專(zhuān)利名稱(chēng)：用于間質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)化擴(kuò)增和移植的方法與組合物的制作方法
用于間質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)化擴(kuò)增和移植的方法與組合物
背景技術(shù)：
本發(fā)明整體上涉及用于干細(xì)胞分離、擴(kuò)增及植入有需要的宿主的組合物和方法。 更特別的，本發(fā)明涉及采用在優(yōu)化的生長(zhǎng)條件下擴(kuò)增的自體間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)靶組織進(jìn)行置換 和修復(fù)。
背景技術(shù)：
間質(zhì)干細(xì)胞屬于多能母細(xì)胞或胚胎樣細(xì)胞，其位于血液、骨髓、皮膚和骨膜中。通 常，這些細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以及在各種環(huán)境條件下能夠自我更新，并且分化為軟骨、骨及 其他結(jié)締組織。最近，不同的研究者研究了使用這些細(xì)胞修復(fù)或再生靶組織例如，骨、軟 骨等的可能性。據(jù)報(bào)告，MSC以這種方式在多個(gè)動(dòng)物模型中有再生的能力。參見(jiàn)Acosta 等，(2005)Neurosurg Focus 19(3) :E4 ；Barry (2003)Novartis Found Symp. 249 :86-102, 170-4,239-41 ；Brisby 等，(2004) Orthop Clin. North Am. 35(1) 85-89 ；Buckwalter 禾口 Mankin(1998)Instr Course Lect. 47 487-504 ；Caplan (1991)J Orthop Res. 9(5) 641-650。而且，這些研究結(jié)果正在拓展到對(duì)人的臨床試驗(yàn)中，然而，大部分這些臨床試驗(yàn)需 要運(yùn)用高濃度重組細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子進(jìn)行分離的非自體MSC的體外擴(kuò)增。例如，大多數(shù) 用于人的研究利用從骨髓(或外周血)分離的MSC，然后用摻加(spkie)有不同重組生長(zhǎng) 因子的胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室裝置中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離體(ex vivo)擴(kuò)增。這些補(bǔ)充 FBS的培養(yǎng)基顯示出支持MSC擴(kuò)增的能力，但也存在感染載體的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；使用未經(jīng)食 品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的藥物/因子，例如重組TGFHGF，表現(xiàn)出種間反應(yīng)，并有可 能導(dǎo)致癌癥性祖細(xì)胞形成的潛力提高。此外，大多數(shù)MSC用于人的研究均需要受訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，以進(jìn)行 分離的MSC的擴(kuò)增。這些技術(shù)并非醫(yī)師和/或醫(yī)院人員應(yīng)該具備的技能，尤其是考慮到醫(yī) 師在法律上受FDA協(xié)議及有關(guān)非FDA批準(zhǔn)藥品的程序的約束。因此，基于MSC的治療很難 以實(shí)際應(yīng)用方式加以實(shí)施，實(shí)際應(yīng)用方式，即利用醫(yī)院的設(shè)備由醫(yī)院工作人員。由于存在這 樣各種各樣的顧慮，大多數(shù)基于MSC的研究針對(duì)非自體細(xì)胞，這些細(xì)胞已經(jīng)被分離并培養(yǎng) 成永久細(xì)胞系。Doucet(Doucet，Ernou 等。2005 J. Cell Physiol 205(2) :288_36)最近描述了一 項(xiàng)技術(shù)，即用5%富含培養(yǎng)基的血小板裂解物擴(kuò)增年輕健康供體的MSC。然而，Doucet的研 究并未確定這些程序?qū)δ觊L(zhǎng)患者、退行性關(guān)節(jié)病(例如骨關(guān)節(jié)炎)患者或其他患者特異性 病癥的治療效果。除了用富含5%血小板裂解物的培養(yǎng)基之外，該研究未以其他任何擴(kuò)增條 件進(jìn)行過(guò)。由此可見(jiàn)，已經(jīng)表明，在患者中MSC生長(zhǎng)會(huì)由于患有或沒(méi)有骨關(guān)節(jié)炎、年齡、性別 以及基于某些遺傳表型而有寬范圍的變化。因此，Doucet的研究的實(shí)用性非常受限于實(shí)際 生命狀況，其中大多數(shù)需要基于MSC的治療的患者通常是年長(zhǎng)的，或者患有退行性關(guān)節(jié)、器 官或脊椎疾病。Doucet數(shù)據(jù)也不適用與其它骨代謝疾病如非血管性壞死或骨壞死。此外， Doucet的結(jié)論結(jié)果不是性別或年齡特異性的，其對(duì)于如何治療不同的性別或如何從高齡的 患者擴(kuò)增MSC幾乎沒(méi)有指導(dǎo)。在培養(yǎng)中，MSC能夠容易分化，其取決于細(xì)胞因子暴露、環(huán)境條件(壓力、附著機(jī)會(huì)、傳代處理等)或其他化學(xué)物質(zhì)暴露。例如，暴露于不同水平的TGF-0、FGF和/或PDGF， 均能影響培養(yǎng)物中產(chǎn)生的細(xì)胞的最終細(xì)胞表型。此外，將細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間保留在培養(yǎng)物中也會(huì) 影響其分化潛能。可以將細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到一定程度的細(xì)胞形態(tài)、匯合或密度，所有這些都影響 所產(chǎn)生的細(xì)胞終產(chǎn)品及其用于特定類(lèi)型組織修復(fù)的可能性。因此，本發(fā)明集中于控制因子 /參數(shù)，以期獲得均一化且具有一定促恢復(fù)性質(zhì)的的細(xì)胞產(chǎn)品。在用MSC進(jìn)行置換或修復(fù)組織的過(guò)程中，其中一個(gè)考慮就是非自體細(xì)胞的使用。 盡管MSC傳統(tǒng)上被認(rèn)為是免疫豁免(immun印rivileged)細(xì)胞，最近研究證明，MSC在外 源性宿主體內(nèi)活化自然殺傷細(xì)胞系統(tǒng)(Spaggiari，Capobianco等。2006 Blood 107(4) 1484-90)。這就使得使用非自體細(xì)胞變得困難，因?yàn)轭A(yù)料宿主免疫系統(tǒng)會(huì)攻擊這些外源細(xì) 胞，并有可能大量殺死(decimate)移植的MSC群，這就嚴(yán)重限制了其修復(fù)能力。此外，Ueda 發(fā)表的最近一項(xiàng)研究對(duì)非自體細(xì)胞的使用具有深遠(yuǎn)的意義(Ueda，Inaba等。2007 Stem Cells 25(6) 1356-63) 這項(xiàng)研究證明，患有骨質(zhì)疏松的年老小鼠通過(guò)骨髓載體將疾病傳 給了正常的小鼠。這暗示，年老的骨質(zhì)疏松小鼠的MSC—旦轉(zhuǎn)移到正常健康小鼠體內(nèi)就會(huì) 將患病狀態(tài)也傳給正常健康小鼠。傳播疾病的遺傳載體值得關(guān)注，這是因?yàn)槔碚撋先魏喂?體MSC都需要對(duì)所有已知的遺傳易感性與由供體轉(zhuǎn)移的疾病進(jìn)行篩選。在本領(lǐng)域中存在對(duì)這樣的MSC擴(kuò)增技術(shù)的需求，其不使用未經(jīng)FDA批準(zhǔn)的藥物或 生長(zhǎng)因子，且能夠有效用于置換有需要的患者的組織。這種置換術(shù)應(yīng)當(dāng)利用自體細(xì)胞，其中 所述自體細(xì)胞已經(jīng)基于患者的醫(yī)療狀況、年齡、性別和其他相關(guān)置換條件而進(jìn)行優(yōu)化擴(kuò)增。 此外，存在對(duì)自體技術(shù)的需求，以產(chǎn)生具有已知的再生能力并進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制的同源細(xì) 胞系。本發(fā)明旨在克服解決以上討論的一個(gè)或更多個(gè)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方式提供用于自體人間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)離體擴(kuò)增以及后續(xù)植入有 需要的患者靶組織的組合物和方法。這些MSC就它們的移植以及置換/再生靶組織的能 力而被優(yōu)化，例如，再生膝關(guān)節(jié)軟骨組織的能力。如上所述，它們還通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制被 優(yōu)化以產(chǎn)生均一的細(xì)胞系，表達(dá)一種或更多種下列細(xì)胞表面抗原⑶29、⑶44、⑶59、⑶73、 ⑶90、⑶166和⑶105，在某些實(shí)施方式中表達(dá)兩種、三種、四種、五種、六種或七種上述細(xì) 胞表面抗原。另外，本文所述的某些優(yōu)化的細(xì)胞不表達(dá)一種或更多種下列細(xì)胞表面抗原 CD14、CD31、CD45 和 / 或 CD106。本發(fā)明的一些方面包括新型擴(kuò)增組合物，其不需要純化的或重組生長(zhǎng)因子、細(xì)胞 因子或非天然存在的人體因子。特別是，擴(kuò)增組合物被設(shè)計(jì)為包括引入不同數(shù)量(在不同 時(shí)機(jī))血小板裂解物，用于優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)、尤其是優(yōu)化細(xì)胞在植入目標(biāo)患者時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)。 某些情況下的優(yōu)化包括以一種可控制的方式擴(kuò)增細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞向有需求患者體內(nèi)的成 功移植；在某些情況下細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞生長(zhǎng)條件受到監(jiān)測(cè)和改變，以維持細(xì)胞在預(yù)先設(shè)定 的“生長(zhǎng)通道(growth channel)”內(nèi)，S卩，在進(jìn)入有限數(shù)量的細(xì)胞傳代之前將細(xì)胞擴(kuò)增至需 要的數(shù)量。這些基于血小板裂解物的生長(zhǎng)條件提供在這一生長(zhǎng)通道內(nèi)MSC離體增殖必需因 子的持續(xù)自分泌釋放。此外，為了保證均一性和嚴(yán)格的質(zhì)量控制，該“生長(zhǎng)通道”具有多項(xiàng) 反映指標(biāo)，如細(xì)胞密度、形態(tài)特征和培養(yǎng)模式。而且，這些被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生符合已知細(xì)胞修復(fù)特性的細(xì)胞擴(kuò)增，因?yàn)檫@種細(xì)胞生長(zhǎng)配方的一些小變動(dòng)都將導(dǎo)致產(chǎn)生具有不同分化及修復(fù) 特性的完全迥異的細(xì)胞產(chǎn)物。本發(fā)明的一些方面亦包括使患者做好接受經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)的MSC的準(zhǔn)備，其通過(guò)移 植含特定數(shù)量血小板或血小板裂解物的細(xì)胞。細(xì)胞與血小板的移植可同時(shí)發(fā)生或者相繼發(fā) 生。在典型的實(shí)施方式中，MSC、血小板和血小板裂解物均來(lái)自即將向其移植MSC、血小板/ 血小板裂解物的患者。本發(fā)明的一些方面還包括從需要基于MSC的恢復(fù)治療的患者分離MSC的方法，運(yùn) 用通過(guò)不同數(shù)量血小板裂解物和基于細(xì)胞特性(例如匯合、形態(tài)特征、細(xì)胞培養(yǎng)模式等等) (為保證滿(mǎn)足特定需要的適當(dāng)均一性生長(zhǎng)所必需，即在生長(zhǎng)通道中生長(zhǎng))的培養(yǎng)決定因素 獲得的細(xì)胞特異性擴(kuò)增數(shù)據(jù)對(duì)分離的MSC進(jìn)行優(yōu)化擴(kuò)增，以及含有或不含相互依賴(lài)的MSC 生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)的擴(kuò)增細(xì)胞的移植。本發(fā)明的一些方面是在當(dāng)收集細(xì)胞并將其重新植入骨關(guān)節(jié)炎或其他軟骨病或骨 代謝病(如非血管性壞死或骨質(zhì)疏松)患者內(nèi)時(shí)特別有用，條件是從這些患者常規(guī)收獲的 這些細(xì)胞顯示了幾乎沒(méi)有在置換療法中的使用前景。然而，這一觀點(diǎn)并不意味著將本發(fā)明 的范圍或用途僅限于一個(gè)應(yīng)用。本發(fā)明的一些方面還提供一個(gè)生長(zhǎng)通道，確保收集的MSC以一種天然的方式保 持，這樣有利于細(xì)胞被移植回到患者體內(nèi)。這些細(xì)胞是自體的，并優(yōu)化在靶中的生長(zhǎng)潛能， 其僅使用來(lái)自與收獲細(xì)胞的相同宿主細(xì)胞的天然因子，即沒(méi)有合成的或重組因子以促進(jìn)細(xì) 胞生長(zhǎng)。在典型的生長(zhǎng)通道實(shí)施方式中，細(xì)胞在進(jìn)行第10次傳代之前被擴(kuò)增并準(zhǔn)備好實(shí) 施，在其他實(shí)施方式中細(xì)胞通過(guò)它們的第3次、第4次、第5次、第6次、第7次第8次或第9 次傳代(收集后)而被擴(kuò)增并準(zhǔn)備好實(shí)施。在大約第10次傳代之后移植的細(xì)胞表現(xiàn)出臨 床應(yīng)用方面無(wú)效性升高趨勢(shì)。本發(fā)明的一些方面還提供通過(guò)手工細(xì)胞計(jì)數(shù)確保擴(kuò)增的MSC保持在生長(zhǎng)通道內(nèi)。 在本發(fā)明的其他方面中，MSC通過(guò)可見(jiàn)的指示特征考察確定細(xì)胞是否處于生長(zhǎng)通道內(nèi)，適當(dāng) 的指示特征包括培養(yǎng)形態(tài)、培養(yǎng)模式和培養(yǎng)密度。在某些方面，細(xì)胞數(shù)目和可見(jiàn)的細(xì)胞考察 指標(biāo)用于指示細(xì)胞是否處于本發(fā)明的生長(zhǎng)通道內(nèi)。注意，可見(jiàn)的考察可在培養(yǎng)MSC的位點(diǎn) 進(jìn)行，例如，已經(jīng)簽約擴(kuò)增這些細(xì)胞的醫(yī)院血庫(kù)，或者通過(guò)遙控位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)，即經(jīng)驗(yàn)豐富的組 織培養(yǎng)技術(shù)人員通過(guò)數(shù)字顯微攝像機(jī)(現(xiàn)場(chǎng)攝像、更新圖片或其他類(lèi)似技術(shù))觀察細(xì)胞培 養(yǎng)狀況，然后向遠(yuǎn)距離現(xiàn)場(chǎng)工作人員提供有關(guān)培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)的反饋信息。最后，本發(fā)明的一些方面提供細(xì)胞群，其被使用本發(fā)明所述的方法就所鑒定的 表型進(jìn)行富集，所述表型包括以下一種或更多種細(xì)胞表面抗原⑶29、⑶44、⑶59、⑶90、 ⑶166、⑶73和⑶105。本文所鑒定的細(xì)胞進(jìn)一步典型地是下列陰性的⑶14、⑶31、⑶45和 ⑶106細(xì)胞表面抗原。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)優(yōu)化和擴(kuò)增的細(xì)胞群同時(shí)表達(dá)⑶29和⑶44 與下列至少一種其它表面抗原⑶59、⑶90、⑶105和⑶66。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā) 明優(yōu)化的細(xì)胞群表達(dá)至少⑶29、⑶44和⑶59 ；表達(dá)⑶29、⑶44和⑶90 ；表達(dá)CD29、⑶44 和 CD105 或者表達(dá) CD29、CD44 和 CD66。具有上述表型的用本文所述方法制備的細(xì)胞顯示出最佳的生長(zhǎng)特征用于植入有 需要的患者中。通過(guò)下面的詳細(xì)說(shuō)明和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的這些優(yōu)點(diǎn)及其他各種特征和優(yōu)勢(shì)將變得清楚。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-E顯示本文所述的“生長(zhǎng)通道”的各種圖解，其中包括細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞密 度、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞培養(yǎng)模式。A 細(xì)胞生長(zhǎng)速率以?xún)?yōu)化用于修復(fù)的擴(kuò)增。倍增時(shí)間定義為 單層培養(yǎng)中細(xì)胞數(shù)目加倍的天數(shù)。這是一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，因?yàn)榫哂行迯?fù)能力的細(xì)胞易于在培 養(yǎng)中指數(shù)生長(zhǎng)。使倍增時(shí)間處在可接受生長(zhǎng)通道內(nèi)所需要的血小板裂解物百分比濃度也決 定需要進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增與移植的血小板裂解物的量。細(xì)胞培養(yǎng)行為預(yù)期的生長(zhǎng)通道以上(> 3天)增加血小板裂解物濃度直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的 生長(zhǎng)通道內(nèi)；以更高密度接種直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的生長(zhǎng)通道內(nèi)。預(yù)期的生長(zhǎng)通道以下(< 1天)減小血小板裂解物濃度直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的 生長(zhǎng)通道內(nèi)；以更低密度接種直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的生長(zhǎng)通道內(nèi)。B 樣本兩個(gè)10cc骨髓以> 100的PSIS得率將核化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為集落形成培養(yǎng)物， 并從集落形成培養(yǎng)物中得到約700，000個(gè)MSC(裂解物的濃度20%，培養(yǎng)7_10天后)。在 這個(gè)實(shí)施例中，生長(zhǎng)通道顯示出倍增時(shí)間有些滯后導(dǎo)致產(chǎn)生上述細(xì)胞培養(yǎng)行為。細(xì)胞培養(yǎng) 行為如圖示預(yù)期生長(zhǎng)通道以上增加血小板裂解物濃度直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的生長(zhǎng)通 道內(nèi)；以更高密度接種直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的生長(zhǎng)通道內(nèi)；如圖示預(yù)期生長(zhǎng)通道以下減小血小板裂解物濃度直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的生長(zhǎng)通 道內(nèi)；以更低密度接種直至生長(zhǎng)速率在預(yù)期的生長(zhǎng)通道內(nèi)。C:細(xì)胞匯合的定義為，單層培養(yǎng)細(xì)胞之間自有空隙所占的百分比。如圖所示，包裝 過(guò)于緊密的細(xì)胞將迅速進(jìn)入分化狀態(tài)，而包裝過(guò)于疏松的細(xì)胞則不會(huì)達(dá)到目標(biāo)生長(zhǎng)速率。 細(xì)胞的空間分布可用下列方程進(jìn)行定量分析表面積匯合)/細(xì)胞數(shù)目。這個(gè)值范圍 應(yīng)該在18-23之間。細(xì)胞培養(yǎng)行為預(yù)期生長(zhǎng)通道以下(< 18)減小血小板裂解物濃度直至匯合處于預(yù)期生長(zhǎng)通道 內(nèi)；以更低接種密度接種直至匯合符合預(yù)期的生長(zhǎng)通道；預(yù)期生長(zhǎng)通道以上(> 23)以更高密度接種直至匯合符合預(yù)期通道(從12X 103 個(gè)細(xì)胞/cm2到15X 103個(gè)細(xì)胞/cm2)；顯著高于預(yù)期生長(zhǎng)通道(> 27)；增加血小板裂解物濃度。D:細(xì)胞分布的定義為，細(xì)胞在二維空間(單層培養(yǎng))中存在隨機(jī)性。隨機(jī)分布的 細(xì)胞在該生長(zhǎng)通道內(nèi)，結(jié)塊的或不均勻分布的細(xì)胞不屬于該生長(zhǎng)通道。細(xì)胞培養(yǎng)行為在預(yù)期的生長(zhǎng)通道之外(不均勻分布)以更高的密度接種直至細(xì)胞均勻分布；相 對(duì)于預(yù)期較早地進(jìn)行細(xì)胞傳代。E 與本發(fā)明相關(guān)的MSC形態(tài)學(xué)類(lèi)型及非相關(guān)類(lèi)型。可以利用各種環(huán)境刺激和條 件，將MSC培養(yǎng)為相對(duì)于其他表型而傾向于一種表型。此處顯示的為與本發(fā)明不相關(guān)的表 型。與本發(fā)明相關(guān)的表型為紡錘形?；蛉鐖D所示的I型。任何與這種形態(tài)特征的偏差都需 要本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)行為。I型根據(jù)本發(fā)明所述的生長(zhǎng)通道要求生長(zhǎng)的iMSC的I型MSC顯微圖像(10x)。II型II型MSC的顯微圖像(10x)，該圖像取自與環(huán)境接觸的人間質(zhì)干細(xì)胞 ^M^'iSi^lia-MM^i Denitsa Docheva*, Cvetan Popv, Wolf Mutschler, MatthiasSchieker J. Cell Mo1. Med. Vol 11，No 1，2007pp.21-38.III型III型MSC的顯微圖像(20x)，該圖像取自脂肪組織間質(zhì)干細(xì)胞與 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肝臟生成分化的比較，RaquelTalens-Visconti，Ana Bonora, Ramiro Jover, Vincente Mirabet, FranciscoCarbonell, Jose Vincente Castell, Maria Jose Gomez-Dechon World J. Gastroenterol 2006 年 9 月 28 日；12 (36) :5834-5845。IV型IV型MSC的顯微圖像(10x)，該圖像取自自體骨髓衍生培養(yǎng)的間質(zhì)干 細(xì)胞通過(guò)纖維素噴射器給藥后加速小鼠與人皮膚創(chuàng)面的愈合，V FALANGA, S IWAM0T0, M CHARTIER, T YUFIT, JBUTMARC, N K0UTTAB, D SHRAYER, P ；CARSON TISSUEENGINEERING Volume 13，Number 6，2007。細(xì)胞培養(yǎng)行為在預(yù)期通道之外(> 30% II型細(xì)胞)增加血小板裂解物濃度直至細(xì)胞形態(tài)為I 型，或者如果傳代次數(shù)> 5則移植；顯著超出預(yù)期通道(> 30% III型細(xì)胞或IV型細(xì)胞)；較預(yù)期時(shí)間早一些對(duì)細(xì)胞 進(jìn)行傳代或移植；細(xì)胞可能不發(fā)揮理想的效果。圖2為細(xì)胞擴(kuò)增圖，顯示當(dāng)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)于5-10%血小板裂解物時(shí)，8位骨關(guān)節(jié) 炎患者細(xì)胞間生長(zhǎng)速率與產(chǎn)率的差異。圖3A-E顯示5位患者分離的MSC群經(jīng)過(guò)使用5_20%血小板裂解物的1_16天培養(yǎng) 后的條狀圖。圖4顯示用5-20%血小板裂解物培養(yǎng)時(shí)6位不同患者M(jìn)SC擴(kuò)增的條形圖，圖中顯 示患者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或生長(zhǎng)迅速。圖5為針對(duì)5位不同患者的干細(xì)胞生長(zhǎng)通道疊加。圖6A和B為運(yùn)用經(jīng)過(guò)本發(fā)明實(shí)施方案優(yōu)化的細(xì)胞進(jìn)行MSC移植前后的“快速自旋 質(zhì)子密度圖(fast spin proton density image) ”。圖7為顯示用10%或20%血小板裂解物的4位患者細(xì)胞首次傳代、第2次傳代或 第3次傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)的條形圖。圖8顯示在兩種不同骨髓抽取條件下一位3-4期非血管性壞死患者的細(xì)胞擴(kuò)增。 條件1 兩種10cc骨髓抽取物產(chǎn)生4800萬(wàn)核化細(xì)胞，這些細(xì)胞在10%血小板裂解物存在時(shí) 不發(fā)生擴(kuò)增。培養(yǎng)物在2周后死掉。條件2:6小份取自?xún)蓚?cè)PSIS區(qū)域的l-2cc骨髓產(chǎn)生 1億6400萬(wàn)核化細(xì)胞。顯示的是MSC在20%血小板裂解物中生長(zhǎng)的擴(kuò)增圖。圖9A和9B為運(yùn)用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施方案優(yōu)化的細(xì)胞進(jìn)行MSC移植前后的“快速自旋 質(zhì)子密度MRI圖像”。顯示中前膝蓋彎月面的部分再生。分離自非血管性患者臀部的MSC 的擴(kuò)增。細(xì)胞移植前(左圖拍于2007年1月)和移植后3個(gè)月(右圖拍于2007年6月) 右膝蓋的連續(xù)匹配圖。圖10A與10B為運(yùn)用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施方案優(yōu)化的細(xì)胞進(jìn)行MSC移植前后的透射圖。 顯示的是肱骨錯(cuò)位骨折的部分恢復(fù)。圖11A和11B為用本發(fā)明實(shí)施方案擴(kuò)增的MSC移植前后伴有膝關(guān)節(jié)中部彎月面重 度退化、隨后彎月面部分再生的骨關(guān)節(jié)炎患者的質(zhì)子密度矢狀面圖。詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案提供用于在最佳生長(zhǎng)條件下收集、擴(kuò)增和移植自體間質(zhì)干細(xì)胞的方法和組合物。擴(kuò)增條件基于患者特定MSC群的個(gè)性化生長(zhǎng)特征，無(wú)需合成的或重組的 生長(zhǎng)因子。在典型的實(shí)施方案中，最佳生長(zhǎng)條件至少部分由同一患者的血小板裂解物提供。 這些血小板裂解物組合物提供患者自身生長(zhǎng)因子組合的持續(xù)而有效地釋放。注意本發(fā)明 的一些方面同樣適用除MSC外的其他細(xì)胞類(lèi)型，例如，干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等等，只是出于方 便，本文所述的實(shí)施方案僅局限于MSC。此外，優(yōu)化生長(zhǎng)的細(xì)胞可與自體分泌的因子一起進(jìn) 行移植，增強(qiáng)細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)療效的能力，例如，與血小板或血小板裂解物聯(lián)用，即從將接受 MSC的同一患者體內(nèi)收集的血小板。最后，本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案包括通過(guò)本文所述的 優(yōu)化生長(zhǎng)條件獲得的就均一表型被富集的MSC，經(jīng)鑒定確定這樣的細(xì)胞可作為最佳細(xì)胞用 于基于再生性MSC的治療。定義提供下列定義將有助于理解本文常用的特定術(shù)語(yǔ)，但其并不為了限制本發(fā)明的范圍?！皞€(gè)性化生長(zhǎng)特征”指所收集細(xì)胞的個(gè)體特異性離體生長(zhǎng)。例如，典型地收集自許 多骨關(guān)節(jié)炎患者個(gè)體的細(xì)胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢，需要變動(dòng)生長(zhǎng)特征確保細(xì)胞具有最佳生長(zhǎng)， 以便準(zhǔn)備被移植入患者內(nèi)?！伴g質(zhì)干細(xì)胞”或“MSC”指能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng) 元細(xì)胞、胰島細(xì)胞等(見(jiàn)下文)的多能干細(xì)胞?！疤烊粩U(kuò)增因子”指對(duì)于有需要的患者而言是天然的因子，如同暴露于從體外來(lái)源 制備的合成或重組擴(kuò)增因子。天然表達(dá)因子典型地與血小板裂解物有關(guān)并從其釋放?！把“辶呀馕铩敝赴谘“逯械奶烊簧L(zhǎng)因子的組合，通過(guò)裂解血小板而釋 放。這可通過(guò)化學(xué)方法獲得，即CaCl2、滲透作用(運(yùn)用蒸餾水)、或通過(guò)冷凍/融化程序。 本發(fā)明的血小板裂解物也可來(lái)自全血，例如根據(jù)在《美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，198，357》中所述進(jìn)行制 備，通過(guò)參照將其并入本文?！暗鞍踪|(zhì)”、“肽”及“多肽”可交換使用，表示氨基酸的聚合物或一組互相作用或鏈 接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的聚合體。“干細(xì)胞”指任何具有非特化并能長(zhǎng)期通過(guò)細(xì)胞分裂進(jìn)行更新、亦能被誘導(dǎo)變成特 異性功能細(xì)胞的細(xì)胞?！凹?xì)胞培養(yǎng)行為”指血小板裂解物濃度的改變、以不同的密度在培養(yǎng)物中再接種細(xì) 胞、或計(jì)劃傳代時(shí)間的改變(即，在更換培養(yǎng)基前保留在培養(yǎng)基中更長(zhǎng)或更短的時(shí)間)?！皞鞔敝冈趩螌蛹?xì)胞培養(yǎng)中更換用過(guò)的培養(yǎng)基或者以其他方式改變培養(yǎng)基以改 善細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境。MSC與血小板裂解物的來(lái)源間質(zhì)干細(xì)胞為位于骨髓、外周血、脂肪組織及其他類(lèi)似來(lái)源組織的多能干細(xì)胞。 MSC具有分化為許多細(xì)胞類(lèi)型的能力，其中包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及 3胰島細(xì)胞。本發(fā)明的MSC來(lái)源典型地收獲自需要恢復(fù)/置換治療的患者(或合適供體)的髂 嵴，本文提及的這種患者指“有需要的患者”(注意其他來(lái)源如脂肪組織、滑液組織及結(jié)締組 織最近已通過(guò)鑒定，并被認(rèn)為可作為本發(fā)明范疇內(nèi)的MSC來(lái)源)。在一個(gè)實(shí)施方案中，收集 了大約10-20CC骨髓，并運(yùn)用Centeno的《美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/761，441》中所述方法或者通過(guò)Caplan等的《美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，486，359》中所述的塑料粘附法對(duì)其進(jìn)行分離。這些參考文 獻(xiàn)的每一篇均以完整形式一并歸入本文。本發(fā)明還對(duì)標(biāo)準(zhǔn)骨髓抽取程序做了改動(dòng)，以便使用本文所述的血小板裂解物技術(shù) 獲得適當(dāng)?shù)暮嘶?xì)胞產(chǎn)量。由于已經(jīng)公開(kāi)的大多數(shù)研究都是在健康人或動(dòng)物中進(jìn)行，這項(xiàng) 技術(shù)針對(duì)患有不同疾病患者的應(yīng)用尚未進(jìn)行過(guò)研究。圖8顯示了一個(gè)實(shí)施方案，其中來(lái)自 一位AVN(需要AVN部位的骨骼修復(fù))的骨髓抽取物通過(guò)上述兩側(cè)10cc抽取技術(shù)導(dǎo)致在血 小板裂解物中擴(kuò)增失敗。但是，運(yùn)用每側(cè)抽取3小份2-3cc骨髓(總共6份)的改良技術(shù) 得到了所需要的核化細(xì)胞產(chǎn)量，這些細(xì)胞在20%血小板裂解物中進(jìn)行了成功的擴(kuò)增。本文使用的血小板裂解物由利用Doucet法獲得的骨髓收集物制備，這一方法通 過(guò)參照整體并入本文。典型的裂解物包括從數(shù)千萬(wàn)到數(shù)千億個(gè)血小板。正如Martineau等 (Biomaterials,2004 25 (18)p4489_503)(通過(guò)參照整體并入本文)的研究所顯示的那 樣，血小板裂解物本身包括促進(jìn)MSC同步生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子。在典型的實(shí)施方案中，血小 板裂解物與MSC屬于自體物質(zhì)，且數(shù)量上亦屬有效量，故能刺激MSC的同步擴(kuò)增(見(jiàn)下文詳 述)。由其應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管諸如TGF-0等生長(zhǎng)因子的水平在血小板裂解物中遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 常用于MSC擴(kuò)增的水平，但認(rèn)為，當(dāng)包含于血小板裂解物的所有低水平生長(zhǎng)因子一起使用 時(shí)存在明顯的協(xié)同效應(yīng)。生長(zhǎng)通道要求如本發(fā)明的發(fā)明人所揭示，本發(fā)明收集的MSC在離體不晚于第10次傳代，優(yōu)選離 體不晚于第5次傳代(一次傳代相當(dāng)于細(xì)胞的收集與接種平鋪，使細(xì)胞數(shù)目增加，用于培 養(yǎng)基和/或組織培養(yǎng)物定居/作為底物)后植入患者體內(nèi)時(shí)可提供最佳恢復(fù)/再生性治 療。正因?yàn)槿绱耍课换颊叩腗SC必須在有限的傳代次數(shù)中擴(kuò)增至治療所必需數(shù)量，而無(wú)需 加入FDA未批準(zhǔn)的藥物或生長(zhǎng)因子。本發(fā)明的實(shí)施方式提供運(yùn)用血小板裂解物確保收集的 MSC擴(kuò)增至所需數(shù)量的生長(zhǎng)通道條件，因此擴(kuò)增的MSC被優(yōu)化用于移植并用于目標(biāo)患者。確定一位患者M(jìn)SC生長(zhǎng)潛能(確保所需數(shù)量的細(xì)胞)存在不同的要求，也就是說(shuō)， 需要個(gè)性化的生長(zhǎng)特征(見(jiàn)上述定義)。這些要求包括MSC來(lái)源，即年齡、性別、遺傳限制及 退行性疾病如骨關(guān)節(jié)炎等的存在。就從骨關(guān)節(jié)炎患者收集的MSC而言，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了兩種不同的細(xì)胞生長(zhǎng)類(lèi) 型“緩慢生長(zhǎng)”與“快速生長(zhǎng)”?；颊咧写嬖诰徛L(zhǎng)細(xì)胞提出了一個(gè)實(shí)際的問(wèn)題，即迅速 擴(kuò)增細(xì)胞并在這組細(xì)胞內(nèi)保持最大分化潛能的能力。不具備最大分化潛能的細(xì)胞很可能在 移植過(guò)程中停止分化。Crisostomo等，Shock, 2006 26(6) :p 575-80。因此，需要更高水 平的患者血小板裂解物去刺激所需要的MSC生長(zhǎng)。所以，這些細(xì)胞的處理與分離自一個(gè)年 輕而健康個(gè)體的MSC必須完全不同。注意，表現(xiàn)出有限離體擴(kuò)增潛能的細(xì)胞，即經(jīng)過(guò)整個(gè)傳 代過(guò)程(<3天)細(xì)胞數(shù)目增加不到100%，被認(rèn)為對(duì)于本發(fā)明的應(yīng)用目的來(lái)說(shuō)屬于緩慢生 長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，最佳MSC離體培養(yǎng)擴(kuò)增需要的血小板裂解物的量通 過(guò)監(jiān)測(cè)不同生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的收集細(xì)胞來(lái)確定。當(dāng)細(xì)胞涉及骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、AVN或骨 骼、軟骨或結(jié)締組織疾病患者時(shí)，這就顯得尤為重要。MSC擴(kuò)增依賴(lài)于許多變量患者血小 板裂解物中生長(zhǎng)因子的量(因而改變裂解物的百分比濃度可滿(mǎn)足最大生長(zhǎng)速率需要)、生 長(zhǎng)因子的生物利用率(即這些因子對(duì)患者細(xì)胞的效應(yīng))、生長(zhǎng)因子的相對(duì)濃度及患者初始源細(xì)胞的質(zhì)量/數(shù)量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為了在這些變量下優(yōu)化MSC生長(zhǎng)，本文 提出了“生長(zhǎng)通道”的概念，其含義即是，相對(duì)于一個(gè)預(yù)定的時(shí)間段和/或細(xì)胞傳代次數(shù)(對(duì) 于最佳生長(zhǎng)條件來(lái)說(shuō)不超過(guò)10次)患者細(xì)胞的目標(biāo)擴(kuò)增速率。這種生長(zhǎng)通道考慮了所有 產(chǎn)生一個(gè)特異的均一的細(xì)胞群落所需要的必需細(xì)胞培養(yǎng)條件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)MSC離體培養(yǎng)擴(kuò)增需要的血小板裂解物的量與 可見(jiàn)參數(shù)相結(jié)合，從而確定最佳生長(zhǎng)條件。特別是，這一實(shí)施方式要求上述血小板裂解物條 件應(yīng)當(dāng)與收集的MSC集落形成及MSC單層培養(yǎng)擴(kuò)增要求相結(jié)合。一方面，在集落形成過(guò)程 中必須防止MSC過(guò)度生長(zhǎng)，也就是說(shuō)，必須防止出現(xiàn)封閉集落的集落邊緣細(xì)胞。另一方面， 在集落形成過(guò)程中必須防止MSC生長(zhǎng)不足，也就是說(shuō)，細(xì)胞不增殖。如果MSC在集落形成過(guò) 程中過(guò)度生長(zhǎng)，必須從集落形成培養(yǎng)物中將其去除并置于單層培養(yǎng)中，如果MSC在集落形 成過(guò)程中生長(zhǎng)不足，就應(yīng)當(dāng)去除部分培養(yǎng)基(大約一半)并加入新鮮培養(yǎng)基(加入之前使 用的血小板裂解物濃度)。另一方面，對(duì)單層擴(kuò)增中的細(xì)胞必須進(jìn)行觀察，看其是否出現(xiàn)過(guò) 度生長(zhǎng)，即高密度和高接種密度如10，000-12, 000個(gè)細(xì)胞/cm2，或是否出現(xiàn)生長(zhǎng)不足，即細(xì) 胞形態(tài)為圓形、旗形或細(xì)胞膨脹等。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)這種形態(tài)時(shí)血小板裂解物濃度應(yīng)當(dāng)增加至 至少 10-15%。更詳細(xì)地說(shuō)，本文所提及的細(xì)胞生長(zhǎng)最大擴(kuò)增速率與最大修復(fù)能力的“生長(zhǎng)通道” 包含以下四個(gè)不同的方面1.單層培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)速率；2.單層培養(yǎng)中的細(xì)胞密度；3.單層培養(yǎng)中的細(xì)胞培養(yǎng)模式；和4.單層培養(yǎng)中的細(xì)胞形態(tài)。這些概念在圖1的圖表中亦有解釋?！皢螌优囵B(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)速率”-由于血小板裂解物含有因患者不同而水平各異的 生長(zhǎng)因子，因而直到能確定生長(zhǎng)因子對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增速率的影響作用時(shí)才有方法確定其生物活 性。因此，在“生長(zhǎng)通道”內(nèi)擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵因素就是最小生長(zhǎng)速率。將其定義為，調(diào)整血 小板裂解物濃度參數(shù)和/或接種密度直至倍增時(shí)間為1-3天。這將使細(xì)胞在進(jìn)行第5至第 7次傳代前數(shù)量增加大約50-100倍(見(jiàn)圖1圖表1)。也正如圖1 (圖表2)所示，這是生長(zhǎng) 通道起始于兩側(cè)10cc骨髓抽取物(僅用于圖解所述目的)的一個(gè)例子。從上述生長(zhǎng)通道 的偏離將需要實(shí)施圖1圖表1所描述及相關(guān)說(shuō)明中的細(xì)胞培養(yǎng)行為?！皢螌优囵B(yǎng)中的細(xì)胞密度”-細(xì)胞密度可影響細(xì)胞生長(zhǎng)與分化能力。Doucet (上文 引用)描述了一個(gè)大約每毫升幾千個(gè)細(xì)胞的低接種密度(在其它健康的對(duì)照中)。但是，我 們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，患有諸如骨關(guān)節(jié)炎、AVN及錯(cuò)位骨折的患者需要更高的接種密度，而且在傳代 中保持高接種密度對(duì)產(chǎn)生具有修復(fù)能力的擴(kuò)增細(xì)胞十分重要。因而，圖1圖表3就顯示了 本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的可接受的細(xì)胞匯合通道(優(yōu)化細(xì)胞的體內(nèi)修復(fù)能力)。本發(fā)明所述 的MSC空間分布可通過(guò)下列方程進(jìn)行定量分析表面積匯合)/細(xì)胞數(shù)目。該圖的范 圍應(yīng)當(dāng)為18-23。如果該值< 18，那么細(xì)胞可以低密度接種，因?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)勢(shì)格外好。如果這 一值落于23-27之間，就應(yīng)該以更高密度接種(從12X 103個(gè)細(xì)胞/cm2到15X 103個(gè)細(xì)胞/ cm2)。如果這個(gè)值> 27，那么就應(yīng)當(dāng)增加血小板裂解物濃度。單層培養(yǎng)中的細(xì)胞培養(yǎng)模式-本發(fā)明中細(xì)胞生長(zhǎng)模式十分重要，因?yàn)榧?xì)胞之間均勻分布的距離就有利于促進(jìn)連續(xù)擴(kuò)增并使細(xì)胞保持未分化狀態(tài)。為了保證這一點(diǎn)，均勻分 布的MSC是本文所述生長(zhǎng)通道的部分。在圖1圖表4中有進(jìn)一步說(shuō)明。任何從上述細(xì)胞培 養(yǎng)模式的偏離將會(huì)要圖1圖表4及其他相關(guān)說(shuō)明中所述的細(xì)胞培養(yǎng)行為進(jìn)行矯正。單層培養(yǎng)中的細(xì)胞形態(tài)單層培養(yǎng)中的細(xì)胞形態(tài)對(duì)于本發(fā)明涉及的特異MSC表型 十分重要。由于它只適用于間質(zhì)干細(xì)胞，最佳形態(tài)為單層培養(yǎng)中呈紡錘形(成纖維細(xì)胞)。 應(yīng)當(dāng)注意的是，其它間質(zhì)干細(xì)胞系常常表現(xiàn)出多角或旗形形態(tài)，這一形態(tài)不屬于所述生長(zhǎng) 通道的表型。注意已經(jīng)針對(duì)本發(fā)明的目的建立了一個(gè)分類(lèi)系統(tǒng)，其中包括1-4型，與本發(fā) 明有關(guān)的最佳細(xì)胞類(lèi)型為I型。關(guān)于這點(diǎn)在圖1圖表5中有更詳細(xì)的說(shuō)明。需要注意的一 點(diǎn)是，2-4級(jí)顯示在圖1的圖表5中，選自以前的文獻(xiàn)，引文的每位作者都認(rèn)為這些是他們的 MSC所能接受的形態(tài)。另外，處于所述生長(zhǎng)通道內(nèi)的優(yōu)選形態(tài)為紡錘形，其細(xì)胞表面積小，不 像2-4型中的MSC，其表面積比最佳1型的大50%。一旦培養(yǎng)物有> 30%的2_4型MSC，就 應(yīng)當(dāng)將血小板裂解物濃度從10%增至15-20%。細(xì)胞群落應(yīng)當(dāng)在這個(gè)點(diǎn)上進(jìn)行移植，以避 免發(fā)生從理想形態(tài)的潛在偏離。從上述細(xì)胞形態(tài)通道的任何偏離將需要圖1圖表5及相關(guān)說(shuō)明中所述的細(xì)胞培養(yǎng) 行為進(jìn)行矯正。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)通道表示自體MSC在離體培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)特征，這一特 征可保證獲得1000萬(wàn)到1億個(gè)細(xì)胞植入靶位點(diǎn)，例如膝關(guān)節(jié)。擴(kuò)增細(xì)胞的數(shù)目一定程度上 取決于需要再生的靶位點(diǎn)，例如椎間盤(pán)的再生需要大約每毫升100萬(wàn)到1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，而 膝關(guān)節(jié)表面需要的細(xì)胞數(shù)目則為每毫升數(shù)千萬(wàn)個(gè)到數(shù)億個(gè)細(xì)胞。對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)， 一般通過(guò)運(yùn)用不同濃度的血小板裂解物來(lái)調(diào)整其生長(zhǎng)。本發(fā)明離體擴(kuò)增的MSC生長(zhǎng)可通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和/或可見(jiàn)細(xì)胞參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。細(xì)胞 計(jì)數(shù)技術(shù)建立的基礎(chǔ)在于，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量超過(guò)那些細(xì)胞的容納的空間/密度時(shí)，從組織培養(yǎng) 容器或培養(yǎng)基中收集細(xì)胞并進(jìn)行傳代。細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)必須由一名熟練技工現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，這名 技工可收集細(xì)胞并從計(jì)數(shù)小室裝置如血球計(jì)數(shù)器或光譜圖計(jì)數(shù)器中獲取細(xì)胞數(shù)目。正如 本發(fā)明其他地方所述，細(xì)胞計(jì)數(shù)亦可通過(guò)因特網(wǎng)向經(jīng)驗(yàn)豐富技工遠(yuǎn)距離傳遞數(shù)字圖像而進(jìn) 行。如上文所述，本文公開(kāi)的可見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)包括觀察本發(fā)明細(xì)胞形態(tài)，確定收集 細(xì)胞和傳代的難易度?？梢?jiàn)參數(shù)包括細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)、細(xì)胞培養(yǎng)模式和細(xì)胞培養(yǎng)密度。特別 是，下列特定的定量參數(shù)可被考察集落形成過(guò)度生長(zhǎng)、集落形成生長(zhǎng)不足、單層擴(kuò)增培養(yǎng) 物過(guò)度生長(zhǎng)、單層擴(kuò)增培養(yǎng)生長(zhǎng)不足、血球計(jì)數(shù)器中血小板圖像和干細(xì)胞數(shù)目、抽取骨髓后 首次接種的粘附細(xì)胞數(shù)、確定收集時(shí)間的集落形成到產(chǎn)生集落(包括生長(zhǎng)過(guò)度與生長(zhǎng)不 足)、細(xì)胞接到培養(yǎng)瓶后分布的均勻度(即在單層擴(kuò)增期間細(xì)胞應(yīng)均勻分布于培養(yǎng)瓶中)、 接種密度、確定何時(shí)該進(jìn)行細(xì)胞傳代的匯合時(shí)期和可見(jiàn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞形成集落時(shí)培養(yǎng)瓶 表現(xiàn)出的血液類(lèi)似性、通過(guò)旋轉(zhuǎn)離心獲得血小板后血液組織的分離特性、離心后從紅細(xì)胞 分離有核細(xì)胞后骨髓分離物的形態(tài)(即膨脹的亮球狀、分散排列)。目標(biāo)培養(yǎng)物的可見(jiàn)觀察可由組織培養(yǎng)熟練技工現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，亦可通過(guò)數(shù)字顯微攝像 技術(shù)遠(yuǎn)距離進(jìn)行(現(xiàn)場(chǎng)錄像)，或者通過(guò)本文所述的生長(zhǎng)通道運(yùn)行期間用數(shù)字顯微攝像機(jī) 拍攝的更新圖像進(jìn)行。當(dāng)需要更多地有限控制多細(xì)胞培養(yǎng)部位時(shí)可進(jìn)行遠(yuǎn)距離細(xì)胞培養(yǎng)的 監(jiān)測(cè)。例如，從大量遠(yuǎn)距離培養(yǎng)物中由一位訓(xùn)練有素的專(zhuān)家提供可見(jiàn)數(shù)據(jù)。專(zhuān)家將獲得某種可見(jiàn)參數(shù)是否有效的信息，例如，特定細(xì)胞密度、培養(yǎng)模式或細(xì)胞形態(tài)，這些信息對(duì)膝關(guān) 節(jié)再生、穩(wěn)定非血管性壞死、愈合錯(cuò)位骨折等等提供了良好的臨床效果。然后專(zhuān)家會(huì)知道如 何將培養(yǎng)形態(tài)與所有此類(lèi)培養(yǎng)物聯(lián)系起來(lái)(可是即使大量的現(xiàn)場(chǎng)工作人員花費(fèi)數(shù)月乃至 數(shù)年時(shí)間也做不了這種關(guān)聯(lián)性分析)。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有均一的、非過(guò)度生長(zhǎng)等細(xì)胞 培養(yǎng)形態(tài)的細(xì)胞將被認(rèn)為是最佳狀態(tài)細(xì)胞，處于生長(zhǎng)通道內(nèi)，因而易被收集與傳代。本發(fā)明的血小板裂解組合物包括大量已知細(xì)胞分裂必要的生長(zhǎng)因子，其中包括 hFGF、PDGF-BB、TGF-0和VEGF。將血小板裂解組合物加入無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基使得培養(yǎng)基中 含有目標(biāo)數(shù)量的裂解物，例如，10%血小板裂解物包含10%體積的血小板組合物。在優(yōu)選實(shí) 施方案中無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM、Hams F12、MEM或其他類(lèi)似培養(yǎng)基。生長(zhǎng)因子的有效量 與患者血小板裂解物有關(guān)，并將隨著患者不同而變化。在典型的實(shí)施方案中，患者細(xì)胞最初培養(yǎng)在含10%血小板裂解物的培養(yǎng)基中孵育 7-10天，形成集落，然后重新計(jì)數(shù)(集落形成)。如果患者有骨關(guān)節(jié)炎，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至單層培 養(yǎng)中用初始弄度為10%的血小板裂解物培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)2-4天，將其與特定患者治療程序 所需要的細(xì)胞總數(shù)作比較。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞可進(jìn)行可見(jiàn)參數(shù)考察。上述不在生長(zhǎng) 通道內(nèi)的細(xì)胞將改變其培養(yǎng)基，增加血小板裂解物濃度(例如15-20% )，而處于生長(zhǎng)通道 內(nèi)的細(xì)胞將被繼續(xù)培養(yǎng)至少2-4天，然后再重復(fù)以上步驟。依賴(lài)于生長(zhǎng)通道條件的其他細(xì) 胞培養(yǎng)行為包括以更低或更高密度再次接種、更頻繁或更少更換培養(yǎng)基或者更遲或更早移 植細(xì)胞。注意可見(jiàn)參數(shù)亦可被用于確定細(xì)胞是否處于生長(zhǎng)通道內(nèi)(見(jiàn)上文)。注意MSC擴(kuò)增速率的可變性取決于患者收集的MSC和患者血小板內(nèi)生長(zhǎng)因子的 水平。因此，在某些情況下，需要更高水平的血小板裂解物來(lái)維持MSC處于生長(zhǎng)通道內(nèi)，這 不僅因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)特征，而且因?yàn)樾枰嗟难“辶呀馕锾峁┧杷降纳L(zhǎng)因子，也 就是說(shuō)，與其他血小板裂解物相比，患者的血小板裂解物可具有低濃度生長(zhǎng)因子，亦可含有 低濃度生長(zhǎng)因子。令人驚奇的是，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)確定，與同樣數(shù)量在非最佳條件(非生 長(zhǎng)通道)(例如需要15次傳代的細(xì)胞培養(yǎng)物具有足夠的數(shù)量實(shí)施需要的治療效果)得到生 長(zhǎng)的細(xì)胞相比，在最佳生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞可獲得更佳的療效。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與運(yùn) 用本文所述生長(zhǎng)通道方法在最佳條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，運(yùn)用10cc兩側(cè)PSIS骨髓抽取物 (總共20cc骨髓)在非最佳擴(kuò)增條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的臨床療效更差(MRI未見(jiàn)或極少 見(jiàn)明顯的軟骨再生，未見(jiàn)或極少見(jiàn)彎月面再生)。自體MSC置換的方法本文所述實(shí)施方案包括有需要的患者部位進(jìn)行恢復(fù)性治療的方法。例如，需要治 療的退化性椎間盤(pán)或關(guān)節(jié)軟骨的治療恢復(fù)其他實(shí)施方案包括MSC擴(kuò)增的應(yīng)用心肌再生、 皮膚創(chuàng)面愈合、骨折或骨錯(cuò)位愈合、神經(jīng)修復(fù)、宿主移植治療及其他免疫應(yīng)用和其他應(yīng)用， 置換胰島細(xì)胞、治療骨質(zhì)疏松、治療聽(tīng)力喪失及其他用途。本文所述的方法利用自體MSC進(jìn) 行恢復(fù)性治療，其中MSC用天然(非合成/非重組)生長(zhǎng)因子(典型地通過(guò)在不同濃度血 小板裂解物下培養(yǎng)而獲得)處理。最初，MSC來(lái)源從一位需要干細(xì)胞治療恢復(fù)患者體內(nèi)收集而獲得。獲得的MSC源 保持在無(wú)菌環(huán)境中，并在無(wú)菌條件下進(jìn)行整個(gè)操作過(guò)程。如上文所述，收集的細(xì)胞接種并在 維持細(xì)胞在生長(zhǎng)通道內(nèi)的條件下離體培養(yǎng)這是本發(fā)明的實(shí)施方案(MSC分離自上述MSC來(lái) 源)。這就要求血小板裂解物應(yīng)由患者按上述實(shí)施例1方法制備而獲得。對(duì)在最佳擴(kuò)增條件下生長(zhǎng)的自體MSC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，準(zhǔn)備在細(xì)胞進(jìn)行第10次傳代前實(shí)施移植術(shù)。細(xì)胞目標(biāo)產(chǎn)量 為1千萬(wàn)-1億個(gè)細(xì)胞(靶位點(diǎn)的細(xì)胞總數(shù)可被鑒定，見(jiàn)上文)。在某些實(shí)施方案中，自體 MSC在進(jìn)行第5次傳代前開(kāi)始培養(yǎng)并檢測(cè)其是否適合移植，其細(xì)胞目標(biāo)產(chǎn)量為1-4千萬(wàn)個(gè)細(xì) 胞。在其他實(shí)施方案中，自體MSC在進(jìn)行第6、7、8或9次傳代前開(kāi)始培養(yǎng)并檢測(cè)其是否適 合移植，其細(xì)胞目標(biāo)產(chǎn)量為1-4千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。隨后將制備的MSC組合物植入靶位點(diǎn)，并監(jiān)測(cè) 在接下來(lái)的幾個(gè)月中細(xì)胞的治療效果。這一過(guò)程是否需要重復(fù)取決于想要的療效。已經(jīng)在 導(dǎo)致在4-7次傳代中產(chǎn)生1-4千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的條件下經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞為最適于移植的細(xì)胞， 可移植于需要移植患者的靶位點(diǎn)。尤其是，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括用在最初集落形成和附著培養(yǎng)中分離 的骨髓有核細(xì)胞接種紅細(xì)胞的方法。由于紅細(xì)胞同樣含有生長(zhǎng)因子，這將進(jìn)一步豐富細(xì)胞 生長(zhǎng)的環(huán)境，并對(duì)分離的MSC具有其他分化效應(yīng)。注意此法的實(shí)施方案用自體細(xì)胞和生長(zhǎng)因子進(jìn)行，故避免了許多在其他非自 體MSC置換治療中出現(xiàn)的免疫感染問(wèn)題。由于最近研究證明，非自體MSC活化宿主的自 然殺傷細(xì)胞系統(tǒng)，故本發(fā)明在這點(diǎn)上具有顯著的優(yōu)勢(shì)。Spaggiari等，Blood，2006107 (4) 1484-90 ;Rasmusson 等，Transpantation，2003 76(8) :1208_13。這些實(shí)施方案還對(duì)移植 細(xì)胞在靶位點(diǎn)的擴(kuò)增及分化為所需細(xì)胞(關(guān)節(jié)表面的軟骨細(xì)胞、骨缺損中的成骨細(xì)胞等) 的潛能進(jìn)行了優(yōu)化。如下一個(gè)實(shí)施方案所述，血小板組合物(或者血小板本身)可通過(guò)注 射植入靶位點(diǎn)，同時(shí)或隨后進(jìn)入MSC移植程序。運(yùn)用本文所述的細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)施方案，制備可用于目標(biāo)患者的最佳生長(zhǎng)細(xì)胞。根據(jù) 本文所述的方法生長(zhǎng)的細(xì)胞用FACS進(jìn)行分析，確定細(xì)胞表型，即，確定細(xì)胞表面抗原。本發(fā) 明的一方面，篩選細(xì)胞群落并擴(kuò)增，使其至少表達(dá)下列一種或更多種表面抗原CD29、CD44、 ⑶59、⑶73，、⑶90、⑶105和⑶166。注意上述陽(yáng)性結(jié)果為至少有90%待測(cè)細(xì)胞通過(guò)鑒定 表達(dá)特定細(xì)胞表面抗原FACS分析表現(xiàn)為陽(yáng)性。在典型的實(shí)施方案中，相似細(xì)胞群落對(duì)至少兩種下列細(xì)胞表面抗原為陽(yáng)性CD29、 ⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。在更多的典型實(shí)施方案中，細(xì)胞群落對(duì)至少三種 下列表面抗原為陽(yáng)性⑶29、⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。在甚至更多的實(shí)施 方案中，細(xì)胞群落對(duì)至少四種下列表面抗原為陽(yáng)性⑶29、⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和 ⑶166。在甚至更多的實(shí)施方案中，細(xì)胞群落對(duì)至少五種下列表面抗原為陽(yáng)性⑶29、⑶44、 ⑶59、⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。最后，在某些實(shí)施方案中本文所述的細(xì)胞群落對(duì)⑶29、 ⑶44、⑶59、⑶73、⑶90、和⑶105中的六種或七種細(xì)胞表面抗原為陽(yáng)性。本文的實(shí)施方案 顯示，具有潛在表達(dá)這些細(xì)胞表面抗原能力的細(xì)胞最適合用于治療。此外，本文的實(shí)施方案 顯示，細(xì)胞群落含有上述細(xì)胞表面抗原，但卻缺乏下列至少一種抗原⑶14、⑶31、⑶45和 CD106。在其他實(shí)施方案中細(xì)胞群落具有上述表面抗原但缺乏下列至少兩種或更多種抗原 ⑶14、⑶31、CD45和CD106。在其他實(shí)施方案中細(xì)胞群落為陽(yáng)性，表達(dá)CD29、⑶44、⑶59、 CD73、CD90、CD105 和 CD166 等表面抗原，但不表達(dá) CD14、CD31、CD45 和 CD106。直接向靶位點(diǎn)注射血小板在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，血小板組合物被直接注射進(jìn)入患者靶位點(diǎn)。血小板 注射可在MSC置換術(shù)、聯(lián)用MSC置換術(shù)(同時(shí))之前或有助于優(yōu)化MSC生長(zhǎng)環(huán)境的MSC置 換后進(jìn)行。在典型的實(shí)施方案中，用本發(fā)明的血小板裂解物培養(yǎng)基和生長(zhǎng)通道條件擴(kuò)增的MSC被收集(當(dāng)時(shí)仍處于生長(zhǎng)生長(zhǎng)通道內(nèi))，并與自體血小板或血小板裂解物一起被注射入 靶位點(diǎn)。為了確定需要直接向靶位點(diǎn)注射的血小板的數(shù)目，可進(jìn)行下列運(yùn)算。首先需要確 定維持最大離體MSC生長(zhǎng)速率所需要的平均血小板數(shù)/cc。例如，如果患者細(xì)胞顯示需要 10%血小板裂解物培養(yǎng)3天，20%裂解物培養(yǎng)3天和30%裂解物培養(yǎng)3天，運(yùn)用最高的血小 板裂解物濃度確定靶位點(diǎn)需要補(bǔ)充血小板的數(shù)目。每天每cc血小板的最大利用率在該實(shí) 施例中為30% (三天)。如果每cc血小板的起始體積為1.0X109，那么需要的條件為，在 這個(gè)時(shí)間段3天內(nèi)每cc體積消耗3X 108個(gè)血小板，或每天每cc消耗1 X 108個(gè)血小板。Marineau 等，Biomaterials，200425(l8) :p 4489_502 (并入本文參考文獻(xiàn))提供 通過(guò)血小板生長(zhǎng)因子釋放促進(jìn)體內(nèi)MSC生長(zhǎng)所需要的凝血酶與鈣水平檢測(cè)方法。這是促進(jìn) 組織生長(zhǎng)和血管生成的第一周自然發(fā)生的事件。從這些研究可以推測(cè)，血小板一經(jīng)凝血酶 和鈣經(jīng)7天培養(yǎng)活化就會(huì)釋放大多數(shù)生長(zhǎng)因子。因此，每天每cc 1X108個(gè)血小板被擴(kuò)增7 倍，每cc最終需要量為7X 108個(gè)血小板?；颊叩淖罱K注射體積被加入初始關(guān)節(jié)滑液容積 (IFJV)，獲得最終關(guān)節(jié)滑液容積(FFJV)。因此，運(yùn)用上述運(yùn)算，每cc 7X108個(gè)血小板被擴(kuò) 增12.5倍，產(chǎn)生8.75乂109個(gè)血小板。這個(gè)數(shù)目表示最終血小板劑量(見(jiàn)公式1)(維持MSC生長(zhǎng)的每cc消耗的平均血小板數(shù)/培養(yǎng)基更換之前維持這個(gè)水平的天 數(shù))X (培養(yǎng)基更換之前需要維持這個(gè)水平的天數(shù)(7)(最終關(guān)節(jié)滑液容積))=PHC血小 板劑量。(公式⑴)。或者，這種補(bǔ)充可用血小板裂解物等同物進(jìn)行，直至促進(jìn)擴(kuò)增、調(diào)整關(guān)節(jié)容積和更 頻繁補(bǔ)充所需的最高離體血小板裂解物百分比濃度。MSC移植的位點(diǎn)監(jiān)測(cè)本文所述的移植細(xì)胞可被監(jiān)測(cè)，以保證這些細(xì)胞在體內(nèi)存活，并最終使這些細(xì)胞 分化為需要的細(xì)胞類(lèi)型，獲得所需的修復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行MRI標(biāo)記實(shí)現(xiàn)患者靶位 點(diǎn)的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)(但是，注意這一程序需要磁性粒子，且只提供細(xì)胞定位、細(xì)胞擴(kuò)增或分化狀 態(tài)等信息)。因此優(yōu)選實(shí)施實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)。移植了優(yōu)化擴(kuò)增的細(xì)胞后，從植入位點(diǎn)進(jìn)行經(jīng)皮液 體洗滌。獲得自由漂浮細(xì)胞和最小粘附MSC后進(jìn)行MSC(如果有)計(jì)數(shù)、細(xì)胞類(lèi)型、分化狀 態(tài)及形態(tài)等分析，以及MSC增殖狀態(tài)的分析。關(guān)節(jié)洗滌亦可進(jìn)行監(jiān)測(cè)或分析關(guān)鍵物質(zhì)如粘 多糖表達(dá)、主要蛋白、基因表達(dá)或其它表明關(guān)節(jié)微環(huán)境改善的重要化學(xué)物質(zhì)或遺傳標(biāo)記?？蛇M(jìn)行兩種類(lèi)型的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)靶位點(diǎn)滑液隨機(jī)取樣和/或位點(diǎn)滑液的高壓“敲 除”。運(yùn)用針或?qū)Ч?典型相當(dāng)于14-22注射器(gauge))進(jìn)行高壓敲除，其中高壓液體從 敲除最少的粘附MSC處流下?；蛘?，亦可用針形關(guān)節(jié)鏡或者傳統(tǒng)關(guān)節(jié)鏡獲得組織樣品進(jìn)行分析。在MSC被移植之前(形成一個(gè)與后續(xù)樣品作比較的樣品)于基底處進(jìn)行經(jīng)皮取 樣。取樣亦可在MSC植入靶位點(diǎn)后1周、可能2周及可能3周進(jìn)行。特別是，移植后一周時(shí)，進(jìn)行關(guān)節(jié)洗滌或者組織取樣，進(jìn)行觀察分析。盡管可以認(rèn) 為，細(xì)胞群落可離體很容易檢查，并無(wú)需體內(nèi)取樣即可被調(diào)整為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，但是在體內(nèi)卻 無(wú)法進(jìn)行同樣的必需調(diào)整保證體內(nèi)生長(zhǎng)和移植。然而，在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上，靶位點(diǎn)群落和 /或血小板裂解物濃度補(bǔ)充的改變卻能實(shí)施。這個(gè)程序是否需要重復(fù)因需要而定。此外，可向靶位點(diǎn)植入額外的自體培養(yǎng)MSC。最后，一旦確定移植MSC存活且能增殖或者關(guān)節(jié)微環(huán)境適于細(xì)胞存活和移植，即 可給靶位點(diǎn)加入分化促進(jìn)劑。此外，經(jīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)獲得的細(xì)胞可在不同分化促進(jìn)劑存在條件 下培養(yǎng)，以確定哪一種最適合獲得要求療效。代表性的促進(jìn)劑包括成骨蛋白2、地塞米松、透 明質(zhì)酸及類(lèi)似物。此外，炎癥細(xì)胞在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中恢復(fù)時(shí)，可在處理中加入抗炎藥物，在發(fā)生 脫水部位加入透明質(zhì)酸。此外，運(yùn)用試驗(yàn)方法可監(jiān)測(cè)細(xì)胞移植后體內(nèi)狀況，看是否發(fā)生繼發(fā)性組織再生效 應(yīng)如產(chǎn)生粘多糖(GAG)、已知退化性酶及其他因子水平降低。本發(fā)明這一部分的重點(diǎn)在于移 植后對(duì)細(xì)胞的直接或間接監(jiān)測(cè)。而且，這使我們能獲得移植后的實(shí)時(shí)變化信息，確保細(xì)胞存 活及移植成功和分化功能正常。作為一個(gè)代表性的例子，MSC—旦分化為早期軟骨細(xì)胞即 可進(jìn)行GAG產(chǎn)生監(jiān)測(cè)，保證其功能完全，使其分化為成熟的健康的軟骨細(xì)胞生物等效物。此 外，某些促進(jìn)分化的或補(bǔ)充的物質(zhì)可能監(jiān)測(cè)的被導(dǎo)入關(guān)節(jié)，以便增強(qiáng)被監(jiān)測(cè)的GAG產(chǎn)生。同 樣的例子亦能適用于組織再生的其他區(qū)域，例如體內(nèi)由MSC分化為胰島細(xì)胞過(guò)程中胰島細(xì) 胞的置換和胰島素合成的監(jiān)測(cè)。治療應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物可用于治療，也就是說(shuō)，修復(fù)和維持需要MSC的患者的靶 組織?？捎帽疚乃龅膶?shí)施方案治療的疾病包括骨關(guān)節(jié)炎、退行性椎間盤(pán)病，固定骨骼非血 管性壞死部位、愈合骨折或骨錯(cuò)位、心肌再生、連接修復(fù)、皮膚創(chuàng)面愈合、神經(jīng)修復(fù)、免疫抑 制或調(diào)節(jié)的細(xì)胞治療、0 -胰島細(xì)胞置換、聽(tīng)力細(xì)胞與結(jié)構(gòu)的置換、治療骨質(zhì)疏松、和其他功 能紊亂癥，在這些情況下MSC可分化為可修復(fù)并置換受損、缺失或退化的細(xì)胞。
實(shí)施例下列例子旨在解釋而非專(zhuān)門(mén)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 與生長(zhǎng)通道相關(guān)的患者M(jìn)SC生長(zhǎng)通道從患者后髖嵴處收集有核細(xì)胞，并用離心法從RBC中分離(血清呈濃度梯度)。從靶患者處收集大約10ml骨髓，再轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的15ml離心管中。骨髓 樣品以100g離心2-3分鐘。檢查RBC沉淀，確保這批RBC中半數(shù)樣品生長(zhǎng)緩慢，且清晰區(qū) 位于RBC沉淀與頂部級(jí)分區(qū)之間。注意，如果頂部級(jí)分不到總體積的40-50%，需要重復(fù)離 心操作。又然后去掉頂部級(jí)分區(qū)置于15ml離心管中，以1000g離心10分鐘。注意，有核細(xì) 胞沉淀可能呈現(xiàn)紅色，也許是包裝松散所致，這取決于所存在RBC的數(shù)目。去掉血清上清， 重新加入RBC沉淀中。用lml鹽溶液重懸有核細(xì)胞沉淀。重復(fù)上述步驟直至獲得另外的有 核細(xì)胞。按1 20用水稀釋細(xì)胞懸液后(裂解RBC)進(jìn)行有核細(xì)胞的計(jì)數(shù)。用1 2000 稀釋液對(duì)RBC進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后接種有核細(xì)胞進(jìn)行單層培養(yǎng)。每cm2接種約0. 66-1. 25X 106個(gè)有核細(xì)胞和 0. 16X109RBC(用來(lái)自RBC懸液的細(xì)胞將RBC補(bǔ)加到有核細(xì)胞懸液中)。將組合的細(xì)胞混合 液以1000g離心10分鐘，再用DMEM+Cipro+肝素+10%血小板裂解物(10%被選作初始劑 量，這是基于Doucet所述的5%裂解物可使細(xì)胞擴(kuò)增處于明顯的次級(jí)優(yōu)化狀態(tài)這一事實(shí)) 重懸。然后將細(xì)胞懸液于37°C保溫30分鐘。將保溫的細(xì)胞懸液平鋪于一個(gè)大小合適的組織培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)物在5%二氧化碳、37°C孵育7-12天。如圖1所示，來(lái)自八位患者M(jìn)SC的生長(zhǎng)在上述條件下進(jìn)行，并作細(xì)胞數(shù)目對(duì)天數(shù)的 生長(zhǎng)功能曲線(xiàn)圖。一個(gè)可接受的生長(zhǎng)通道已經(jīng)與細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增相重疊。在第7天，Gi細(xì)胞 數(shù)量充足，最適于移植，第8天時(shí)，St細(xì)胞充足，適于移植，第10天時(shí)，C1細(xì)胞充足，適于移 植。所有其他細(xì)胞均未在可接受的生長(zhǎng)速率內(nèi)，需要增加培養(yǎng)基中血小板裂解物的濃度，保 證最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。t施例2 患者M(jìn)SC牛長(zhǎng)依賴(lài)干患者彳律康狀況從患有骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體收集MSC，按照實(shí)施例1所述使其生長(zhǎng)。每位患者細(xì)胞的生 長(zhǎng)速率和整體產(chǎn)率均得到測(cè)定。收集的MSC在不同含量血小板裂解物(5-10% )中生長(zhǎng)，并對(duì)11天的過(guò)程作圖 (500%患者原血小板濃度，并通過(guò)冷凍法裂解)。圖2中的圖表數(shù)據(jù)顯示，MSC產(chǎn)率和生長(zhǎng) 速率發(fā)生了顯著變化。本實(shí)施例說(shuō)明不同患者間細(xì)胞生長(zhǎng)存在差異，需要優(yōu)化MSC生長(zhǎng)速率。實(shí)施例3 在優(yōu)化MSC牛長(zhǎng)條件下，5%血小板裂解物無(wú)效。如實(shí)施例1所述，從骨關(guān)節(jié)炎患者收集的MSC(緩慢生長(zhǎng)MSC)，用5 %血小板裂 解物、10%血小板裂解物或20%血小板裂解物進(jìn)行MSC擴(kuò)增。如圖3A-E所示，與生長(zhǎng)在 10-20%裂解物中的細(xì)胞比較，許多用5%血小板裂解物生長(zhǎng)的細(xì)胞系不能表現(xiàn)出最大擴(kuò)增 速率。注意，對(duì)于大多數(shù)在20%裂解物下生長(zhǎng)的細(xì)胞系與10%裂解物相比只表現(xiàn)出最小的 擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)。然而，必須強(qiáng)調(diào)的是，我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，OA患者的擴(kuò)增速率變化極大，有幾 位患者能在5%裂解物條件下達(dá)到生長(zhǎng)通道要求，大多數(shù)為10%，還有一些患者需要20% 裂解物。此外，患有其他疾病如非血管性股骨頭壞死的患者細(xì)胞在甚至10%裂解物存在時(shí) 都不擴(kuò)增，需要作多重的變動(dòng)，由實(shí)驗(yàn)規(guī)程決定(看下文實(shí)施例)。圖4進(jìn)一步說(shuō)明，從骨關(guān)節(jié)炎患者收集的MSC通常需要高濃度血小板裂解物(10% +)才能獲得最佳擴(kuò)增狀態(tài)。但是，健康個(gè)體的MSC具有正常的生長(zhǎng)，在5%或10%血小板裂 解物下很少表現(xiàn)出變化。本實(shí)施例中的數(shù)據(jù)表明，Doucet等所述的條件在骨關(guān)節(jié)炎患者收集的細(xì)胞條件下 不產(chǎn)生最佳擴(kuò)增狀態(tài)。需要更高濃度裂解物表現(xiàn)出最佳擴(kuò)增狀態(tài)。然而，在細(xì)胞收集為快速生長(zhǎng)型細(xì)胞條件下，細(xì)胞可在5或10%血小板裂解物條 件下生長(zhǎng)。實(shí)施例4 5位患者的圖示生長(zhǎng)通道5位患者捐獻(xiàn)MSC并按實(shí)施例1中收集方法收集。用不同的裂解物濃度使細(xì)胞生 長(zhǎng)，并計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)據(jù)如圖5所示，本發(fā)明的生長(zhǎng)通道被重疊。在細(xì)胞生長(zhǎng)通 道參數(shù)內(nèi)能夠擴(kuò)增的細(xì)胞被認(rèn)為是最適于且已準(zhǔn)備好用于臨床目標(biāo)者，可是5位患者的細(xì) 胞生長(zhǎng)產(chǎn)率很低，臨床治療成功率也最小。因此，基于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的血小板裂解物應(yīng) 當(dāng)用于在所述的生長(zhǎng)通道內(nèi)獲得細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，基于細(xì)胞密度的已經(jīng)介紹的細(xì)胞培養(yǎng)決 定因素細(xì)胞培養(yǎng)模式和形態(tài)也需要得到應(yīng)用。實(shí)施例5 細(xì)胞在生長(zhǎng)通道參數(shù)內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)MSC表達(dá)細(xì)胞表面抗原收集MSC并用本文實(shí)施方案所述和實(shí)施例1和實(shí)施例2中所述的方法擴(kuò)增細(xì)胞， 為了確定培養(yǎng)細(xì)胞的表型，將其與熒光標(biāo)記單克隆抗體(mAbs) —起孵育，該單抗為針對(duì)已知細(xì)胞表面抗原的單抗(表1和表2列出了所用的MAbs)。用FACSCalifur流式細(xì)胞儀對(duì)來(lái)自2位受試者培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平 進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。表1: 表2: 表1顯示每個(gè)靶細(xì)胞表面抗原的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。表2列出了每個(gè)細(xì)胞表面 抗原的陽(yáng)性百分率值。如表2所示，對(duì)于移植入目標(biāo)患者而優(yōu)化的細(xì)胞有大于99%的表達(dá) CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD105 和 CD166。相反地，很少有細(xì)胞表達(dá) CD14、CD31、CD45 和CD106，而一般認(rèn)為這些表面抗原不出現(xiàn)在具有最佳移植能力的細(xì)胞表面。實(shí)施例6 運(yùn)用本文實(shí)施方案講行的MSC移棺提供體內(nèi)軟骨細(xì)胞置換從一位57歲需要進(jìn)行軟骨置換糾正膝關(guān)節(jié)缺損的患者獲得一份骨髓樣品。收集 骨髓，然后用實(shí)施例1所述的方法分離MSC。細(xì)胞生長(zhǎng)在10-20%血小板裂解物上，經(jīng)過(guò)6 次傳代獲得了 1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞維持在本發(fā)明的生長(zhǎng)通道內(nèi)。然后用自體MSC將細(xì) 胞植入靶位點(diǎn)。圖6(A與B)顯示矢狀面快速自旋質(zhì)子密度3. 0T MRI圖像。圖A顯示一側(cè)股骨骨 節(jié)后方承重面的軟骨缺損。39天后重新拍攝圖像，發(fā)現(xiàn)軟骨缺損已經(jīng)被填充(如圖6B所 示)。本實(shí)施例的數(shù)據(jù)顯示，運(yùn)用本文所述的方法和組合物可有效糾正靶位點(diǎn)的軟骨缺損。實(shí)施例7更高水平血小板裂解物的時(shí)機(jī)可通過(guò)增加細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力使生長(zhǎng)緩慢型MSC符合生長(zhǎng)通道目標(biāo)下列實(shí)施例說(shuō)明，在離體擴(kuò)增期間改變血小板裂解物濃度會(huì)極大改善MSC產(chǎn)率。 20%血小板裂解物濃度(“裂解物激發(fā)劑(boost)”)用于在細(xì)胞突出于集落形成結(jié)構(gòu)表面 時(shí)細(xì)胞的初始擴(kuò)增。對(duì)4位患者的細(xì)胞群落進(jìn)行了測(cè)試，分別用符號(hào)Re、Gi、Ve和Ca。對(duì) 生長(zhǎng)條件進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如表3和圖7所示。在表3列出的4位患者中，注意對(duì)于Gi和Ve，其MSC在每一次傳代的生長(zhǎng)期數(shù)目 成倍增加，生長(zhǎng)狀況得到了明顯改善。對(duì)于受試者Gi，當(dāng)運(yùn)用20%的裂解物激發(fā)劑時(shí)，每次 傳代的細(xì)胞數(shù)增加倍數(shù)總和從9. 74增至12. 96。對(duì)于Re這個(gè)數(shù)值則從6. 88幾乎翻倍增至 10.34。需要注意的是，兩位患者均在用MSC進(jìn)行靶位皮膚表觀和再生性治療(均被診斷患有骨關(guān)節(jié)炎(OA)，年齡分別為50多歲和60多歲)。對(duì)于年輕的受試者Ve (無(wú)已知的OA)， 每一次傳代的細(xì)胞增加倍數(shù)總數(shù)只是稍有改善(5. 0到5. 7)。在最年長(zhǎng)的70多歲并有重度 多關(guān)節(jié)OA的受試者中，其測(cè)定值也只有中等程度的改善(5. 08到5. 13)。由于4位受試者中有兩位有明顯的產(chǎn)率改善，其他兩位產(chǎn)率未見(jiàn)降低，只是稍有 改善，提示本文所述方法和組合物可有效改善需要進(jìn)行再生治療的OA患者試驗(yàn)組的MSC產(chǎn) 率。t施例8 需要MSC移棺的患者的細(xì)胞』牛長(zhǎng)條件從患有非血管性壞死的44歲白人女性患者提取10cc PSIS骨髓抽取物，將其細(xì)胞 按本發(fā)明的方法進(jìn)行處理。她的有核細(xì)胞產(chǎn)率很低，用10%裂解物生長(zhǎng)于單層培養(yǎng)中，但 是傳代兩次以上時(shí)就不再擴(kuò)增了。重新召回該患者，對(duì)骨髓抽取技術(shù)做了改進(jìn)，從其左右側(cè) PSIS取3小份骨髓，然后當(dāng)其還處在集落形成階段時(shí)用20%裂解物激發(fā)細(xì)胞，再放在20% 裂解物中生長(zhǎng)。圖8顯示兩次細(xì)胞擴(kuò)增圖，從中可看出，許多患有這種疾病的患者需要改進(jìn) 骨髓抽取技術(shù)來(lái)改善有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，還需要集落形成期間的裂解物激發(fā)劑和單層培養(yǎng)擴(kuò)增 期加入更高濃度的血小板裂解物。實(shí)施例9 本發(fā)明細(xì)胞的盲接灃射伴有9個(gè)月之久的肱骨骨折的37歲白人女性患者曾用開(kāi)放減壓與外部固定術(shù)和 骨刺激劑治療。這種骨折表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)位，如圖10a所示。從患者PSIS提取lOOcc骨髓 抽取物，其MSC分離后在10 %血小板裂解物中生藏。隨后，將這些細(xì)胞在熒光顯微鏡導(dǎo)弓I下 通過(guò)一根無(wú)菌套管針經(jīng)皮植入骨折錯(cuò)位部位。圖10b顯示注射細(xì)胞后5周錯(cuò)位部位明顯愈 合。該實(shí)施例說(shuō)明用本發(fā)明技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增的MSC在體內(nèi)具有骨生成能力。實(shí)施例10 膝關(guān)節(jié)軟骨置換患有重度膝蓋中腔退行性疾病的43歲白人男性患者表現(xiàn)出中前彎月面明顯有退 行性病變。圖11A顯示3.0T質(zhì)子密度矢狀面MRI圖像，其中明顯退化的中部彎月面幾乎從 前方全部缺損。圖11B為經(jīng)皮植入MSC后3個(gè)月的圖片，該MSC按照本文所述的生長(zhǎng)通道 方法獲得并進(jìn)行了擴(kuò)增。圖11B顯示彎月面的再生以及后續(xù)的3-D圖像容積分析結(jié)果，可 看出彎月面容積增加了 32.5%。注意，彎月面再生發(fā)生在彎月面內(nèi)部，即眾所周知的“白” 或“非血管”區(qū)。因?yàn)檫M(jìn)行了這一移植術(shù)，血管被引入了這一區(qū)域。這是該特異細(xì)胞系所具 有的性質(zhì)，或極有可能是由于血小板裂解物注射在細(xì)胞移植后賦予關(guān)節(jié)的特性。例如，眾所 周知，血小板裂解物具有顯著的VEGF水平，可引起新血管生成。表3 每次傳代時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)的增加倍數(shù) 盡管已參考許多實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了特別地描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理 解對(duì)于本文所公開(kāi)的實(shí)施方案的形式和細(xì)節(jié)可以進(jìn)行變化而不離開(kāi)本發(fā)明的范圍和主旨， 并且本文所公開(kāi)的各種實(shí)施方案并不為了作為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。本文含有許多對(duì)專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物的引用，通過(guò)參照將它們均并入本文。
權(quán)利要求
用MSC移植治療患者的方法，該方法包括從患者獲得MSC；從患者獲得血小板；從患者的血小板制備血小板裂解物，其中制備含有一定量患者的血小板裂解物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；用所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)增MSC；以及在有此需要的部位，將擴(kuò)增的自體MSC植入患者。
2.權(quán)利要求1的方法，其還包括在移植擴(kuò)增的MSC后，對(duì)患者的靶部位進(jìn)行體內(nèi)監(jiān)測(cè)。
3.權(quán)利要求1的方法，其還包括在移植擴(kuò)增的自體MSC的過(guò)程中或之后，將血小板或血 小板裂解物直接注射到患者的靶修復(fù)位點(diǎn)，以進(jìn)一步促進(jìn)MSC擴(kuò)增。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有血小板裂解物的培養(yǎng)基包含5體積％到30體積％ 的血小板裂解物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述MSC被擴(kuò)增以在離體第十次傳代之前具有最佳生長(zhǎng)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述MSC被擴(kuò)增以在離體第七次傳代之前具有最佳生長(zhǎng)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為退化的椎間盤(pán)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為心肌。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為天然神經(jīng)元。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述有此需要的部位為退化的關(guān)節(jié)。
11.權(quán)利要求3的方法，其中通過(guò)最大化離體MSC擴(kuò)增所需的裂解物濃度測(cè)定所注射血 小板或裂解物的濃度。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者是已經(jīng)被診斷患有骨關(guān)節(jié)炎的患者。
13.用于離體擴(kuò)增MSC的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和大約5% 大約30 %的血小 板裂解物。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述血小板裂解物為大約10% 大約20%。
15.權(quán)利要求13的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述血小板裂解物對(duì)于MSC是自體的。
16.權(quán)利要求13的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中在MSC擴(kuò)增期間中的某些時(shí)候，使用更高濃度的裂 解物以使產(chǎn)率最大化。
17.用于擴(kuò)增細(xì)胞的生長(zhǎng)通道，其中所述細(xì)胞可用于植入患者，所述生長(zhǎng)通道包括某些 參數(shù)，用于保證患者的細(xì)胞在從患者取出后的十次傳代內(nèi)可以被擴(kuò)增并移植，其中一個(gè)參 數(shù)是用于擴(kuò)增細(xì)胞的血小板裂解物的水平。
18.權(quán)利要求1的方法，其中非自體供體提供MSC和血小板裂解物用于擴(kuò)增。
19.生長(zhǎng)通道，其用于MSC擴(kuò)增以?xún)?yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)率。
20.權(quán)利要求2的方法，其中從體內(nèi)監(jiān)測(cè)獲得的數(shù)據(jù)被用于調(diào)整體內(nèi)補(bǔ)充，以?xún)?yōu)化位點(diǎn) 的修復(fù)。
21.分離的人MSC群，其包含已經(jīng)就下列細(xì)胞表面抗原進(jìn)行富集的細(xì)胞⑶29、⑶44和 CD59。
22.權(quán)利要求21的分離的人MSC群，其中所述細(xì)胞還包括⑶73。
23.權(quán)利要求21的分離的人MSC群，其中所述細(xì)胞還包括⑶73和⑶90。
24.權(quán)利要求21的分離的人MSC群，其中所述細(xì)胞還包括⑶73、⑶90和⑶105。
25.權(quán)利要求21的分離的人MSC群，其中所述細(xì)胞還包括⑶73、⑶90、⑶105和⑶166。
26.權(quán)利要求17的方法，其中所述參數(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)接種密度、更換培養(yǎng)基前的細(xì)胞培 養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長(zhǎng)模式。
27.權(quán)利要求1的方法，其中用于治療退化區(qū)的MSC的劑量為100萬(wàn)到1億個(gè)細(xì)胞。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述骨髓抽取技術(shù)包括提取多份l-10ml抽取物，以激發(fā) MSC產(chǎn)率。
29.權(quán)利要求1的方法，其中紅細(xì)胞用于初始集落形成培養(yǎng)，以改善本文所述的特異性 MSC表型的附著和集落形成。
30.權(quán)利要求2的方法，其中所述體內(nèi)監(jiān)測(cè)包括通過(guò)外科手術(shù)、關(guān)節(jié)鏡和/或經(jīng)皮途徑 直接觀察正被處理的區(qū)域。
31.權(quán)利要求2的方法，其中所述體內(nèi)監(jiān)測(cè)包括取出粘附和非粘附細(xì)胞，用于離體觀察。
32.權(quán)利要求2的方法，其中所述體內(nèi)監(jiān)測(cè)包括次生化學(xué)物質(zhì)或細(xì)胞產(chǎn)物如粘多糖、 酶、蛋白質(zhì)、肽、多肽和脂類(lèi)的檢驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于優(yōu)化擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞以及將其植入有此需要的患者的組合物和方法。對(duì)于需要MSC的患者是自體的間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)被收獲、擴(kuò)增，其在新型生長(zhǎng)參數(shù)內(nèi)，并且在位于患者血小板上的自體生長(zhǎng)因子的影響下。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101878297SQ200880105820
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日
發(fā)明者C·J·岑特諾, C·克奧罕 申請(qǐng)人:再生科學(xué)有限責(zé)任公司