工程修飾的細(xì)胞。比如vero細(xì)胞、hela細(xì)胞(請發(fā)明人補(bǔ)充上述各種類型的典型細(xì)胞)。除非特別說明，本發(fā)明使用的各種試劑均可以商購，也可以采用本領(lǐng)域常用的方法制備。用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑，不僅純度要求高，優(yōu)選分析純，而且不能存在任何影響細(xì)胞正常生理活動的物質(zhì)，因此還需要符合醫(yī)藥制品的要求，優(yōu)選注射級原料藥。以下結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3及以下各表中固體組分的單位mg/L是指，以將該培養(yǎng)基干粉組合物與載劑混合所得最終液體培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，相對于每升最終液體培養(yǎng)基，在制備培養(yǎng)基時(shí)需要加入的固體物質(zhì)的毫克數(shù)。將表3所示的固體組分按照10升最終液體培養(yǎng)基的用量，用萬分之一天平——精確稱量混合后，再加入IO升蒸餾水，用上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司85-2型攪拌器攪拌2小時(shí)后，得到均勻分散體，使用FD-3A中型冷凍干燥機(jī)(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預(yù)冷溫度-45°C,緩慢升溫保持儀器內(nèi)真空度9Pa下冷凍干燥50小時(shí)，得到動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物。將上述制得的動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物11022.4毫克，溶于900ml超純水中，向所得混合物中加入30ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用0.20jum的濾菌膜過濾滅菌，即得培養(yǎng)液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到25cn^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種Vero細(xì)胞懸液，接種密度為5x10"田胞/ml。然后在37。C溫度條件、95%濕度條件及5體積％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)的照片見圖1。由圖l可以看出，被培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞的邊緣非常清晰，形態(tài)正常。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4所示的固體組分按照10升最終液體培養(yǎng)基的用量，用萬分之一分析天平稱取。其中，將次黃噤呤、胸苷溶于1000ml的lmol/LNaOH蒸餾水溶液中，得到A溶液；將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羥脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、抗壞血酸、氯化膽石威、D-泛酸铞、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡。多醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12溶于3000ml蒸餾水中得到B溶液；將維生素D2、亞油酸溶于10ml99%的乙醇得到C溶液；合并A溶液、B溶液、C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、無7jc磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水硫酸鎂、無水氯化鉤、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸、L-天門冬酰胺、四水合硝酸釣、谷胱甘肽、七水硫酸亞鐵、七水合石克酸鋅、丙酮酸鈉、酚紅，用蒸餾水定容至10000ml搖勻，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷凍干燥機(jī)(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預(yù)冷溫度-50°C,緩慢升溫保持真空度10Pa下冷凍干燥40小時(shí)，即得到動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物。將上述制得的動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物13294.6毫克，溶于900ml超純水中，向所得混合物中加入40ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用O.lOiam的濾菌膜過濾滅菌，即得培養(yǎng)液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到25ci^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種Vero細(xì)胞懸液，接種密度為5x10"田胞/ml。然后在37。C溫度條件、95%濕度條件及5體積％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5所示的固體組分按照10升最終液體培養(yǎng)基的用量，用萬分之一分析天平稱取。其中，將次黃嘌呤、胸苷，溶于1000ml的lmol/LNaOH蒸餾水溶液中，得到A溶液；將維生素K3、維生素D2、亞油酸溶于10ml99%乙醇溶液，得到B溶液；將抗壞血酸、氯化膽堿、D-泛酸鉤、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡噴醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12溶于1000ml蒸餾水中得到C溶液，合并A溶液、B溶液和C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖，用蒸餾水定容至10000ml搖勻，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷凍干燥機(jī)(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預(yù)冷溫度-40。C，緩慢升溫保持真空度10Pa下冷凍干燥30小時(shí)，得到凍干粉。將無水磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水硫酸鎂、氯化鈉、無7jC磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、無水氯化鈣于105。C干燥2小時(shí)，將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、酚紅于40。C下干燥1小時(shí)。將四7jc合硝酸鉤、六水合氯化鎂、谷胱甘肽、七水硫酸亞鐵、七水合碌b酸鋅、丙酮酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-天門冬酰胺、L-羥月甫氨酸放入真空干燥箱內(nèi)干燥20小時(shí)。將上述所有干燥后的組分以及凍千粉裝入球磨罐內(nèi)，球磨10小時(shí)，即得本發(fā)明動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物。將實(shí)施例3制得的動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物12316毫克，溶于900ml超純水中，向所得混合物中加入10ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用0.15jLim的濾菌膜過濾滅菌，即得培養(yǎng)液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到25cn^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種Vero細(xì)胞懸液，接種密度為5x10"田胞/ml。然后在36.5。C溫度條件、97%。濕度條件及5.1體積％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8。實(shí)施例4本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。將實(shí)施例3中制得的培養(yǎng)基干粉組合物123.64克，溶于9升蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至10升混勻，使用0.22jnm的濾菌膜過濾滅菌。向970ml所得動物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入30ml馬血清混合，使用0.15um的濾菌膜過濾滅菌，即得培養(yǎng)液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種Vero細(xì)胞懸液，接種密度為5x104細(xì)胞/1111。然后在37。C溫度條件、95%濕度條件及5體積％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8。實(shí)施例5本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表6所示的固體組分按照10升最終液體培養(yǎng)基的用量，用萬分之一分析天平稱取。其中，將次黃嘌呤、胸苷溶于1000ml的lmol/LNaOH蒸餾水溶液中，得到A溶液；將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L一亮氨酸、L一蛋氨酸、L一苯丙氨酸、L一月黹氨酸、L一羥月甫氨酸、L一絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、抗壞血酸、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡p多醇、核黃素、鹽酸石克胺、維生素B12溶于3000ml蒸餾水中得到B溶液；將維生素D2、亞油酸、維生素K3溶于10ml99。/。的乙醇得到C溶液；將L-酪氨酸分散于pH值為1的鹽酸蒸餾水溶液中得到D溶液，合并A溶液、B溶液、C溶液和D溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、無水磷酸二氬鈉、氯化鉀、無水^克酸鎂、無水氯化鈣、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氬鉀、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-天門冬酰胺、四水合硝酸鉀、谷胱甘肽、七水石克酸亞4失、七水合碌iJ吏鋅、丙酮酸鈉、酚紅，用蒸餾水定容至10000ml搖勻。將300ml小牛血清加入所得培養(yǎng)基混勻，將所得混合物使用0.22ym的濾菌膜過濾滅菌，得到10300ml含2.9%牛血清的本發(fā)明培養(yǎng)基組合物。取上述制得的培養(yǎng)基組合物1000ml直接使用，其中含有2.9體積％的小牛血清。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到25cn^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種CHO細(xì)胞懸液，接種密度為5x104田胞/ml。然后在37。C溫度條件、95%濕度條件及5體積％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)的照片見圖5。由圖5可以看出，被培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞的邊緣非常清晰，形態(tài)正常。對比例1本對比例用于說明現(xiàn)有的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表7為商品名199培養(yǎng)基的組分，按照IO升最終液體培養(yǎng)基的用量，用萬分之一分析天平稱取。將膽固醇、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素D2、維生素K3和吐溫80溶于0.1升乙醇中；將胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤加入含有0.5毫升氨水的1升重蒸水中，并60。C加熱至溶解；使葉酸和核黃素振蕩溶于2.5升重蒸水；將維生素H和鹽酸鳥嘌呤加入到2升0.075N的鹽酸溶液中，并50。C加熱至溶解；將三磷酸腺苷二鈉、腺苷酸、脫氧核糖、谷胱甘肽、D-核糖、D-泛酸鉀、維生素C、葉酸、氯化膽堿、i-肌醇、煙酸、煙酰胺、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡噴醇和鹽酸^^胺溶于200毫升重蒸水中；合并得到的五種溶液，然后加入D-葡萄糖，用雙蒸水定容至10升搖勻。使用FD-3A中型冷凍干燥機(jī)(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預(yù)冷溫度-50°C，緩慢升溫保持真空度8Pa下冷凍干燥24小時(shí)，得到凍干粉。將氯化鈉、氯化鉀、無水硫酸鎂、硫酸腺噤呤、九水合硝酸鐵、氯化4丐、乙酸鈉、無水磷酸二氫鈉在105。C烘箱中干燥2小時(shí)。將L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-羥脯氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-天門冬氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、酚紅用真空干燥箱抽真空干燥15小時(shí)。將上述所得凍干粉和干燥固體組分在球磨機(jī)中進(jìn)行連續(xù)IO小時(shí)混合，所得固體粉末即為現(xiàn)有的動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物，商品名MD500型199培養(yǎng)基。將上述制得的動物細(xì)胞培養(yǎng)基干粉組合物9513.11毫克，溶于850ml超純水中，向所得混合物中加入100ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用0.20lam的濾菌膜過濾滅菌，即得培養(yǎng)液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到25cr^細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種Vero細(xì)胞懸液，接種密度為5x10"田胞/ml。然后在37。C溫度條件、95%濕度條件及5%二氧化碳體積分?jǐn)?shù)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)的照片見圖2。由圖2可以看出，被培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞的邊緣清晰，形態(tài)正常。對比例2本對比例用于說明現(xiàn)有的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。采用CN1723277的實(shí)施例2記載的培養(yǎng)基[5%人血清+0-2(101^/1111)+胰島素(10jLig/ml)+PDGF(lng/ml)+EGF(10ng/ml)地塞米松(5x10-9]^1)+凝血酶(l單位)]，按照培養(yǎng)對比例l相同的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，記錄單位天數(shù)細(xì)胞覆蓋瓶底的面積以及細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)的照片見圖3。由圖3可以看出，被培養(yǎng)的細(xì)力包密度大，細(xì)胞的邊緣清晰，形態(tài)正常。對比例3本對比例用于說明現(xiàn)有的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。按照對比例1的方法制備培養(yǎng)液并培養(yǎng)細(xì)胞，不同的是，只加入30ml小牛血清。培養(yǎng)結(jié)果見后文表8，細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)的照片見圖4。從圖4可以看出，由于培養(yǎng)過程中使用的血清少，導(dǎo)致Vero細(xì)胞生長速度慢、密度低，細(xì)胞的邊緣不清晰，形態(tài)不正常。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從表8的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法使用低含量動物血清，可以達(dá)到與使用高含量動物血清持平甚至更好的促進(jìn)動物細(xì)胞生長的作用。由于采用本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，在動物細(xì)胞培養(yǎng)的整個(gè)過程中，在不影響細(xì)胞生長的前提下，血清的使用量可以顯著降低，從而使大規(guī)模生產(chǎn)的成本顯著降低。由于本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法無需額外引入蛋白成分(例如重組蛋白、植物蛋白或動物來源組分如細(xì)胞因子等)，因此不產(chǎn)生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好。權(quán)利要求1.一種動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括將動物細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有終濃度1至小于10體積％的動物血清，并且每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下表1所示的組分表1組分mg組分mgL-丙氨酸80-120四水合硝酸鈣30-80L-精氨酸鹽酸鹽180-210氯化鉀320-500L-天門冬氨酸5-30無水硫酸鎂40-80L-天門冬酰胺30-60氯化鈉6000-8000L-半胱氨酸鹽酸鹽10-30無水磷酸氫二鈉300-400L-谷氨酸100-150七水硫酸亞鐵0.1-1L-谷氨酰胺200-500七水合硫酸鋅0.2-3L-組氨酸鹽酸鹽20-50D-葡萄糖1000-3000L-羥脯氨酸2-15谷胱甘肽0.2-2L-異亮氨酸90-150丙酮酸鈉20-120L-亮氨酸10-70抗壞血酸1-10L-賴氨酸鹽酸鹽100-200氯化膽堿5-25L-蛋氨酸10-50D-泛酸鈣1-10L-苯丙氨酸10-50葉酸2-10L-脯氨酸20-60煙酰胺1-5L-絲氨酸20-60鹽酸吡哆醇1-10L-蘇氨酸60-100核黃素0.2-2L-色氨酸10-50鹽酸硫胺1-10L-纈氨酸30-70維生素B121-10L-酪氨酸30-80六水合氯化鎂40-100甘氨酸30-80次黃嘌呤1-10L-胱氨酸鹽酸鹽30-80胸苷0.1-2無水氯化鈣30-80無水磷酸二氫鉀20-100無水磷酸二氫鈉30-802.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基含有終濃度1至小于5體積％的動物血清，每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括下表2所示的組分表2<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，每升所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包括1-3毫克的亞油酸、l-3毫克的維生素D2、1-3毫克的維生素K3和2-10毫克的酚紅中的一種或幾種。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述動物血清選自牛血清、馬血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一種或幾種。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述細(xì)胞的接種量為103-108個(gè)/毫升培養(yǎng)基。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述細(xì)胞的接種量為105-106個(gè)/毫升培養(yǎng)基。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)的條件包括30-37。C的溫度濕度、90-98%的濕度和3-8體積°/。的二氧化碳。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)的條件包括35-37。C的溫度、92-96%的濕度和4-6體積％的二氧化碳。全文摘要本發(fā)明提供了一種動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，無需額外引入動物血清外的蛋白成分(例如重組蛋白、植物蛋白或動物來源組分如細(xì)胞因子等)，通過使用低含量動物血清就能達(dá)到與使用高含量動物血清持平甚至更好的促進(jìn)動物細(xì)胞生長的作用，因此本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法不產(chǎn)生由所述動物血清外的蛋白成分伴隨的副作用，安全性好且成本低。此外，由于本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法動物血清用量少，用本發(fā)明的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞，不同批次差異小，成本低，利于分離細(xì)胞下游產(chǎn)品、安全性好，適于用作生產(chǎn)疫苗等生物制品的病毒宿主、表達(dá)載體等。文檔編號C12N5/06GK101386837SQ200710121710公開日2009年3月18日申請日期2007年9月12日優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日發(fā)明者韌張,陳文慶申請人:北京天昕和生物科技有限公司