懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法
【專利摘要】懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮細(xì)胞來生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法。本方法首先對(duì)金線蓮種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中未分化的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊生長(zhǎng)，同時(shí)選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高金線蓮生物堿產(chǎn)品收率，且工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物堿生產(chǎn)技術(shù)，尤其涉及金線蓮生物堿的生產(chǎn)技術(shù)，具體為一種采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金線蓮生物堿類化合物是金線蓮的主要成分之一，金線蓮對(duì)支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性肝病、高血壓、動(dòng)脈硬化、腦血栓等均有輔助功效。金線蓮生物堿的藥理作用主要表現(xiàn)在消炎、解毒、護(hù)肝、預(yù)防心血管疾病的作用。隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)健康的關(guān)注越來越高，其需求量也會(huì)越來越大，但傳統(tǒng)金線蓮生物堿的提取方法是用金線蓮屬植物的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來市場(chǎng)對(duì)金線蓮精深加工的需求。
[0003]隨著植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，用細(xì)胞進(jìn)行人工培養(yǎng)擴(kuò)增提取植物的代謝產(chǎn)物，可以不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)金線蓮生物堿的技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過程中存在很多難題問題，如生物量增速低、目標(biāo)產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等。關(guān)于利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)金線蓮細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的研究還沒有報(bào)道，因此開發(fā)一種高效生產(chǎn)金線蓮生物堿類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中的研究空白。
[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮單細(xì)胞系群來生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑來激活細(xì)胞生長(zhǎng)并縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，同時(shí)選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。具體步驟見如下闡述:
(O單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用50-80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng):
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng):
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.l-2mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6_節(jié)氛基嘿呤)0.l_2mg/L,中性果膠酶50-100mg/L,中性纖維素酶10-50mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持PH在5.6±4;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個(gè)/ml即可停止培養(yǎng)，時(shí)間為15-18天，采用低速離心或其他方法收集金線蓮細(xì)胞，再常規(guī)方法提取金線蓮生物堿。
[0006]本發(fā)明工藝技術(shù)優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明中，首先對(duì)金線蓮種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊，保證營(yíng)養(yǎng)和溶氧供應(yīng)均勻、充分，同時(shí)選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高產(chǎn)品收率，且工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0007]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例所描述的具體的工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制本發(fā)明的權(quán)利要求，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0008]具體實(shí)施例1
1、培養(yǎng)階段
(1)單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.5mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine,6-節(jié)氨基嘌呤)0.5mg/L,中性果膠酶50mg/L,中性纖維素酶10mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000個(gè)/ml即停止培養(yǎng),時(shí)間15天,采用100rpm低速離心收集金線蓮細(xì)胞，將收集到的金線蓮細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆? 2、提取階段
(1)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿；
(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300?，時(shí)間為15min，最終形成懸濁液，將懸濁液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測(cè)方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.019g，收率為
0.39%0。
[0009] 具體實(shí)施例2
1、培養(yǎng)階段
(O單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用60微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為40g/L，光強(qiáng)度為20001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到20000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)L0mg/L,6-BA(6-Benzylaminopurine,6_節(jié)氨基嘌呤)1.0mg/L,中性果膠酶80mg/L,中性纖維素酶20mg/L，鮮細(xì)胞接種量為40g/L，光強(qiáng)度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70000個(gè)/ml即停止培養(yǎng)，時(shí)間18天，采用過濾法收集金線蓮細(xì)胞，將收集到的金線蓮細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> 2、提取階段
(1)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次
0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總霍山石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗霍山石斛生物堿；
(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300?，時(shí)間為15min，最終形成懸濁液，將懸濁液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測(cè)方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.0225g,收率為0.45%0。
[0010] 對(duì)比例I
選取播種生長(zhǎng)8個(gè)月的霍山石斛組培苗，將組培苗洗凈浙干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> (1)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
(2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇；
(3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總霍山石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗霍山石斛生物堿，重0.161g ；
(4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300?，時(shí)間為15min，最終形成懸濁液，將懸濁液離心，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發(fā)皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測(cè)方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.021g，收率為
0.42%0。
[0011 ] 實(shí)驗(yàn)例I總生物堿含量的測(cè)定
1、對(duì)實(shí)施例提取的生物堿進(jìn)行分析，具體分析方法如下。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品0.0lg，置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，得含鹽酸麻黃堿濃度為100mg/L的對(duì)照品溶液.精密量取鹽酸麻黃堿對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液
1,2, 3, 4, 5mL置于干燥的分液漏斗中，分別補(bǔ)水至5mL,再精確加入5mLpH5.4朽1檬酸2朽1檬酸鈉緩沖液，ImL0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液，氯仿10mL，振搖混勻待用.精確量取ImL于1mL容量瓶中用氯仿定容至刻度，搖勻.另取5mL二次純化水，同法操作，作為空白對(duì)照液，在412nm進(jìn)行測(cè)定，以取樣量為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，得回歸方程A= 0.0093C-0.0015,r=0.9998 (n=5).結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在15-100 μ g/mL范圍內(nèi)線性良好；
2、樣品的測(cè)定:精密稱取本實(shí)驗(yàn)制得的生物堿樣品50mg適當(dāng)稀釋后，按上述方法進(jìn)行測(cè)定。
[0012]結(jié)論:
通過上述的培養(yǎng)和提取，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)法在細(xì)胞培養(yǎng)15-18天后生產(chǎn)的金線蓮生物堿在收率上可以接近甚至超過同期播種生長(zhǎng)8個(gè)月的組培苗生產(chǎn)的金線蓮生物堿。
【權(quán)利要求】
1.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，其特征在于，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器對(duì)金線蓮細(xì)胞培養(yǎng)，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑激活細(xì)胞生長(zhǎng)并縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)金線蓮生物堿的方法，具體步驟為: (1)單細(xì)胞制備 取金線蓮蒴果消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞,并離心過濾除雜,收集單細(xì)胞； (2)單細(xì)胞系培養(yǎng) 將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25土2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)； (3)細(xì)胞群放大培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基中加入:NAA 0.l-2mg/L,6-BA 0.l_2mg/L，果膠酶 50_100mg/L，纖維素酶 10_50mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在.5.6 + 4 ； (4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個(gè)/ml即可停止培養(yǎng)，時(shí)間為15-18天，釆用低速離心或過濾法收集金線蓮細(xì)胞，再常規(guī)方法提取金線蓮生物堿。
【文檔編號(hào)】C12P1/00GK104450787SQ201410537117
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】鄧輝, 陳乃富, 劉文中, 陳存武, 韓邦興, 余茂耘 申請(qǐng)人:皖西學(xué)院