專利名稱：用于pcr快速反應的芯片結(jié)構的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，屬于PCR技術領域。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(PCR)是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。PCR技術原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成①模板 DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合，為下輪反應做準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至50-65°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。PCR技術已經(jīng)是生命科學和醫(yī)學領域發(fā)展中一個重要發(fā)展方向，成為一種廣泛應用的檢測手段與技術方法，在生命科學、醫(yī)學工程、 遺傳科學、法醫(yī)鑒定等方面具有廣闊的應用價值。
PCR擴增的關鍵是快速而準確的控制溫度循環(huán)，PCR擴增循環(huán)中的每一步都有最短的有效反應時間，溫度變化過程太長不僅浪費時間，且隨著時間的延長Taq DNA聚合酶的活性而逐漸下降，因此較長的反應過程對PCR是很不利的。因此直接提供PCR反應效率的思路就是減少PCR混合液的體積，可以縮短循環(huán)時間，提高擴增產(chǎn)物的含量。靜態(tài)腔式PCR 芯片芯片具有如下優(yōu)點
1)溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，可以達到很高的升/降溫速率(甚至可高達 60-900C / S)，反應時間成倍縮短；2)反應液體積減小，反應試劑的消耗量降低，反應液溫度的均勻性提高，擴增的特異性增強，既節(jié)省了成本，又提高了效率；3)可選用導熱系數(shù)高的材料，提升熱傳遞速率，大大降低反應液溫度平衡的時間和循環(huán)所需要耗費時間，溫度能夠更快的穩(wěn)定和檢測。
靜態(tài)微腔室型PCR芯片結(jié)構比較簡單，一般使用微加工技術加工出反應的微腔室 (微腔室有可以封閉的流體進出口)，用于加熱與溫度傳感的電極以及冷卻與散熱裝置。其基本原理和傳統(tǒng)PCR儀器相近，是對注入反應腔內(nèi)的PCR反應混合物進行直接的升降溫控制，實現(xiàn)溫度循環(huán)。雖然結(jié)構簡單，但是由于微觀尺度效應，熱慣性小，PCR反應液在微腔室中可以很快地進行升降溫工作，熱傳感器也能及時反饋并對溫度進行控制。由于微腔室芯片結(jié)構簡單，也意味著能夠在一塊芯片上加工多個反應池，同時進行多個PCR反應。微腔室通過微機械加工的方法制作得到。這些特點都在實際使用中具有很大的優(yōu)勢。靜態(tài)微腔室型PCR芯片顯著地降低了混合液的消耗量，但溫控系統(tǒng)及結(jié)構設計直接決定加熱冷卻速度，仍舊對溫度循環(huán)與穩(wěn)定起著決定性作用，一般來說與理想的升降溫反應速度仍舊有一定差距。一般加熱與散熱裝置需要集成加工在芯片上，這使得加工成本也有所上升，且傳統(tǒng)靜態(tài)腔室PCR芯片的試劑準備、反應后試劑提取依舊需要有外部轉(zhuǎn)移過程，可能導致試劑的浪費與轉(zhuǎn)移污染的出現(xiàn)。因此，實現(xiàn)PCR的獨立多溫區(qū)循環(huán)成為靜態(tài)腔PCR芯片發(fā)展的方向之一。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種用于PCR快速反應的芯片結(jié)構。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，特點是包括至上而下依次設置的蓋片、介質(zhì)層、PCR芯片和外部加熱結(jié)構，所述蓋片上加工有通孔，所述PCR芯片上設有微腔孔，PCR芯片上覆介質(zhì)層，介質(zhì)層通過蓋片上的通孔呈現(xiàn)負壓吸附蓋片，PCR芯片的下底面與外部加熱結(jié)構緊密接觸。
進一步地，上述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其中，所述PCR芯片的厚度為 100 μ m 10mm，PCR芯片上微腔孔的體積為O. 01 μ L 10mL。
更進一步地，上述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其中，所述PCR芯片為石英玻璃、三氧化二鋁、石英、玻璃、硅、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚砜、聚偏氟乙烯中 的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合；所述任意至少兩種材料通過鍵合、粘接或超聲波焊接方式相接復合。
更進一步地，上述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其中，所述蓋片為聚碳酸酯、 聚甲基丙烯酸甲脂、玻璃、石英玻璃、聚二甲基硅氧烷、硅膠材質(zhì)中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
再進一步地，上述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其中，所述介質(zhì)層為環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物、聚對二甲苯、聚酰亞胺、 硅橡膠、聚丙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合；所述介質(zhì)層的厚度為lOnnTlOmm。
再進一步地，上述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其中，所述外部加熱結(jié)構包含薄膜加熱片以及與其粘接的導熱材料；所述導熱材料為金屬、金屬氧化物、硅、碳化硅、石墨、導熱硅酮樹脂、導熱塑料中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
再進一步地，上述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其中，所述微腔孔的形狀為圓柱狀或者圓臺狀。
本發(fā)明技術方案突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步主要體現(xiàn)在本發(fā)明易于快速實現(xiàn)PCR擴增，顯著提高生物化學反應的速度；芯片的微環(huán)境的熱容量小，可進行高速的升降溫控制，并能精確的檢測與控制區(qū)域的溫度；溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，可達到很高的升/降溫速率，反應時間大大縮短；反應液體積減小，反應液溫度的均勻性提高，擴增的特異性增強，既節(jié)省了成本又提高了效率；芯片易于集成和功能化，快速便捷的實現(xiàn)擴增，便于批量化低成本生產(chǎn)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明技術方案作進一步說明圖1:本發(fā)明的截面結(jié)構示意圖；圖2 :蓋片的俯視不意圖；圖3 :PCR芯片的俯視示意圖。
具體實施方式
如圖1所示，用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，包括至上而下依次設置的蓋片1、介質(zhì)層2、PCR芯片3和外部加熱結(jié)構4，如圖2，蓋片I上加工有通孔101，如圖3，PCR芯片 3上設有微腔孔301，微腔孔301的深度小于芯片的厚度，PCR芯片上覆介質(zhì)層，介質(zhì)層通過蓋片上的通孔呈現(xiàn)負壓吸附蓋片，PCR芯片的下底面與外部加熱結(jié)構緊密接觸。
蓋片I通過介質(zhì)層2與PCR芯片3相接，PCR芯片3的厚度為100 μ m 10mm，PCR 芯片上微腔孔301的體積為O. 01 μ L 10mL，微腔孔的形狀呈圓柱狀或者圓臺狀。
PCR芯片3為石英玻璃、三氧化二鋁、石英、玻璃、硅、PC、PTFE、PET、PSU、PVDF中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合，任意至少兩種材料通過鍵合、粘接或超聲波焊接方式相接復合。
蓋片I為聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、玻璃、石英 玻璃、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅膠材質(zhì)中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
介質(zhì)層2為環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物(C0C)、聚對二甲苯、聚酰亞胺(PI)、硅橡膠、聚丙烯(PP)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合；介質(zhì)層2的厚度為 10nm 10mnin
外部加熱結(jié)構4包含薄膜加熱片以及與其粘接的導熱材料；導熱材料為金屬、金屬氧化物、硅、碳化硅、石墨、導熱硅酮樹脂、導熱塑料中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
PCR芯片3上的微腔孔301中放入PCR溶液，然后由蓋片I密封，利用外部的加熱結(jié)構進行PCR擴增。蓋片I和PCR芯片3之間設有一層介質(zhì)層2，每次使用更換介質(zhì)膜即可。介質(zhì)層2通過蓋片上邊的通孔呈現(xiàn)負壓吸附蓋片，PCR擴增結(jié)束時恢復到正壓，以方便更換介質(zhì)膜。外部加熱結(jié)構4通過導熱好的材料與PCR芯片3的下表面盡量的完全直接接觸，以達到快速升降溫的效果。加熱溫度在三個溫度之間連續(xù)變換，降溫過程是自然降溫， 以實現(xiàn)PCR擴增。一個PCR擴增循環(huán)的具體過程為在PCR芯片3上的微腔孔301內(nèi)放入 PCR溶液，蓋片I吸附一層介質(zhì)層2，然后在蓋片I上施加一定壓力與微腔孔面密封(保持吸附狀態(tài))，然后外部加熱結(jié)構4進行加熱，在三個溫度之間各自保持一定時間，降溫為自然降溫，實現(xiàn)PCR擴增，移開蓋片1，吸附的介質(zhì)膜被去除掉，取出PCR溶液進行后續(xù)實驗。
實施例1PCR芯片采用石英玻璃作為基材，尺寸為80mmX 20mm，厚度為2mm，使用激光打孔工藝，在石英玻璃片上加工兩排微腔孔，每排為八個相同孔徑的微腔孔，兩排微腔孔中，一排微腔孔的直徑均為1. 6mm，另一排微腔孔的直徑均為3. 0mm，深度均為1. 5mm，微腔孔中心之間的間距為9mm，微腔孔中心與長邊之間的距離為8. 5mm，微腔孔中心與短邊之間的距離為 5. 5_。加工后的石英玻璃芯片需要經(jīng)過超聲波清洗，工藝為于丙酮溶液中，清洗5min ;取出直接放入乙醇溶液中，清洗5min，取出后直接放入去離子水中，清洗5min，氮氣吹干。
蓋片采用PC板材質(zhì)作為硬質(zhì)材料,加工成為80mmX 20mm尺寸，厚度為1. 5mm,將0.5mm厚的娃膠片也加工成80mmX20mm尺寸，然后使用結(jié)構膠將PC板與娃膠片粘接在一起，并在上邊加工出直徑為2_的通孔，利用通孔吸附介質(zhì)層。
介質(zhì)層采用PET薄膜作為介質(zhì)層，長寬尺寸分別為80mm和20mm。
外部加熱結(jié)構采用薄膜加熱片作為熱源，硅片作為熱傳導介質(zhì)。將薄膜加熱片制作成長寬尺寸分別為80mm和20mm，厚度為500 μ m的硅片也加工成長寬尺寸分別為80mm和 20mm，然后使用導熱膠將薄膜加熱片與硅片粘接在一起構成外部加熱結(jié)構。
用于PCR擴增時，其工藝步驟為1)將PCR芯片的下底面與外部加熱結(jié)構緊密接觸在一起；2)在PCR芯片上，直徑為1.6mm的八個微腔孔內(nèi)分別注入3 μ L的PCR溶液，直徑為3.Omm的八個微腔孔內(nèi)分別注入10 μ L的甲酰胺溶液；3)將蓋片的硬質(zhì)材料上表面和外部抽真空裝置相連，使其具有吸力，吸附一層PET薄膜，然后將帶有薄膜的蓋片與PCR芯片的上表面相接密封；4)外部加熱結(jié)構進行加熱，三個溫度變化值和順序分別為95°C—59°C—72°C，降溫過程為自然降溫，反復循環(huán)30次完成PCR擴增。
實施例2PCR芯片采用7740玻璃和硅片作為芯片基材，7740玻璃直徑尺寸為100mm，厚度為1.5mm,在玻璃片上劃出兩個80mmX 20mm尺寸的單元。使用激光打孔工藝，每個單元都有兩排微腔孔為通孔，每排含有八個相同孔徑的微腔孔，同一個單元中的兩排微腔孔直徑分別1. 6mm和3. 0mm，微腔孔中心之間的間距為9mm，微腔孔中心與單元的長邊之間的距 離為 8. 5mm,通孔中心與單兀短邊之間的距離為5. 5mm。娃片直徑尺寸為100mm,厚度為500 μ m。 利用陽極鍵合技術，將清洗后的含有通孔的玻璃片和硅片粘接在一起，形成PCR芯片。加工后的玻璃片和硅片都需要經(jīng)過超聲波清洗，工藝為于丙酮溶液中，清洗5min;取出直接放入乙醇溶液中，清洗5min,取出后直接放入去離子水中,清洗5min,氮氣吹干。
蓋片、介質(zhì)層和外部加熱結(jié)構的加工方法與實施例1相同。
可以看出，PCR芯片可以是一層結(jié)構，直接在上邊加工出微腔孔；或者是多層結(jié)構，在至少一層上加工出微腔孔，再通過鍵合、粘接或者焊接的方式與另一基材復合，多層結(jié)構時，層的材質(zhì)可以不同；以便實現(xiàn)快速PCR。
本發(fā)明與現(xiàn)有PCR芯片結(jié)構相比，凸顯以下特點(1)靜態(tài)腔式PCR芯片，能夠提高生物化學反應的速度，便于批量化低成本的生產(chǎn)；(2)芯片的微環(huán)境的熱容量小，可進行高速的升降溫控制，并能精確的檢測與控制區(qū)域的溫度；(3)溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，可達到很高的升/降溫速率(甚至可高達 60-900C / S)，反應時間顯著縮短；(4)反應液體積減小，反應液溫度的均勻性提高，擴增的特異性增強，既節(jié)省了成本又提聞了效率；(5)芯片易于集成和功能化，能夠快速便捷的實現(xiàn)擴增。
需要理解到的是以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍?！?br> 權利要求
1.用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于包括至上而下依次設置的蓋片、介質(zhì)層、PCR芯片和外部加熱結(jié)構，所述蓋片上加工有通孔，所述PCR芯片上設有微腔孔，PCR芯片上覆介質(zhì)層，介質(zhì)層通過蓋片上的通孔呈現(xiàn)負壓吸附蓋片，PCR芯片的下底面與外部加熱結(jié)構緊密接觸。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述PCR芯片的厚度為100 μ m 10mm，PCR芯片上微腔孔的體積為O. 01 μ L 10mL。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述PCR芯片為石英玻璃、三氧化二鋁、石英、玻璃、硅、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚砜、聚偏氟乙烯中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
4.根據(jù)權利要求3所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述任意至少兩種材料通過鍵合、粘接或超聲波焊接方式相接復合。
5.根據(jù)權利要求1所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述蓋片為聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲脂、玻璃、石英玻璃、聚二甲基硅氧烷、硅膠材質(zhì)中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
6.根據(jù)權利要求1所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述介質(zhì)層為環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物、聚對二甲苯、聚酰亞胺、硅橡膠、聚丙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
7.根據(jù)權利要求1或6所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述介質(zhì)層的厚度為lOnnTlOmm。
8.根據(jù)權利要求1所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述外部加熱結(jié)構包含薄膜加熱片以及與其粘接的導熱材料。
9.根據(jù)權利要求8所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述導熱材料為金屬、金屬氧化物、硅、碳化硅、石墨、導熱硅酮樹脂、導熱塑料中的任意一種材料或者是任意至少兩種材料的復合。
10.根據(jù)權利要求1所述的用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，其特征在于所述微腔孔的形狀為圓柱狀或者圓臺狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于PCR快速反應的芯片結(jié)構，包括至上而下依次設置的蓋片、介質(zhì)層、PCR芯片和外部加熱結(jié)構，蓋片上加工有通孔，PCR芯片上設有微腔孔，PCR芯片上覆介質(zhì)層，介質(zhì)層通過蓋片上的通孔呈現(xiàn)負壓吸附蓋片，PCR芯片的下底面與外部加熱結(jié)構緊密接觸；PCR芯片可以是一層結(jié)構，直接加工出微腔孔；或者是多層結(jié)構，在至少一層上加工出微腔孔，再與另一基材復合。易于快速實現(xiàn)PCR擴增，顯著提高生物化學反應的速度；芯片的微環(huán)境的熱容量小，可進行高速的升降溫控制，并能精確的檢測與控制區(qū)域的溫度；溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，反應時間大大縮短；反應液體積減小，擴增的特異性增強，既節(jié)省了成本又提高了效率。
文檔編號C12M1/00GK102994369SQ20121054219
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權日2012年12月14日
發(fā)明者何越, 周如華, 張健, 榮吉贊, 楊楠 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司