體外循環(huán)灌流構(gòu)建組織工程肝的生物反應(yīng)器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于組織工程和生物制造領(lǐng)域，涉及(但不局限于)肝臟組織三維培養(yǎng)構(gòu)建組織工程肝臟的生物反應(yīng)器?？梢詫?shí)現(xiàn)組織工程肝臟體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞種植、組織培養(yǎng)階段的灌流和體外循環(huán)，模擬生理?xiàng)l件下的血流循環(huán)，主要參數(shù)可以調(diào)節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟是人體重要的解毒和消化器官，肝炎、肝硬化、重癥肝衰竭等終末期肝病已嚴(yán)重影響了人們的生存質(zhì)量，成為全世界死亡率最高的疾病之一。目前，肝移植是公認(rèn)的唯一有效的治療方法。僅中國(guó)，約有30萬(wàn)終末期肝病患者等待肝移植手術(shù)，而能夠接受肝移植手術(shù)治療的患者僅占45%。全球范圍內(nèi)供肝短缺形勢(shì)嚴(yán)峻，絕大部分患者因無(wú)法等到供肝而死亡。體外構(gòu)建組織工程肝臟成為解決供肝缺乏的途徑之一。
[0003]組織工程學(xué)是合運(yùn)用生物學(xué)和工程學(xué)的基本原理、基本理論、基本技術(shù)和方法，研究如何在體外條件下構(gòu)建有生物活性的組織器官，用以替代病損的組織器官的學(xué)科。組織工程肝臟是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。構(gòu)建理想的組織工程化人工肝臟，需要研究三個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題:理想的種子細(xì)胞來(lái)源、支架材料和能夠?yàn)榧?xì)胞支架復(fù)合物提供接近生理環(huán)境的生物反應(yīng)器。
[0004]肝組織生物反應(yīng)器的發(fā)展過(guò)程中，先后出現(xiàn)了平板型生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)瓶型生物反應(yīng)器、中空纖維型生物反應(yīng)器、灌流床支架型生物反應(yīng)器(Basak E.Uygun, GavriellePrice, Nima Saeidi,Maria-Louisa Izamis, Tim Berendsen, Martin Yarmush, KorkutUygun.Decellularizat1n and Recellularizat1n of Whole Livers.J.Vis.Exp.2011, (48):e2394)、肝細(xì)胞包裹/懸浮型生物反應(yīng)器。由于上述生物反應(yīng)器都沒(méi)有解決供氧和細(xì)胞在三維支架內(nèi)生長(zhǎng)的問(wèn)題，使它們的使用受到限制。目前這些生物反應(yīng)器可以短時(shí)間內(nèi)部分替代衰竭肝臟，但它不能完全替代肝臟功能，也不能培養(yǎng)出真正的組織工程肝臟(Yu CB, Pan XP, Li LJ.2009.Progress in b1reactors of b1artificiallivers.Hepatobiliary Pancreat Dis Int 8:134-140.)。
[0005]因此，在體外構(gòu)建組織工程人工肝生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)考慮到:灌流效果足夠保證細(xì)胞在三維支架中的種植深度，提供模擬體內(nèi)條件的持續(xù)灌流，并給細(xì)胞提供模擬體內(nèi)的生物、力學(xué)環(huán)境和足夠的營(yíng)養(yǎng)交換。
[0006]本實(shí)用新型提供了模擬生理?xiàng)l件下的組織培養(yǎng)環(huán)境，并給細(xì)胞實(shí)施可調(diào)節(jié)的靜水壓力。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0007]本實(shí)用新型的目的是設(shè)計(jì)可以三維培養(yǎng)肝臟組織構(gòu)建組織工程肝臟的生物反應(yīng)器，用于干細(xì)胞分化的體外研究、組織工程肝臟的體外構(gòu)建，以實(shí)現(xiàn)生物人工肝替代人體供肝的理想狀態(tài)。
[0008]本實(shí)用新型提供的生物反應(yīng)器，包括:
[0009]培養(yǎng)液儲(chǔ)槽，所述培養(yǎng)液儲(chǔ)槽內(nèi)設(shè)有灌流培養(yǎng)液；
[0010]管道系統(tǒng)，所述管道系統(tǒng)包括入口管和出口管；
[0011]無(wú)菌培養(yǎng)室，所述無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)設(shè)有三維支架；所述三維支架包括支架流入口和支架流出口，所述支架流入口與入口管的一端連接，所述支架流出口與出口管的一端連接，所述入口管的另一端和所述出口管的另一端均與所述培養(yǎng)液儲(chǔ)槽連接；
[0012]灌流裝置，所述灌流裝置設(shè)置于所述入口管和所述出口管上。
[0013]其中，所述灌流裝置包括第一蠕動(dòng)栗和第二蠕動(dòng)栗。
[0014]其中，該生物反應(yīng)器包括壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，所述壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、電腦中控系統(tǒng)以及受電腦中控系統(tǒng)控制調(diào)節(jié)的灌流裝置。
[0015]其中，所述管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)為壓力傳感器。
[0016]其中，所述壓力傳感器將管道系統(tǒng)內(nèi)的壓力信號(hào)實(shí)時(shí)傳入電腦中控系統(tǒng)，電腦中控系統(tǒng)根據(jù)所述壓力信號(hào)自動(dòng)調(diào)節(jié)所述第一蠕動(dòng)栗和第二蠕動(dòng)栗，從而控制灌流速度和灌流量。
[0017]其中，還包括灌流液混懸更新裝置，所述灌流液混懸更新裝置包括混懸搖床、三通管。
[0018]其中，所述無(wú)菌培養(yǎng)室由無(wú)菌的生物相容性材料制作。
[0019]其中，細(xì)胞生長(zhǎng)在供培養(yǎng)肝組織的所述三維支架內(nèi)部，該三維支架具有模擬肝局部解剖結(jié)構(gòu)的脈管系統(tǒng)。
[0020]其中，所述三維支架是彈性材料。
[0021 ] 其中，所述培養(yǎng)液儲(chǔ)槽和所述無(wú)菌培養(yǎng)室放置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)。
[0022]該生物反應(yīng)器包括:體外循環(huán)灌流系統(tǒng)，含封閉的體外循環(huán)管道系統(tǒng)、組織灌流發(fā)生器、灌流液混懸更新裝置；管道內(nèi)壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，含壓力負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、電腦控制模塊、受電腦控制調(diào)節(jié)的灌流裝置(蠕動(dòng)栗)；肝臟組織培養(yǎng)體系，含肝組織培養(yǎng)的無(wú)菌培養(yǎng)室、供培養(yǎng)肝組織的三維支架。
[0023]培養(yǎng)液儲(chǔ)槽中的培養(yǎng)液通過(guò)封閉的管道系統(tǒng)，經(jīng)第一蠕動(dòng)栗進(jìn)入肝臟培養(yǎng)三維支架，為三維支架內(nèi)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，三維支架及其內(nèi)部的細(xì)胞在無(wú)菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)液在三維支架內(nèi)循環(huán)后，經(jīng)支架流出口進(jìn)入封閉的管道系統(tǒng)，在第二蠕動(dòng)栗的控制下進(jìn)入培養(yǎng)液儲(chǔ)槽。封閉的管道系統(tǒng)內(nèi)有壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)管道系統(tǒng)內(nèi)壓力，并將壓力信息傳入電腦中控系統(tǒng)，電腦中控系統(tǒng)根據(jù)該壓力信息和預(yù)先設(shè)定的壓力需求，調(diào)節(jié)兩個(gè)蠕動(dòng)栗的速度，從而維持整個(gè)管道系統(tǒng)內(nèi)的靜水壓。
[0024]培養(yǎng)液儲(chǔ)槽另有無(wú)菌進(jìn)液口、氣體進(jìn)口(氧氣、二氧化碳等氣體可以通過(guò)氣體進(jìn)口進(jìn)入培養(yǎng)液儲(chǔ)槽中)和氣體過(guò)濾裝置，以滿足培養(yǎng)液加氧、加二氧化碳、更換培養(yǎng)液以及消除管道系統(tǒng)內(nèi)氣泡的需求。
[0025]上述方案中，整個(gè)管道系統(tǒng)為密閉系統(tǒng)，管道系統(tǒng)包括流入管和流出管，流入管和流出管均采用無(wú)菌的生物相容性材料。無(wú)菌培養(yǎng)室也采用無(wú)菌生物相容性材料。
[0026]本實(shí)用新型另一技術(shù)特征是，管道系統(tǒng)內(nèi)有實(shí)時(shí)壓力傳感器，蠕動(dòng)栗的栗速流量均實(shí)時(shí)通過(guò)電腦中控系統(tǒng)監(jiān)控調(diào)節(jié)。
[0027]本實(shí)用新型與已存在的肝臟生物反應(yīng)器相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0028]第一，通過(guò)培養(yǎng)液在整個(gè)三維支架內(nèi)完全循環(huán)，可以將細(xì)胞懸液帶到整個(gè)三維支架的各個(gè)角落，從而提高三維支架上細(xì)胞的種植密度，模擬真實(shí)肝臟內(nèi)細(xì)胞的分布。
[0029]第二，通過(guò)培養(yǎng)液在整個(gè)三維支架內(nèi)完全循環(huán)，可為三維支架內(nèi)所有細(xì)胞提供有效的營(yíng)養(yǎng)供給、氣體交換，提供支架內(nèi)部細(xì)胞的存活率。
[0030]第三，通過(guò)蠕動(dòng)栗實(shí)現(xiàn)脈動(dòng)刺激，模擬體內(nèi)血流。
[0031]第四，通過(guò)管道內(nèi)壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、電腦中控系統(tǒng)、蠕動(dòng)栗負(fù)反饋調(diào)節(jié)，有效實(shí)現(xiàn)模擬生理?xiàng)l件下肝臟內(nèi)靜水壓。以及靜水壓的調(diào)節(jié)，利于體外肝再生的機(jī)制研究。
[0032]第五，電腦中控系統(tǒng)可通過(guò)軟件調(diào)節(jié)，適應(yīng)不同的研究需求和組織構(gòu)建需求。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為體外循環(huán)灌流構(gòu)建組織工程肝的生物反應(yīng)器的原理結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。
[0034]附圖標(biāo)記:
[0035]1-培養(yǎng)液儲(chǔ)槽；2_氣體進(jìn)口 ；
[0036]3-管道系統(tǒng)；5_第一蠕動(dòng)栗；
[0037]6_第二婦動(dòng)栗；7_壓力監(jiān)測(cè)系統(tǒng)；
[0038]8-電腦中控系統(tǒng)；9_無(wú)菌培養(yǎng)室；
[0039]10-三維支架11-支架流入口 ；
[0040]12-支架流出口。
【具體實(shí)施方式】
[0041]本實(shí)用新型從支架材料細(xì)胞化和組織培養(yǎng)兩個(gè)階段，為體外構(gòu)建組織工程肝臟提供技術(shù)方案。
[0042]本實(shí)用新型提供的生物反應(yīng)器，包括:
[0043]培養(yǎng)液儲(chǔ)槽I，所述培養(yǎng)液儲(chǔ)槽I內(nèi)設(shè)有灌流培養(yǎng)液；
[0044]管道系統(tǒng)3，所述管道系統(tǒng)3包括入口管和出口管；
[0045]無(wú)菌培養(yǎng)室9，所述無(wú)菌培養(yǎng)室9內(nèi)設(shè)有三維支架10 ;所述三維支架10包括支架流入口 11和支架流出口 12，所述支架流入口 11與入口管的一端連接，所述支架流出口 12與出口管的一端連接，所述入口管的另一端和所述出口管