專利名稱：一種體外擴增nk細胞的方法
一種體外擴增NK細胞的方法本發(fā)明涉及NK細胞的培養(yǎng)擴增方法，具體涉及一種體外大量擴增NK細胞的方法。自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)是屬淋巴細胞譜系,含有穿孔蛋白和粒酶顆粒的細胞毒淋巴細胞。其對靶細胞的識別無MHC限制性，無需預先致敏即可直接殺傷腫瘤細胞，也可分泌細胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，是機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性細胞免疫的核心調(diào)節(jié)細胞，在腫瘤免疫、抗病毒感染及清除非己細胞中發(fā)揮重要作用。有研究證明自然殺傷細胞其實不僅是天然免疫系統(tǒng)中的重要作用成分，它同樣具有獲得性免疫細胞的一些特征。在免疫系統(tǒng)中，NK細胞反應的速度比T細胞或B細胞要快，其作用機制主要是識別靶細胞，通過釋放穿孔素、顆粒酶和分泌多種細胞因子，迅速溶解某些腫瘤細胞，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。但由于NK細胞在人外周血中的含量極低及腫瘤組織中分布頻率較低(〈10% )，僅占單個核細胞的5%-10%，極大的限制了 NK細胞作為過繼免疫細胞在臨床上的應用。多年來，人們一直嘗試能在體外實現(xiàn)NK細胞的大量擴增，但是目前的常規(guī)技術主要是在體外培養(yǎng)體系中加入IL-2、IL-12、IL-15和Y -1FN等因子組合來促進NK的擴增，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后僅可以使NK細胞擴增幾倍或十幾倍，純度亦不理想，因此也不能滿足實際的應用。并且這種方法因子需求量較大，成本較高，培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，不適合體外大規(guī)模的應用。為了解決現(xiàn)有技術中NK細胞擴增后純度不理想、成本較高等問題，本發(fā)明提供一種新的NK細胞的體外擴增的方法，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、細胞純度高、殺傷活性強的NK細胞。為實現(xiàn)上述目的，設計一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步驟組成a.將外周血單個核細胞接種在⑶3McAb和⑶226McAb預包被的培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)，b.加入IL-2和IL-18共培養(yǎng)72小時以刺激擴增NK細胞， c.將NK細胞與經(jīng)致死處理的K562細胞和含有IL_2和IL-18的無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中共培養(yǎng)，d.收獲NK細胞。本發(fā)明還有如下的優(yōu)化方案用CD3McAb和CD226McAb可用作促進IL-2和IL-18的合成和ADCC作用。用⑶226提升NK細胞中表面活化分子⑶69的表達水平、細胞因子IFNy的分泌和殺傷顆粒⑶107a的表達水平。步驟b具體為，加入IL-2和IL-18，并放入37°C、5%C02的飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)72小時。
步驟c具體為，根據(jù)細胞生長情況持續(xù)補充含有IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)基。
步驟c中，所述的NK細胞與經(jīng)致死處理的K562細胞的細胞數(shù)比例為1:1。致死處理為K562細胞經(jīng)IOOGy劑量的Y射線照射致死。
外周血單個核細胞的濃度優(yōu)選為1. 5 XlOVml ο所述⑶3 McAb的使用優(yōu)選濃度為 100ng/ml。所述CD226 McAb的使用濃度為優(yōu)選50ng/ml 200ng/ml。所述CD226 McAb的最佳使用濃度為100ng/ml。所述IL-2使用濃度優(yōu)選為500IU/ml。所述IL-18使用濃度優(yōu)選為5ng/mf50ng/ml。所述IL-18最佳使用濃度為10ng/ml。所述無血清培養(yǎng)基還含有人血白蛋白，人血白蛋白使用濃度為O. 5%。
與常規(guī)的僅單純向培養(yǎng)體系中添加多種細胞因子的NK細胞培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1.將⑶3McAb和⑶226McAb兩種抗體同時包被，不僅⑶3可促進細胞因子合成和 ADCC作用，同樣作為NK細胞活化受體的⑶226的功能也得到證實，⑶226可以引起NK細胞表面活化分子⑶69的表達升高，細胞因子(IFNy)的分泌與殺傷顆粒(CD107a，GranzymeB) 的表達都明顯升聞，顯者提聞了 NK細胞的殺傷毒性；
2.轉(zhuǎn)袋處理在包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3天后，再將細胞轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中，這樣既可以保證NK細胞被充分激活，又避免了高濃度抗體對細胞的持續(xù)作用誘發(fā)的凋亡，并且同等條件下細胞培養(yǎng)袋的效果要優(yōu)于細胞培養(yǎng)瓶；
3.僅僅通過IL-2和IL-18兩種細胞因子就實現(xiàn) 了對NK細胞的激活和擴增，IL_2 可刺激NK細胞表達大量的IL-2R α鏈，從而使NK細胞大量增殖，并且在IL2刺激下NK細胞表達黏附分子，使NK胞質(zhì)中的顆粒增加并促進絲氨酸酯酶mRNA的表達，從而提高NK細胞的細胞毒活性；而IL-18可以誘導NK細胞分泌IFN- Y，并具有促進NK細胞的增殖、活化及Fas介導的殺傷功能，并且可通過胞內(nèi)的ITAM達到促進NK細胞活化的作用。常規(guī)NK細胞培養(yǎng)體系中使用的因子組合中還用到了 IL-12、IL-15和IFN-Y等，本發(fā)明僅在體外培養(yǎng)體系中使用了兩種細胞因子，即保證了 NK細胞的擴增倍數(shù)和細胞毒性，又降低了細胞培養(yǎng)的成本。[


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圖1是本發(fā)明與常規(guī)培養(yǎng)方法NK細胞擴增倍數(shù)的比較 圖2是本發(fā)明方法所得NK細胞純度圖3是常規(guī)培養(yǎng)方法所得NK細胞純度圖4是本發(fā)明與常規(guī)培養(yǎng)方法所得NK細胞對K562細胞殺傷活性的比較圖。[具體實施方式
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為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本申請中的生產(chǎn)設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1
一、外周血單個核細胞(PBMC)的分離和NK細胞的培養(yǎng)
通過血細胞分離機采集患者外周血單個核細胞(PBMC)，將采集的血樣轉(zhuǎn)至離心管；700g，離心分離lOmin，吸取上層血漿培養(yǎng)時備用；用O. 9%生理鹽水血樣將標本還原至原體積，混勻；將稀釋血緩慢加在Ficoll上，900g，離心20min ;吸取分離液界面乳白色單個核細胞層；離心洗滌2次并計數(shù)；用培養(yǎng)基將PBMC重懸，并調(diào)整細胞濃度至1. 5 X 10 6/ml，轉(zhuǎn)入預先用CD3McAb及CD226McAb包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入500IU/ml的IL-2和10ng/ml的IL-18，培養(yǎng)72小時，將細胞離心收集起來，計數(shù)，并與相同細胞數(shù)量的經(jīng)IOOGy劑量的Y射線照射致死的K562細胞混合，用含有O. 5%人血白蛋白的無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為lX106/ml，補加IL-2和IL-18至原濃度，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，以后每2-3天添加含相同濃度IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)基，維持細胞濃度在3 X 106/ml左右，14天后即可得到大量擴增的高純度、高毒性的NK細胞。二、本方法與常規(guī)方法的細胞擴增倍數(shù)的比較分別在第0、7、14及21天從兩組取培養(yǎng)細胞，用臺盼藍染色后計數(shù)，將計數(shù)當天的細胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細胞數(shù)(即第O天)，數(shù)值即為細胞的擴增倍數(shù)。以此方法可以動態(tài)比較兩組細胞的擴增情況，結(jié)果如表I和圖1所示在培養(yǎng)的第7、14、21天，本法的NK細胞擴增倍數(shù)均顯著高于常規(guī)組P〈0. 01。表1:
權利要求
1.一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步驟組成a.將外周血單個核細胞接種在⑶3McAb和⑶226McAb預包被的培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)，b.加入IL-2和IL-18共培養(yǎng)72小時以刺激擴增NK細胞，c.將NK細胞與經(jīng)致死處理的K562細胞和含有IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中共培養(yǎng)，d.收獲NK細胞。
2.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于用CD226提升NK細胞中表面活化分子⑶69的表達水平、細胞因子IFNy的分泌和殺傷顆粒⑶107a的表達水平。
3.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于步驟(b)為，加入IL-2和 IL-18，并放入37°C、5%C02的飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)72小時。
4.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于步驟(c)中，根據(jù)細胞生長情況持續(xù)補充含有IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)基。
5.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于步驟(c)中，所述的NK細胞與經(jīng)致死處理的K562細胞的細胞數(shù)比例為1:1。
6.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于外周血單個核細胞的濃度為1. 5 X IO6 /ml ο
7.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述CD226McAb的使用濃度為 50ng/ml 200ng/ml。
8.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述IL-18的使用濃度為 5ng/ml 50ng/ml。
9.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述無血清培養(yǎng)基中含有人血白蛋白，所述人血白蛋白使用濃度為O. 5%。
10.如權利要求1所述的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于所述所述CD3McAb的使用濃度為100ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及NK細胞的培養(yǎng)擴增方法，具體涉及一種體外大量擴增NK細胞的方法，a.將外周血單個核細胞接種在CD3McAb和CD226McAb預包被的培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)，b.加入IL-2和IL-18共培養(yǎng)72小時以刺激擴增NK細胞，c.將NK細胞與經(jīng)致死處理的K562細胞和含有IL-2和IL-18的無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋中共培養(yǎng)，d.收獲NK細胞，本發(fā)明將CD3McAb和CD226McAb兩種抗體同時包被，促進細胞因子合成和ADCC作用，顯著提高了NK細胞的殺傷毒性，僅僅通過IL-2和IL-18兩種細胞因子就實現(xiàn)了對NK細胞的激活和擴增，即保證了NK細胞的擴增倍數(shù)和細胞毒性，又降低了細胞培養(yǎng)的成本。
文檔編號C12N5/0783GK102994449SQ201210541658
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權日2012年12月13日
發(fā)明者葉永清, 楊雪晶, 蘇國新 申請人:上?？氯R遜生物技術有限公司