專利名稱：一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及ー種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法。體外細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)(是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)；懸浮培養(yǎng)通過振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)裝置使細(xì)胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法；其中懸浮培養(yǎng)又可分為微載體懸浮培養(yǎng)及全懸浮培養(yǎng)。與貼壁培養(yǎng)相比，懸浮培養(yǎng)具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)可連續(xù)擴(kuò)大生產(chǎn)量；(2)有利于細(xì)胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氣體充分接觸，而且易于控制培養(yǎng)條件(溫度、pH、氧分壓和CO2等)；(3)培養(yǎng)條件穩(wěn)定，趨于均一，便于進(jìn)行定量研究；(4)易于在連續(xù)密閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，減少了操作步驟和污染的機(jī)會(huì)；(5)可以長期連續(xù)培養(yǎng)，既可節(jié)省人力，又使細(xì)胞能持續(xù)維持在對數(shù)生長期；(6)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞仍保持原先對病毒的敏感性和生物學(xué)特性?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，如何克服貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的缺點(diǎn)，充分利用懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)成為細(xì)胞培養(yǎng)中的重大難題。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上不足，本發(fā)明提供了一種貼壁細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的方法，本方法將貼壁細(xì)胞利用細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，充分利用了懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，使得貼壁細(xì)胞可以進(jìn)行簡化、高效、大量的培養(yǎng)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括如下步驟
(1)利用細(xì)胞融合技術(shù)將貼壁無限傳代細(xì)胞系與有限傳代懸浮細(xì)胞融合，建立既能無限傳代又能懸浮培養(yǎng)的融合細(xì)胞系；
用方瓶貼壁培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的無限傳代細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為PH7. 0 7. 2，溫度36 37°C，培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)時(shí)間48 72h，細(xì)胞單層長至90%，細(xì)胞密度為3 6X105cells/mL ；
將方瓶中單層長至90%的細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，加入10mL血清濃度為15%細(xì)胞培養(yǎng)液，終止消化獲得細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
取與上述傳代細(xì)胞數(shù)目相等的動(dòng)物源性淋巴細(xì)胞，混合后進(jìn)行800rpm離心lOmin，獲得混合細(xì)胞泥；
將上述混合細(xì)胞泥以10mL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，在800rpm下離心10min，重復(fù)洗滌I次,除去殘余血清；
彈動(dòng)離心管底，將離心獲得的細(xì)胞泥散開，向管中加入濃度為50%的PEG lmL，在Imin內(nèi)勻速加完，并邊加邊輕輕晃動(dòng)；加入9mL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，混合均勻，1000rpm離心5min,棄上清；緩慢加入10mL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液,重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min,棄上清；カロ入5mL血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入5mL—次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C溫箱培養(yǎng)；同時(shí)設(shè)正常淋巴細(xì)胞對照；
(2)篩選懸浮生長的融合細(xì)胞；培養(yǎng)24h，用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部3 5次，將培養(yǎng)液連同懸浮生長細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)容器，37°C培養(yǎng)；培養(yǎng)3 5天，培養(yǎng)過程中，每隔6 8h晃動(dòng)ー下培養(yǎng)容器，以便于細(xì)胞的生長，連續(xù)培養(yǎng)7天以上，重復(fù)上述步驟數(shù)次，除去貼壁生長細(xì)胞，獲得完全懸浮生長的細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞在37°C連續(xù)培養(yǎng)7天以上，待殘存的淋巴細(xì)胞或自身融合的淋巴細(xì)胞自然凋亡后，以獲得無限傳代細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞。(3)細(xì)胞穩(wěn)定性的確定；
上述步驟(2)細(xì)胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)3 4天，補(bǔ)加血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液I次；培養(yǎng)7天以上，獲得完全懸浮生長的無限傳代細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞，IOOOrpm離心5min，去上清，以新鮮培養(yǎng)液重懸，置于新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中繼續(xù)培養(yǎng)，傳代I次；重復(fù)上述步驟，將細(xì)胞傳10個(gè)代次以上，顯微鏡下觀察。上述步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)溫度36 37°C、pH :7. 0 7. 4。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明利用細(xì)胞融合技術(shù)將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞馴化為可懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，充分利用了懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，為利用懸浮細(xì)胞獲得目的產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，本方法所馴化懸浮細(xì)胞可利用含有血清的普通細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，與無血清培養(yǎng)液相比，大大降低了培養(yǎng)成本。本方法采用全懸浮培養(yǎng)，與微載體懸浮培養(yǎng)相比有以下優(yōu)勢無需昂貴的微載體，從而有效降低生產(chǎn)成本；可省去微載體培養(yǎng)中附加步驟如消化收獲細(xì)胞等，從而簡化生產(chǎn)過程，縮短生產(chǎn)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，并易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。


圖1為本發(fā)明顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的情況。圖中A :培養(yǎng)10天，融`合細(xì)胞生長情況；B :培養(yǎng)10天，正常雞胚脾細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)生長情況；c :培養(yǎng)17天，融合細(xì)胞生長情況；D :培養(yǎng)17d，正常雞胚脾細(xì)胞生長情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步說明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好的了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。實(shí)施例1
(I)利用細(xì)胞融合技術(shù)，將DFl與雞胚脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得DFl與雞胚淋巴細(xì)胞的融合懸浮細(xì)胞系。將18日齡SPF雞胚無菌取脾臟，剪刀剪碎，加入ImL胰酶，37°C水浴消化lOmin，反復(fù)吹打數(shù)次，加入IOmL 15% MEM培養(yǎng)液，終止消化，4層紗布過濾。將濾液轉(zhuǎn)移至15mL離心管，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度約為106/mL ；
將方瓶中單層長至90%的DFl細(xì)胞消化，加入IOmL 15% MEM終止消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目；取等量的DFl與雞脾淋巴細(xì)胞混合(共約2 X IO6個(gè)細(xì)胞)，800rpm離心lOmin，去上清，以無血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，800rpm離心IOmin,再重復(fù)洗漆I次,除去殘余血清；
輕輕彈動(dòng)離心管，將上步獲得的細(xì)胞泥松動(dòng)，慢慢向管中加入濃度為50%的PEG ImL,且在Imin勻速加完，并邊加邊輕輕晃動(dòng)；
慢慢加入9mL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液,混勻，IOOOrpm離心5min,棄上清；緩慢加入IOmL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，IOOOrpm離心5min，棄上清；加入5mL血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入5mL —次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C溫箱培養(yǎng)。同吋，另取一部分脾臟懸液(約IO6個(gè)細(xì)胞)，置于15mL離心管，IOOOrpm離心5min，棄上清，加5mL血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入5mL —次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C溫箱培養(yǎng)，作為對照。(2)篩選懸浮生長的融合細(xì)胞并確定細(xì)胞穩(wěn)定性；
培養(yǎng)3d，補(bǔ)加2mL血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)液；培養(yǎng)I周，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液，并收集培養(yǎng)液，IOOOrpm離心5min，去上清，加入新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，次為傳代I次；重復(fù)上述步驟，將細(xì)胞傳10個(gè)代次以上，顯微鏡下觀察，見圖1 ;
通過上述步驟和觀察，可以看到在培養(yǎng)17天后正常雞胚脾臟淋巴細(xì)胞基本全部死亡，而DFl與雞胚脾臟淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞生長正常，表明成功實(shí)現(xiàn)了 DFl與雞胚脾臟淋巴細(xì)胞的融合，并獲得了可穩(wěn)定、懸浮培養(yǎng)的融合細(xì)胞系。在普通培養(yǎng)液中，淋巴細(xì)胞基本不發(fā)生分裂，且生命周期較短，而融合細(xì)胞 則能分裂生長，并表現(xiàn)出可無限傳代的特性。
權(quán)利要求
1.一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括如下步驟(1)利用細(xì)胞融合技術(shù)將貼壁無限傳代細(xì)胞系與有限傳代懸浮細(xì)胞融合，建立既能無限傳代又能懸浮培養(yǎng)的融合細(xì)胞系用方瓶貼壁培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的無限傳代細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為PH7. O 7. 2，溫度36 37°C，培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)時(shí)間48 72h，細(xì)胞單層長至90%，細(xì)胞密度為3 6X105cells/mL ；將方瓶中單層長至90%的細(xì)胞用EDTA-胰酶消化分散，加入IOmL血清濃度為15%細(xì)胞培養(yǎng)液，終止消化獲得細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；取與上述傳代細(xì)胞數(shù)目相等的動(dòng)物源性淋巴細(xì)胞，混合后在SOOrpm下離心lOmin，獲得混合細(xì)胞泥；將上述混合細(xì)胞泥以IOmL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，在SOOrpm下離心lOmin，重復(fù)洗滌I次,除去殘余血清；彈動(dòng)離心管底，將離心獲得的細(xì)胞泥散開，向管中加入濃度為50%的PEG lmL，在Imin內(nèi)勻速加完，并邊加邊輕輕晃動(dòng)；加入9mL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，混合均勻，IOOOrpm離心5min,棄上清；緩慢加入IOmL無血清細(xì)胞培養(yǎng)液,重懸細(xì)胞，IOOOrpm離心5min,棄上清；加入5mL血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入5mL于一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C溫箱培養(yǎng)；同時(shí)設(shè)正常淋巴細(xì)胞對照；(2)篩選懸浮生長的融合細(xì)胞培養(yǎng)24h，用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部3 5次，將培養(yǎng)液連同懸浮生長細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)容器，37°C培養(yǎng)；培養(yǎng)3 5天，培養(yǎng)過程中，每隔6 8h晃動(dòng)一下培養(yǎng)容器，連續(xù)培養(yǎng)7天以上，重復(fù)上述步驟數(shù)次，除去貼壁生長細(xì)胞，獲得完全懸浮生長的細(xì)胞；(3)細(xì)胞穩(wěn)定性的確定上述步驟(2)細(xì)胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)3 4天，補(bǔ)加血清含量為15%的細(xì)胞培養(yǎng)液I次;培養(yǎng)7天，IOOOrpm下離心5min，去上清液，以新鮮培養(yǎng)液重懸，置于新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中繼續(xù)培養(yǎng)，傳代I次；重復(fù)上述步驟，將細(xì)胞傳10個(gè)代次以上，顯微鏡下觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)溫度36 37°C、pH :7. O 7· 4。
全文摘要
本發(fā)明提供一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括如下步驟(1)利用細(xì)胞融合技術(shù)將貼壁無限傳代細(xì)胞系與有限傳代懸浮細(xì)胞融合，建立既能無限傳代又能懸浮培養(yǎng)的融合細(xì)胞系；(2)篩選懸浮生長的融合細(xì)胞；(3)將融合細(xì)胞系傳代培養(yǎng)10個(gè)以上代次，確定該細(xì)胞系的穩(wěn)定性。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明利用細(xì)胞融合技術(shù)將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞馴化為可懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，充分利用了懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，為利用懸浮細(xì)胞獲得目的產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，本方法所馴化懸浮細(xì)胞可利用含有血清的普通細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，與無血清培養(yǎng)液相比，大大降低了培養(yǎng)成本。本方法采用全懸浮培養(yǎng)，簡化生產(chǎn)過程，縮短生產(chǎn)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，并易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/02GK103045530SQ20121054200
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者徐明明, 張靜, 馬景霞 申請人:山東濱州沃華生物工程有限公司