專利名稱：一種耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表達基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及對黑曲霉來源的新型耐高糖^ -葡萄糖苷酶Bgl4基因克隆和重組表達及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
P -葡萄糖苷酶(P-glucosidase, EC 3. 2.1. 21)屬于外切水解酶類，又稱3-D-葡萄糖苷水解酶，是ー類在親核分子間催化轉(zhuǎn)移糖苷的酶，可以在短鏈的寡糖或纖維ニ糖內(nèi)部、在帶有芳香基團或烷基的碳水化合物的殘基之間打斷￠-1,4-糖苷鍵，因而被廣泛應(yīng)用纖維素水解等領(lǐng)域(Science 311:484-489.)。纖維素作為綠色植物光合作用所產(chǎn)生的主要生物有機體之一，與半纖維素和木質(zhì)素一起作為植物的支撐組織隨著農(nóng)林廢棄物不斷再生，是地球上最豐富的可再生能源。在纖維素水解過程中，3 -葡萄糖苷酶通常不與纖維素直接作用，但是它可以降解對纖維素水解起強烈抑制作用的纖維ニ糖，同時隨著水解液中葡萄糖含量的増加，同樣也會對￠-葡萄糖苷酶產(chǎn)生強烈的抑制作用。所以發(fā)掘具有高葡萄糖耐受能力3-葡萄糖苷酶補充到現(xiàn)有的纖維素水解酶系中是提高酶解效率的有效方法之一。^ -葡萄糖苷酶來源相當廣泛，在植物、動物和微生物都能分離純化出來，而其中曲霉屬被認為是最優(yōu)良菌種，尤以黑曲霉的產(chǎn)量最高。大部分曲霉屬菌株能分泌多種組分的3 -葡萄糖苷酶，其酶學性質(zhì)也各不相同，如A. tubingensis通過不同的培養(yǎng)條件至少有4種￠-葡萄糖苷酶被純化和定性。按照￠-葡萄糖苷酶對葡萄糖的耐受カ分類，￠-葡萄糖苷酶可分為耐高糖和不耐高糖兩種，分別為(a)分子量為130_100kDa的屬于水解酶家族3的3 -葡萄糖苷酶，其分泌較多，活性較高，但其活性受葡萄糖抑制(耐葡萄糖的系數(shù)Ki一般不超過30mM) ； (b)另ー種分子量為40-55kDa的P -葡萄糖苷酶，其分泌較少，活性較低，但能耐受高濃度的葡萄糖，比如來源于A.niger CCRC31494的分子量為49kDa的￠-葡萄糖苷酶，其耐葡萄糖的K i為543mM，來源于A. oryzae的分子量為43kDa的P -葡萄糖苷酶，其耐葡萄糖的 Ki 為 1360mM (Applied Environmemt Microbiology,64:3607-3614.)。雖然有曲霉來源的耐高糖的3 -葡萄糖苷酶被純化，但是相關(guān)的基因還沒有文獻報道。本發(fā)明從黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)發(fā)酵液中分離得到ー種新型的耐高糖的葡萄糖苷酶，且具有極其優(yōu)良的葡萄糖耐受能力(Ki值達到2mol/L)，完全可以滿足在現(xiàn)有的纖維素降解體系中對3 -葡萄糖苷酶葡萄糖耐受能力的要求，經(jīng)過蛋白純化和蛋白質(zhì)測序，得到了其N端序列，經(jīng)過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其屬于GH72家族，至今未有報道發(fā)現(xiàn)該家族存在能夠水解￠-1,4-糖苷鍵的￠-葡萄糖苷酶。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)在纖維素降解技術(shù)中P -葡萄糖昔酶無法耐受聞濃度匍萄糖的從而造成生廣成本提聞的問題，進而提供一種耐聞糖的^ -葡萄糖苷酶Bgl4及其表達基因和應(yīng)用。
技術(shù)方案一種耐高糖的P -葡萄糖苷酶Bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述耐高糖的P -葡萄糖苷酶Bgl4的表達基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所
/Jn o包含上述核苷酸序列的重組質(zhì)粒。包含上述核苷酸序列的重組質(zhì)粒pPICZ a A_Bgl4。包含SEQ ID NO. 2所述基因序列的重組質(zhì)粒的制備方法，步驟為(I)設(shè)計引物Pl和P2,以黑曲霉菌株Aspergillus niger的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以Pl和P2為引物進行PCR擴增，得到耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4基因的PCR擴增產(chǎn)物，所述引物為Pl :5’ -CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3’,下劃線表示 EcoR I 位點；P2 :5’ -GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3，,下劃線表示 Xba I 位點；(2)將步驟(I)所得PCR擴增產(chǎn)物與pMD-19T克隆載體在16°C下過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有耐高糖P -葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pMD-19T-Bgl4 ；(3)通過對Bgl4全序列翻譯得到的蛋白序列進行預測并去除信號肽，設(shè)計去信號肽引物 P3 :5’-CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3，,下劃線表示 EcoR I 位點，以 P3 和 P2為引物，模板為pMD-19T-Bgl4進行PCR擴增，得到去除信號肽的Bgl4基因片段；(4)將步驟(3)所得的PCR擴增產(chǎn)物和pPICZ a A分別用EcoR I和Xba I雙酶切，并分別割膠回收，過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得耐高糖￠-葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒 pPICZaA_Bgl4。包含上述的重組質(zhì)粒的畢赤酵母宿主細胞。包含重組質(zhì)粒pPICZ a A-Bgl4的重組畢赤酵母表達重組酶，將重組質(zhì)粒pPICZ a A-Bgl4通過Bin I線性化之后電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母宿主菌GSl 15中通過添加有不同濃度梯度博萊霉素的YPD平板來篩選出多拷貝的轉(zhuǎn)化子，使用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移到BMMY培養(yǎng)基中以每24h添加0. 5%wt的甲醇進行誘導表達，收集上清液即為耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4的酶液。所述耐高糖的P -葡萄糖苷酶Bgl4在纖維素降解中的應(yīng)用。具體方案內(nèi)容為包括相關(guān)基因的克隆、基因的重組表達和酶的定性。1.對得到的黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)耐高糖P _葡萄糖苷酶的蛋白進行N端測序，再用測出的N端序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)全基因組數(shù)據(jù)庫中比對得到其基因序列，根據(jù)得到的基因序列設(shè)計引物，以黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)的 cDNA 為模板進行 PCR,獲得黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)耐高糖P-葡萄糖苷酶的全基因序列；2.對得到的全基因序列進行分析，通過設(shè)計引物去除信號肽，并克隆到酵母的表達載體pPICZ a A,得到重組質(zhì)粒pPICZ a A-Bgl4 ；3.將重組質(zhì)粒pPICZaA_Bgl4通過Bin I線性化之后電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母宿主菌GS115中通過添加有不同濃度梯度博萊霉素的YPD平板來篩選出多拷貝的轉(zhuǎn)化子，使用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移到BMMY培養(yǎng)基中以每24h添加0. 5%的甲醇進行誘導表達，收集上清液即為耐高糖3-葡萄糖苷酶的酶液。有益效果本發(fā)明首次克隆并重組表達了黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)耐高糖￠-葡萄糖苷酶Bgl4的基因，重組酶Bgl4的耐葡萄糖系數(shù)Ki為2mol/L。


圖1表示重組耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4最適反應(yīng)pH值；圖2表示重組耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4最適反應(yīng)溫度；圖3表示重組耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4的Ki系數(shù)。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli) ToplOF’ ；pMD_19T克隆載體試劑盒，限制性內(nèi)切酶、修飾酶、連接酶等(購自Takara公司)；pPICZ a Avector (購自Invitrogen公司)、p-NPG購自Sigma公司。實施例1.黑曲霉菌株(Aspergillus niger)總RNA的獲得1.1 黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的培養(yǎng)黑曲霉菌株(Aspergillus niger)可以從自然界中篩選獲得，也可以從商業(yè)途徑購買得到(例如可以購自中國エ業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。黑曲霉菌株(Asp ergillus, niger)的培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L、K2HPO4 3H20lg/L，KCl 0. 5g/L，MgSO4O. 5g/L，F(xiàn)eSO4O. Olg/L, NaNO3O. 2g/L，pH 調(diào)至 4. 8，接種新鮮的黑曲霉孢子懸液，37°C下180rpm培養(yǎng)3_4天過濾收集菌絲體。1. 2 黑曲霉菌株(Aspergillus niger)總 RNA 的提取取收集的黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)的菌絲體用PBS緩沖溶液清洗一次后，用在液氮下研磨菌絲體至粉末狀，收集到2mL離心管中，加入ImL Trizol后劇烈震蕩，4°C下12000g離心IOmin后轉(zhuǎn)移上清液至2mL離心管加入200 u L氯仿震蕩15s混勻后30°C下孵育2-3min，4°C下12000g離心IOmin取上層清夜，加入0. 8倍體積異丙醇混勻后4°C下12000g離心lOmin，去凈上清后用75%wtこ醇水溶液(DEPC處理過的，去除了 mRNA酶)清洗2次后4°C下7500g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀，作為模板RNA，-20°C下保存。實施例2. P -葡萄糖苷酶Bgl4編碼基因的克隆1.1 黑曲霉(Aspergillus, niger) cDNA 的獲得以黑曲霉Aspergillus niger菌株總RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(以下各逆轉(zhuǎn)錄所用試劑均來自于試劑盒“PrimeScriptTMlstStrand cDNA Synthesis Kit”，購自Takara公司)。在微量離心管中配制下列模板RNA/Primer反應(yīng)液50 U M Oligo dTIuL,IOmM dNTP MixtureIuL,
總RNAI U g,DEPC-H2O7u L ；混勻后65°C下保溫5min后冰上放置Imin在上述微量離心管中配制下列cDNA合成反應(yīng)液上述RNA/Primer 混合液10 U L,5XPrimeScript Buffer4 U L,40U/u L RNase Inhibiter0. 5 U L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;上述反應(yīng)液混勻后在50°C下保溫lh,70°C下保溫15min后冰上冷卻,得到的反應(yīng)液立即用于cDNA第二鏈的合成。2.2^-葡萄糖苷酶Bgl4基因的引物設(shè)計及克隆

對黑曲霉(Aspergillus, niger)進行發(fā)酵培養(yǎng)(發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖IOg/L,纖維素 ニ 糖 10g/L，K2HPO4 3H20 lg/L, KCl 0. 5g/L，MgSO4O. 5g/L，F(xiàn)eSO4O. Olg/L,NaNO3O. 2g/L, pH調(diào)至4. 8)，37 °C下180rpm培養(yǎng)3_4天。80%wt的硫酸銨沉淀上清液，獲得粗酶液，透析后用膜過濾(50kDa的孔徑)和DEAE陰離子柱層析(洗脫條件為7. 5Tris緩沖，NaCl的濃度梯度為0-0. 5mol/L,體積為500mL)進行純化，得到原始耐高糖P -葡萄糖苷酶的純酶，將獲得的純酶進行蛋白N端測序(上海基康生物技術(shù)有限公司)。將得到的N端序列(-VIAITVKGNAF-)在已經(jīng)全基因組測序的黑曲霉(Aspergillus, niger) CBS513. 88蛋白數(shù)據(jù)庫中進行比對，得到相似度最高的蛋白，獲得該蛋白的基因序列(序列號XM_001402396. 2)，以該蛋白的基因序列為模板設(shè)計引物Pl和P2，引物Pl :5’ -CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3，，下劃線表示 EcoR I 位點。引物 P2 :5’-GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3’，下劃線表示XbaI位點，以cDNA第一鏈為模板，以Pl，P2，為上下游引物擴增Bgl4基因片段,使用Ex Taq聚合酶(購自Takara公司)以推薦比例配制50 ii L反應(yīng)液進行片段擴増，PCR反應(yīng)條件是94°C，5min ;暫停計時，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蠟油密封；35 次循環(huán)(94°C，50s ;58°C，90s ；72°C, 90s) ；72°C, IOmin ;反應(yīng)停止，4°C保溫。通過凝膠回收試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行純化。得到黑曲霉(Aspergillus, niger)耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4基因序列，如SEQ ID NO. 2所示?；厥盏钠闻cpMD_19T simple載體連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli ToplOF’中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于藍白斑篩選平板，37°C過夜培養(yǎng)，接種單菌落到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-10h后，提取質(zhì)粒進行序列測定，得到重組質(zhì)粒pMD-19T-Bgl4。實施例3. P -葡萄糖苷酶Bgl4表達載體的構(gòu)建及表達3.1 P -葡萄糖苷酶Bgl4表達載體的構(gòu)建使用的表達載體質(zhì)粒是pPICZ a A，帶有a-Factor信號肽，所以需要去除原基因的信號肽，因此對獲得的基因Bgl4翻譯的蛋白質(zhì)序列進行信號肽預測，預測程序采用在線程序 SingalP4. 0 (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)進行，獲得耐高糖 3 _ 葡萄糖苷酶Bgl4的信號肽，根據(jù)該預測結(jié)果設(shè)計去除信號肽引物P3 :5，-CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3’，下劃線表示EcoR I位點，與引物P2以pMD_19T_Bgl4為模板擴增去除信號肽的Bgl4片段，PCR反應(yīng)條件是94°C，5min ;暫停計時，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蠟油密封;35 次循環(huán)(94°C，50s ；58°C,90s ；72°C,90s) ；72°C, IOmin ;反應(yīng)停止，4°C保溫。，將pPICZ a A質(zhì)粒和擴增片段分被使用EcoR I和Xba I酶切，割膠回收，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli ToplOF’中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到LB (添加博萊霉素至終濃度25mg/L)固體培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)，接種幾個單菌落到LB (添加博萊霉素至終濃度25mg/L)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-10小時后，收集菌體提取質(zhì)粒，酶切驗證去除空載質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進行核酸序列測定，得到正確的重組表達載體pPICZ a A-Bgl4，將含有該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子接種到30mL LB (添加博萊霉素至終濃度25mg/L)液體體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8_10小時后提取質(zhì)粒，得到大量重組質(zhì)粒pPICZ a A-Bgl4。3. 2 P -葡萄糖苷酶Bgl4表達載體的轉(zhuǎn)化及篩選取重組質(zhì)粒pPICZ a A_Bgl4 42 U L, IOXK buffer 5u L,Bln I 3^1し混勻后37で酶切3h后電泳回收目的基因條帶，濃縮后溶于IOy L無菌水中，得到線性化的重組質(zhì)粒。將約4 ii g的線性化重組質(zhì)粒加入80 ii L畢赤酵母GSl 15的感受態(tài)細胞中(感受態(tài)制備按照畢赤酵母表達手冊操作)，混勻后轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，調(diào)整電擊的參數(shù)(按照畢赤酵母表達手冊操作)，電擊轉(zhuǎn)化，加入lmol/L的預冷山梨醇溶液，轉(zhuǎn)化液于30°C放置Ih后，涂布于YPDS平板(添加博萊霉素至終濃度100mg/L)，30°C培養(yǎng)直至長出單菌落，獲得了含有基因Bgl4的重組畢赤酵母。3. 3 P -葡萄糖苷酶重組基因工程菌pPICZ a A_Bgl4/GS115的表達將重組酵母菌劃線于YH)平板上進行活化，28°C培養(yǎng)2d，至長出單菌落后接種于IOmLBMGY液體培養(yǎng)基中，于28°C，180rpm搖床培養(yǎng)24h，至0D600=2_6，3000rpm離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。將菌體用BMMY誘導培養(yǎng)基稀釋至0D600=1，用4層紗布代替棉花塞，于28°C，ISOrpm搖床培養(yǎng)。每天補加甲醇至終濃度為0. 5%(v/v)，姆隔24h從BMMY培養(yǎng)基中取出ImL菌液于1. 5mL離心管中，3000rpm離心5min,取上清液用于酶活檢測和蛋白分析。實施例4.重組P -葡萄糖苷酶的酶學性質(zhì)4.1酶活測定方法反應(yīng)體系100 ii L，5 ii L 20mmol/L對硝基苯P -D葡萄糖苷(pNPG)中加入85 y LlOOmmol/L檸檬酸-磷酸氫ニ鈉緩沖液(pH 6. 0)，先在50°C孵育5min，再加入10 y L酶液反應(yīng)IOmin,顯色后再加入lmol/L的碳酸鈉溶液600 u L終止反應(yīng)。在405nm下測定吸光值。酶活力単位(U)定義為在測定條件下，毎分鐘產(chǎn)生Iumol P-硝基苯酚所用的酶量為I個酶活力単位。4. 2最適反應(yīng)溫度的測定在35-80°C范圍內(nèi)，每隔5°C，分別測定酶活。緩沖為lOOmmol/L檸檬酸-磷酸氫ニ鈉緩沖液，PH 6.0，發(fā)現(xiàn)重組耐高糖￠-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為50°C，如圖2。4. 3最適反應(yīng)pH在不同的pH (4. 0-8. 2，IOOmmoI/L檸檬酸-磷酸氫ニ鈉緩沖液)條件下，50°C分別測定酶活，發(fā)現(xiàn)重組耐高糖￠-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)PH為6.0，如圖1。

4. 4重組耐高糖P -葡萄糖苷酶的耐糖系數(shù)測定不同濃度的葡萄糖濃度(0mmol/L,I OOmmol /L, 200mmol /L, 400mmol /L,600mmol/L, 8OOmmoI/L, IOOOmmol/L, 1200mmol/L, 1 400mmo1 /丨,、1 BOOmmol /丨,、1800mmo1 /T,.2000mmol/L)對重組耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4酶活的影響，發(fā)現(xiàn)重組耐高糖P -葡萄糖苷酶在2000mM葡 萄糖濃度下與對照相比仍具有48. 5%的酶活力，對葡萄糖的耐糖系數(shù)Ki約為 2000mmol/L，如圖 3。
權(quán)利要求
1.一種耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述耐高糖的葡萄糖苷酶Bgl4的表達基因，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.包含權(quán)利要求2所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
4.包含權(quán)利要求2所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒pPICZa A-Bgl4。
5.包含SEQID NO. 2所述基因序列的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于(1)設(shè)計引物Pl和P2,以黑曲霉菌株(Aspergillus,niger)的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以Pl和P2為引物進行PCR擴增，得到耐高糖β -葡萄糖苷酶Bgl4基因的PCR擴增產(chǎn)物，所述引物為Pl :5’ -CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3’,下劃線表示 EcoR I 位點；P2 :5’ -GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3’,下劃線表示 Xba I 位點；(2)將步驟(I)所得PCR擴增產(chǎn)物與pMD-19T克隆載體在16°C下過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有耐高糖β -葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pMD-19T-Bgl4 ；(3)通過對Bgl4全序列翻譯得到的蛋白序列進行預測并去除信號肽，設(shè)計去信號肽引物 P3 :5’ -CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3，,下劃線表示 EcoR I 位點，以 P3 和 P2 為引物，模板為pMD-19T-Bgl4進行PCR擴增，得到去除信號肽的Bgl4基因片段；(4)將步驟(3)所得的PCR擴增產(chǎn)物和pPICZa A分別用EcoR I和Xba I雙酶切，并分別割膠回收，過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得耐聞糖β _匍萄糖昔酶基因的重組質(zhì)粒 pPICZa A-Bgl40
6.包含權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒的畢赤酵母宿主細胞。
7.權(quán)利要求1所述耐高糖的葡萄糖苷酶Bgl4在纖維素降解中的應(yīng)用。
全文摘要
一種耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表達基因和應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明首次克隆并重組表達了黑曲霉菌株(Aspergillusniger)耐高糖β-葡萄糖苷酶Bgl4的基因，重組酶Bgl4的耐葡萄糖系數(shù)Ki為2mol/L。
文檔編號C12N15/56GK103031290SQ20121054129
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者趙林果, 謝靜聰, 裴建軍, 王飛, 龐倩 申請人:南京林業(yè)大學