專利名稱：一種新的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)過程中的細(xì)胞培養(yǎng)方法， 尤其是馴化生產(chǎn)細(xì)胞株適應(yīng)無血清培養(yǎng)，用一次性袋式激流反應(yīng)器對(duì) 細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，提高細(xì)胞生長(zhǎng)密度，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成 本，減少污染，從而高效生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。
技術(shù)背景紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白激素，分子量約34kD。血漿中存在的 促紅細(xì)胞生成素由165個(gè)氨基酸組成，糖基化程度很高，糖基成分主 要是唾液酸。根據(jù)碳水化合物含量不同，天然存在的促紅細(xì)胞生成素 分為兩種類型，a型含34%的碳水化合物，3型含26%的碳水化合物。 兩種類型在生物學(xué)特性、抗原性及臨床應(yīng)用效果上均相同。人類促紅 細(xì)胞生成素基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)22區(qū)，1985年其cDNA被成功克隆。紅細(xì)胞生成素主要由腎小管內(nèi)皮細(xì)胞合成，也可由肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 產(chǎn)生。促紅細(xì)胞生成素是一種強(qiáng)效的造血生成因子，在0.05 lU/ml 時(shí)即呈劑量依賴效應(yīng)。促紅細(xì)胞生成素活性單一，只作用于骨髓巨核 前體細(xì)胞，可刺激紅祖細(xì)胞及早幼紅細(xì)胞形成成熟的紅細(xì)胞集落；對(duì) 紅細(xì)胞造血過程的調(diào)節(jié)需其他細(xì)胞因子(如IL-3、 GM-CSF和IL-l等) 的協(xié)同作用才能完成。促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受機(jī)體內(nèi)血容量和氧分 壓的調(diào)節(jié)，在失血或低氧的刺激下，促紅細(xì)胞生成素水平迅速上升。 在某些腫瘤患者，可也現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素異常增高；骨髓造血反應(yīng)不 良的貧血患者，其促紅細(xì)胞生成素也升高。重組人促紅細(xì)胞生成素是 通過基因工程克隆人的重組人促紅細(xì)胞生成素基因，由CHO細(xì)胞發(fā)酵表達(dá)的有生物學(xué)活性的蛋白，其具有與人體內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素相 似的生物學(xué)功能。目前，在培養(yǎng)基應(yīng)用方面，重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)細(xì)胞株主 要在含有8 10%牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增到一定量 后換為無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。其中，血清有很多不足的地方，比如1. 血清的成份可能有幾百種之多，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及 其作用機(jī)制仍不清楚，尤其是對(duì)其中一些多肽類生長(zhǎng)因子、激素和脂 類等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給純化工作帶來許多困難。2. 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期 只有一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制。3. 動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其 成分不能保持一致。4. 取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能 導(dǎo)致生產(chǎn)失敗或生產(chǎn)結(jié)果不可靠性。5.大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)成本的主要部分之一。無血清培養(yǎng)基質(zhì)量相對(duì)更加穩(wěn)定，可提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 重復(fù)性。避免了血清源性污染?？商岣弋a(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品 易于純化，目前市面上有很多無血清培養(yǎng)基可供選擇。當(dāng)細(xì)胞在有血清培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞必須貼附在基質(zhì)的表 面上才能生長(zhǎng)， 一但細(xì)胞長(zhǎng)成單層，因?yàn)榧?xì)胞間的接觸抑制，細(xì)胞不 再增殖。這樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)的細(xì)胞密度取決于貼附基質(zhì)表面積的大小，每平方厘米表面積可以容納1 5X1()5個(gè)細(xì)胞，因此，在方瓶和 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中，細(xì)胞密度一般只能在l 5Xl(f細(xì)胞/毫升之間。在采用 了微載體或片狀載體的生物反應(yīng)器中，細(xì)胞密度可達(dá)1 2乂107細(xì)胞/然而，在無血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞經(jīng)馴化可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞 密度主要取決于培養(yǎng)基的營養(yǎng)程度，因此，理論上講，只要有足夠的 營養(yǎng)，細(xì)胞密度可以無限大。目前，對(duì)于不同的無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞密度可以達(dá)到O. 5 1 X 108細(xì)胞/毫升之間。I i l旨，重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)主要使用的是NBS生物反應(yīng)器 (或轉(zhuǎn)瓶)，在罐體中加入微載體進(jìn)行貼壁灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)周期在2 個(gè)月左右，重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量為10mg/L，這種培養(yǎng)方式由 于罐體體積小，微載體量有限，細(xì)胞密度較低，重組人促紅細(xì)胞生成 素表達(dá)量低，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明中所述的一次性袋式激流反應(yīng)器是指哈爾濱安普科技發(fā)展有限公司申請(qǐng)的專利《 一 種細(xì)胞懸浮培養(yǎng)罐》(申請(qǐng)?zhí)?00710130135. X)所述相關(guān)產(chǎn)品。本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞密度高，容易放大，生產(chǎn)周期短， 表達(dá)量高的重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)方法。本發(fā)明通過馴化重組人 重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)細(xì)胞株，使之能在無血清培養(yǎng)基中懸浮生 長(zhǎng)，從而改變了細(xì)胞培養(yǎng)的方式，達(dá)到高密度培養(yǎng)細(xì)胞，大規(guī)模生產(chǎn) 重組人促紅細(xì)胞生成素。本發(fā)明提供了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素的方法，該方法包括如下步驟a) 重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)細(xì)胞株在較小的搖瓶中無血清培 養(yǎng)；b) 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度時(shí)，接種到較大的搖瓶或激流反應(yīng)器的 袋子中無血清培養(yǎng)；C)使細(xì)胞增殖，表達(dá)；d)純化收獲重組人促紅細(xì)胞生成素。本生產(chǎn)方法沒有使用血清，培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，能夠提高產(chǎn)品產(chǎn)量。 由于用一次性袋式激流反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)不受貼附表面積的 限制，細(xì)胞密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于貼壁生長(zhǎng)(5 10倍)，重組人促紅細(xì)胞生成 素表達(dá)量高，容易放大，降低了生產(chǎn)成本，避免了血清的污染。
具體實(shí)施例方式在很多情況下，細(xì)胞是在有血清中保存的，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行馴化， 使其適應(yīng)在無血清中懸浮生長(zhǎng)，馴化是本領(lǐng)域很常規(guī)的技術(shù)，具體步驟如下先用含有血清(胎牛血清)的培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)傳代細(xì) 胞幾次，然后取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液，接到無菌搖瓶中， 適宜的接種密度為1 5乂105細(xì)胞/毫升，搖床的速度為100-400rmp， 適宜的速度為200-300rmp，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1 5X 106細(xì)胞/毫升時(shí)， 進(jìn)行細(xì)胞傳代。最佳傳代密度為2 3X106，按l: 3傳代，當(dāng)細(xì)胞在 無血清中生長(zhǎng)速度，與含有血清中生長(zhǎng)速度接近時(shí)，就實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的 馴化。本發(fā)明對(duì)設(shè)備，試劑沒有特殊要求。下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明不夠成限制。 實(shí)施例l從細(xì)胞庫中復(fù)蘇一支重組人促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng) 基加10%胎牛血清傳代兩次，當(dāng)細(xì)胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶 消化，加血清終止消化，1000rmp ， 5分鐘，離心，去上清，加入無 血清培養(yǎng)基(哈爾濱安普科技發(fā)展有限公司提供)，把細(xì)胞制成懸液， 接種到無菌搖瓶中，每瓶培養(yǎng)基體積為50毫升，接種細(xì)胞密度為3X 10，胞/毫升，搖床速度為200r即，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2 3X1()6細(xì)胞/ 毫升，按l: 3傳代，傳代5 6次時(shí)，當(dāng)細(xì)胞在無血清中生長(zhǎng)速度，與 含有血清中生長(zhǎng)速度接近，凍存細(xì)胞。建立種子細(xì)胞庫。 實(shí)施例2從細(xì)胞庫中復(fù)蘇一支重組人促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng) 基加10%胎牛血清傳代兩次，當(dāng)細(xì)胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶 消化，加血清終止消化，1000r即，5分鐘，離心，去上清，加入無血 清培養(yǎng)基(GIBCO公司CHO無血清懸浮培養(yǎng)基)，把細(xì)胞制成懸液，接 種到無菌搖瓶中，每瓶培養(yǎng)基體積為50毫升，接種細(xì)胞密度為3X105 細(xì)胞/毫升，搖床速度為200rmp，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2 3X 106細(xì)胞/毫 升，按l: 3傳代，傳代5 6次時(shí)，當(dāng)細(xì)胞在無血清中生長(zhǎng)速度，與含 有血清中生長(zhǎng)速度接近，凍存細(xì)胞。建立種子細(xì)胞庫。 實(shí)施例3從細(xì)胞庫中復(fù)蘇一支重組人促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng) 基加10%胎牛血清傳代兩次，當(dāng)細(xì)胞處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶 消化，加血清終止消化，1000rmp， 5分鐘，離心，去上清，加入無血 清培養(yǎng)基(SAFCBioscience公司的無血清懸浮培養(yǎng)基)，把細(xì)胞制成 懸液，接種到無菌搖瓶中，每瓶培養(yǎng)基體積為50毫升，接種細(xì)胞密度為3Xl(f細(xì)胞/毫升，搖床速度為200rmp，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2 3X 106 細(xì)胞/毫升，按l: 3傳代，傳代5 6次時(shí)，當(dāng)細(xì)胞在無血清中生長(zhǎng)速 度，與含有血清中生長(zhǎng)速度接近，凍存細(xì)胞。建立種子細(xì)胞庫。 實(shí)施例4本實(shí)施例中所用培養(yǎng)基為哈爾濱安普科技發(fā)展有限公司提供，對(duì) 袋子(20L)進(jìn)行咖嗎射線消毒，加入培養(yǎng)基為哈爾濱安普科技發(fā)展 有限公司提供無血清培養(yǎng)基10L，并接種實(shí)施例l中所得的種子細(xì)胞， 接種密度為4乂105細(xì)胞/毫升，在37度，轉(zhuǎn)速為200r即下進(jìn)行培養(yǎng)， 流加濃縮培養(yǎng)基(哈爾濱安普科技發(fā)展有限公司提供無血清培養(yǎng)基)， 每天測(cè)糖，保證糖含量在0.5 lg/L，以保細(xì)胞營養(yǎng)充足。培養(yǎng)5 8天后，細(xì)胞密度可以達(dá)到3 8Xl()7細(xì)胞/毫升，繼續(xù)培 養(yǎng)2 3天收獲上清，進(jìn)行純化，重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量達(dá)到 25000IU/ml，而貼壁培養(yǎng)為5000 10000IU/ml，其他指標(biāo)都有提高。 實(shí)施例5本實(shí)施例中所用培養(yǎng)基為哈爾濱安普科技發(fā)展有限公司提供，對(duì) 袋子(40L)進(jìn)行咖嗎射線消毒，加入培養(yǎng)基為哈爾濱安普科技發(fā)展 有限公司提供無血清培養(yǎng)基20L，并接種實(shí)施例l中所得的種子細(xì)胞， 接種密度為4Xl(f細(xì)胞/毫升，在37度，轉(zhuǎn)速為200rmp下進(jìn)行培養(yǎng)， 流加濃縮培養(yǎng)基(哈爾濱安普科技發(fā)展有限公司提供無血清培養(yǎng)基)， 每天測(cè)糖，保證糖含量在0.5 lg/L，以保細(xì)胞營養(yǎng)充足。培養(yǎng)5 8 天后，細(xì)胞密度可以達(dá)至1」3 8乂107細(xì)胞/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)2 3天收獲 上清，進(jìn)行純化，重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量達(dá)到25000IU/ml，而 貼壁培養(yǎng)為5000 10000IU/ml，其他指標(biāo)都有提高。
權(quán)利要求
1、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1，其特征在于培養(yǎng)基使用的是無血清懸浮培養(yǎng)基。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l，其特征在于使用一次性袋式激流反應(yīng)器。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)過程中的細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是馴化重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)細(xì)胞株適應(yīng)無血清培養(yǎng)，使用一次性袋式激流反應(yīng)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，提高細(xì)胞生長(zhǎng)密度，從而高效生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。本方法可提高批生產(chǎn)量，縮短生產(chǎn)周期，減少成本，降低污染。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101597633SQ20081006465
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2008年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日
發(fā)明者冷國慶, 李會(huì)成, 李鄭武, 棟 楊, 趙華南, 剛 陸, 陳玉軍 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物工程有限公司