體外循環(huán)灌流構(gòu)建組織工程肝的生物反應(yīng)器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程和生物制造領(lǐng)域，涉及(但不局限于)肝臟組織三維培養(yǎng)構(gòu)建組織工程肝臟的生物反應(yīng)器?？梢詫?shí)現(xiàn)組織工程肝臟體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞種植、組織培養(yǎng)階段的灌流和體外循環(huán)，模擬生理?xiàng)l件下的血流循環(huán)，主要參數(shù)可以調(diào)節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟是人體重要的解毒和消化器官，肝炎、肝硬化、重癥肝衰竭等終末期肝病已嚴(yán)重影響了人們的生存質(zhì)量，成為全世界死亡率最高的疾病之一。目前，肝移植是公認(rèn)的唯一有效的治療方法。僅中國，約有30萬終末期肝病患者等待肝移植手術(shù)，而能夠接受肝移植手術(shù)治療的患者僅占45%。全球范圍內(nèi)供肝短缺形勢(shì)嚴(yán)峻，絕大部分患者因無法等到供肝而死亡。體外構(gòu)建組織工程肝臟成為解決供肝缺乏的途徑之一。
[0003]組織工程學(xué)是合運(yùn)用生物學(xué)和工程學(xué)的基本原理、基本理論、基本技術(shù)和方法，研宄如何在體外條件下構(gòu)建有生物活性的組織器官，用以替代病損的組織器官的學(xué)科。組織工程肝臟是該領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)之一。構(gòu)建理想的組織工程化人工肝臟，需要研宄三個(gè)關(guān)鍵性的問題:理想的種子細(xì)胞來源、支架材料和能夠?yàn)榧?xì)胞支架復(fù)合物提供接近生理環(huán)境的生物反應(yīng)器。
[0004]肝組織生物反應(yīng)器的發(fā)展過程中，先后出現(xiàn)了平板型生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)瓶型生物反應(yīng)器、中空纖維型生物反應(yīng)器、灌流床支架型生物反應(yīng)器(Basak E.Uygun, GavriellePrice,Nima SaeidijMaria-Louisa Izamisj Tim Berendsenj Martin YarmushjKorkutUygun.Decellularizat1n and Recellularizat1n of Whole Livers.J.Vis.Exp.2011, (48):e2394)、肝細(xì)胞包裹/懸浮型生物反應(yīng)器。由于上述生物反應(yīng)器都沒有解決供氧和細(xì)胞在三維支架內(nèi)生長(zhǎng)的問題，使它們的使用受到限制。目前這些生物反應(yīng)器可以短時(shí)間內(nèi)部分替代衰竭肝臟，但它不能完全替代肝臟功能，也不能培養(yǎng)出真正的組織工程肝臟(Yu CB, Pan XP, Li LJ.2009.Progress in b1reactors of b1artificiallivers.Hepatobiliary Pancreat Dis Int 8:134-140.)。
[0005]因此，在體外構(gòu)建組織工程人工肝生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)考慮到:灌流效果足夠保證細(xì)胞在三維支架中的種植深度，提供模擬體內(nèi)條件的持續(xù)灌流，并給細(xì)胞提供模擬體內(nèi)的生物、力學(xué)環(huán)境和足夠的營養(yǎng)交換。
[0006]本發(fā)明提供了模擬生理?xiàng)l件下的組織培養(yǎng)環(huán)境，并給細(xì)胞實(shí)施可調(diào)節(jié)的靜水壓力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)可以三維培養(yǎng)肝臟組織構(gòu)建組織工程肝臟的生物反應(yīng)器，用于干細(xì)胞分化的體外研宄、組織工程肝臟的體外構(gòu)建，以實(shí)現(xiàn)生物人工肝替代人體供肝的理想狀態(tài)。
[0008]該生物反應(yīng)器包括:體外循環(huán)灌流系統(tǒng)，含封閉的體外循環(huán)管道系統(tǒng)、組織灌流發(fā)生器、灌流液混懸更新裝置；管道內(nèi)壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，含壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、電腦控制模塊、受電腦控制調(diào)節(jié)的灌流裝置(蠕動(dòng)泵)；肝臟組織培養(yǎng)體系，含肝組織培養(yǎng)的無菌培養(yǎng)室、供培養(yǎng)肝組織的三維支架。
[0009]培養(yǎng)液儲(chǔ)槽中的培養(yǎng)液通過封閉的管道系統(tǒng)，經(jīng)蠕動(dòng)泵進(jìn)入肝臟培養(yǎng)三維支架，為支架內(nèi)細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，三維支架機(jī)器內(nèi)部的細(xì)胞在無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)液在支架內(nèi)循環(huán)后，經(jīng)支架流出口進(jìn)入封閉的管道系統(tǒng)，在蠕動(dòng)泵的控制下進(jìn)入培養(yǎng)液儲(chǔ)槽。封閉的管道系統(tǒng)內(nèi)有壓力感受器可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)管道內(nèi)壓力，并將壓力信息傳入中控電腦，電腦根據(jù)壓力和預(yù)先設(shè)定的壓力需求，調(diào)節(jié)兩個(gè)蠕動(dòng)泵的速度，從而維持整個(gè)管道內(nèi)的靜水壓。
[0010]培養(yǎng)液儲(chǔ)槽另有無菌進(jìn)液口和氣體過濾裝置，以滿足培養(yǎng)液加氧、加二氧化碳、管道系統(tǒng)消除氣泡和更換培養(yǎng)液的需求。
[0011]上述方案中，整個(gè)管道系統(tǒng)為密閉系統(tǒng)，流入管和流出管均采用無菌的生物相容性材料。肝組織培養(yǎng)室也采用無菌生物相容性材料。
[0012]本發(fā)明另一技術(shù)特征是，管道內(nèi)有時(shí)是壓力傳感器，蠕動(dòng)泵的泵速流量均實(shí)時(shí)通過電腦中控系統(tǒng)監(jiān)控調(diào)節(jié)。
[0013]本發(fā)明與已存在的肝臟生物反應(yīng)器相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0014]第一，通過培養(yǎng)液在整個(gè)支架內(nèi)完全循環(huán)，可以將細(xì)胞懸液帶到整個(gè)支架的各個(gè)角落，從而提高支架上細(xì)胞的種植密度，模擬真實(shí)肝臟內(nèi)細(xì)胞的分布。
[0015]第二，通過培養(yǎng)液在整個(gè)支架內(nèi)完全循環(huán)，可為支架內(nèi)所有細(xì)胞提供有效的營養(yǎng)供給、氣體交換，提供支架內(nèi)部細(xì)胞的存活率。
[0016]第三，通過蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)脈動(dòng)刺激，模擬體內(nèi)血流。
[0017]第四，通過管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)器、電腦中控系統(tǒng)、蠕動(dòng)泵負(fù)反饋調(diào)節(jié)，有效實(shí)現(xiàn)模擬生理?xiàng)l件下肝臟內(nèi)靜水壓。以及靜水壓的調(diào)節(jié)，利于體外肝再生的機(jī)制研宄。
[0018]第五，電腦中控系統(tǒng)可通過軟件調(diào)節(jié)，適應(yīng)不同的研宄需求和組織構(gòu)建需求。
【附圖說明】
[0019]圖1為體外循環(huán)灌流構(gòu)建組織工程肝的生物反應(yīng)器的原理結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明從支架材料細(xì)胞化和組織培養(yǎng)兩個(gè)階段，為體外構(gòu)建組織工程肝臟提供技術(shù)方案。
[0021]支架材料細(xì)胞化的階段，即細(xì)胞種植階段。將培養(yǎng)液儲(chǔ)槽和組織培養(yǎng)室置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液儲(chǔ)槽中的細(xì)胞懸液通過持續(xù)灌流，或兩個(gè)管道交替流向輸入，使細(xì)胞得以分布到支架的各個(gè)部位，提高細(xì)胞在支架材料上的附著率。細(xì)胞灌注時(shí)間及濃度可視需要而定。靜置培養(yǎng)一段時(shí)間后，可進(jìn)行組織灌流培養(yǎng)。
[0022]在組織培養(yǎng)階段，如附圖所示，培養(yǎng)液儲(chǔ)槽和組織培養(yǎng)室亦置于二氧化碳培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)液儲(chǔ)槽中的培養(yǎng)液通過封閉的管道系統(tǒng)，經(jīng)蠕動(dòng)泵進(jìn)入肝臟培養(yǎng)三維支架，為支架內(nèi)細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，三維支架機(jī)器內(nèi)部的細(xì)胞在無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)液在支架內(nèi)循環(huán)后，經(jīng)支架流出口進(jìn)入封閉的管道系統(tǒng)，在蠕動(dòng)泵的控制下進(jìn)入培養(yǎng)液儲(chǔ)槽。封閉的管道系統(tǒng)內(nèi)有壓力感受器可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)管道內(nèi)壓力，并將壓力信息傳入中控電腦，電腦根據(jù)壓力和預(yù)先設(shè)定的壓力需求，調(diào)節(jié)兩個(gè)蠕動(dòng)泵的速度，從而維持整個(gè)管道內(nèi)的靜水壓。
[0023]實(shí)施例1:干細(xì)胞在全肝脫細(xì)胞支架培養(yǎng)
[0024]無菌條件下將，大鼠全肝脫細(xì)胞后，得到具有肝臟網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及脈管系統(tǒng)的生物支架。支架入口為肝門脈，出口為肝靜脈，將兩個(gè)口分別連接于生物反應(yīng)器的入口管和出口管。將生物反應(yīng)器的入口管和出口管的另一端與培養(yǎng)液儲(chǔ)槽連接，培養(yǎng)液儲(chǔ)槽中再無菌條件下預(yù)置106/ml干細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)液儲(chǔ)槽、培養(yǎng)液混懸器和肝組織培養(yǎng)室置于二氧化碳孵箱內(nèi)，通過蠕動(dòng)泵將細(xì)胞懸液緩慢泵入全肝脫細(xì)胞支架內(nèi)，灌注I個(gè)循環(huán)。靜置一天后，將培養(yǎng)液儲(chǔ)槽內(nèi)液體更換為組織培養(yǎng)液，進(jìn)行持續(xù)灌流培養(yǎng)。一周后，觀察培養(yǎng)效果。
[0025]實(shí)施例2:培養(yǎng)液對(duì)肝臟生長(zhǎng)的影響
[0026]無菌條件下切除大鼠肝，將表面及管道內(nèi)紅細(xì)胞沖洗干凈、測(cè)量肝臟體積大小后，置于肝組織培養(yǎng)室內(nèi)，將肝門靜脈連接生物反應(yīng)器入口管，肝靜脈連接出口管，將生物反應(yīng)器的入口管和出口管的另一端與培養(yǎng)液儲(chǔ)槽連接。將培養(yǎng)液儲(chǔ)槽、培養(yǎng)液混懸器和肝組織培養(yǎng)室置于二氧化碳孵箱內(nèi)，通過蠕動(dòng)泵將肝臟培養(yǎng)液持續(xù)灌流入大鼠肝內(nèi)，維持肝門靜脈入口處壓力為1cm水柱(約為生理狀態(tài)壓力)，養(yǎng)兩周后測(cè)量肝臟大小，觀察培養(yǎng)液對(duì)肝臟生長(zhǎng)的影響。
[0027]實(shí)施例3:不同靜水壓力對(duì)肝再生的影響
[0028]無菌條件下切除大鼠肝，將表面及管道內(nèi)紅細(xì)胞沖洗干凈、測(cè)量肝臟體積大小后，置于肝組織培養(yǎng)室內(nèi)，將肝門靜脈連接生物反應(yīng)器入口管，肝靜脈連接出口管，將生物反應(yīng)器的入口管和出口管的另一端與培養(yǎng)液儲(chǔ)槽連接。將培養(yǎng)液儲(chǔ)槽、培養(yǎng)液混懸器和肝組織培養(yǎng)室置于二氧化碳孵箱內(nèi)，通過蠕動(dòng)泵將肝臟培養(yǎng)液持續(xù)灌流入大鼠肝內(nèi)，維持肝門靜脈入口處壓力為15cm水柱培養(yǎng)(高于生理狀態(tài))，培養(yǎng)兩周后測(cè)量肝臟大小，觀察高靜水壓對(duì)肝臟生長(zhǎng)的影響。
[0029]持續(xù)灌流循環(huán)是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的關(guān)鍵因素。本發(fā)明共培養(yǎng)裝置的特點(diǎn)是可為三維支架內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞提供持續(xù)的模擬生理?xiàng)l件的體外循環(huán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)提供營養(yǎng)、氣體交換的作用，為細(xì)胞共培養(yǎng)提供一種可調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)環(huán)境，為探索組織培養(yǎng)技術(shù)提供一種方法。
[0030]以上所述僅為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種涉及(但不限于)肝臟組織三維培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，其特征在于培養(yǎng)肝組織的同時(shí)模擬體內(nèi)血流情況，使肝內(nèi)形成所需的、可調(diào)節(jié)靜水壓。
2.該生物反應(yīng)器包括:封閉的體外循環(huán)管道系統(tǒng)(3)、組織灌流發(fā)生器(4)、培養(yǎng)液混懸更新裝置(I);壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(7)、電腦控制模塊(8)、受電腦控制調(diào)節(jié)的灌流裝置(蠕動(dòng)泵(5) (6));肝組織培養(yǎng)的無菌培養(yǎng)室(9)、供培養(yǎng)肝組織的三維支架(10)。
3.如權(quán)利要求1所述，培養(yǎng)肝組織脈管系統(tǒng)內(nèi)壓力由灌流系統(tǒng)提供，管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)傳感器(7)將管道內(nèi)壓力信號(hào)實(shí)時(shí)傳入中控系統(tǒng)(8)，中控系統(tǒng)依此數(shù)據(jù)自動(dòng)調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵，從而控制灌流速度和灌流量，從而模擬體內(nèi)血管搏動(dòng)及動(dòng)脈壓。
4.如權(quán)利要求2所述，灌流液混懸更新裝置包括混懸搖床、三通管進(jìn)行液體更換和新液體添加、0.22 μπι濾膜保證組織培養(yǎng)液體的酸堿平衡和培養(yǎng)液供氧問題。
5.如權(quán)利要求2所述，肝組織培養(yǎng)的無菌培養(yǎng)室由無菌的生物相容性材料制做。
6.如權(quán)利要求2所述，細(xì)胞生長(zhǎng)在供培養(yǎng)肝組織的三維支架內(nèi)部，該三維支架具有模擬肝局部解剖結(jié)構(gòu)的脈管系統(tǒng)，有可與灌流系統(tǒng)連接的進(jìn)出管道。該三維支架可以是硬材料也可是彈性材料。
7.如權(quán)利要求4、5、6所述裝置需在二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種組織三維培養(yǎng)的裝置和方法。該生物反應(yīng)器包括體外灌流循環(huán)系統(tǒng)、壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)和灌流量控制模塊、肝組織培養(yǎng)模塊。體外灌流循環(huán)系統(tǒng)包括封閉的管道系統(tǒng)、組織灌注發(fā)生器及灌流液混懸更新裝置。壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、電腦控制模塊和系統(tǒng)受電腦控制調(diào)節(jié)的灌流裝置。肝組織培養(yǎng)模塊包括無菌培養(yǎng)室和組織培養(yǎng)三維支架的構(gòu)建。本發(fā)明可模擬體內(nèi)環(huán)境，為體外培養(yǎng)組織工程器官提供了一種裝置，為三維條件下干細(xì)胞分化和細(xì)胞生長(zhǎng)的研究提供一種工具。
【IPC分類】C12M1-36, C12M1-04, C12M1-34, C12M3-00, C12M1-12
【公開號(hào)】CN104611225
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510084465
【發(fā)明人】張蕾, 張濤
【申請(qǐng)人】昆明市第一人民醫(yī)院
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月16日