工程化核酸及其用于非人類脊椎動物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于遞送生物學部分(例如修飾的核酸)至細胞以誘導、減少或調(diào)節(jié)非人脊椎動物中蛋白質(zhì)表達的制劑、組合物、試劑盒和方法。
【專利說明】工程化核酸及其用于非人類脊椎動物的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年5月17日提交的美國系列號61/519，158的優(yōu)先權，所述申請的內(nèi)容通過引用方式完整并入本文。
【技術領域】
[0003]本發(fā)明涉及設計、制備、制造和/或配制用于非人類脊椎動物的修飾的核酸分子和/或增強的核酸分子的組合物、方法、過程、試劑盒和裝置。
【背景技術】
[0004]向非人類脊椎動物、尤其家畜施用活性物質(zhì)如治療性和/或生物活性物質(zhì)的方法和裝置是本領域已知的，包括片劑、口服施用溶液劑和通過包括傾倒和點滴制劑的手段注射和局部施用。為了向反芻動物施用活性物質(zhì)，已經(jīng)改造制劑(如膠囊劑)以便定位并留在瘤胃中。這些制劑使治療性和/或生物活性物質(zhì)在不同時間范圍內(nèi)逐步釋放至瘤胃中。這類制劑僅適于施用能夠從胃腸道吸收的物質(zhì)。然而，當治療性和/或生物活性物質(zhì)可能對動物有潛在毒性時，當施用藥物如抗寄生藥或抗生素可能造成動物對該治療性和/或生物活性物質(zhì)形成抗性或該治療性和/或生物活性物質(zhì)可能在動物中引起可能危害動物健康的生理狀態(tài)改變時，這類制劑是不合乎需要的。
[0005]目前，在獸醫(yī)應用中所施用的基于蛋白質(zhì)的治療藥如生長因子、細胞因子和抗體已經(jīng)帶來涉及免疫原性、功效和成本的顧慮。例如，引入的DNA可能以某種頻率整合入宿主細胞基因組DNA，導致宿主細胞基因組DNA的改變和/或破壞?；蛘撸爰毎漠愒疵撗鹾颂呛怂?DNA)(不論該異源DNA是否已經(jīng)整合入染色體)可能被子代細胞或由后代遺傳。
[0006]此外，假定正確遞送并且沒有損傷或整合入宿主基因組，在產(chǎn)生編碼的蛋白質(zhì)之前存在必須進行的多個步驟。一旦進入細胞，DNA必須轉運到細胞核中，在此被轉錄成RNA。從DNA轉錄的RNA隨后必須進入細胞質(zhì)，在此被翻譯成蛋白質(zhì)。從施用的DNA至蛋白質(zhì)的多個加工步驟不僅在功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)生之前產(chǎn)生滯后時間，而且每個步驟都可能產(chǎn)生差錯和細胞損傷。此外，由于DNA往往進入細胞但不表達，或者不以合理的速度或濃度表達，難以在細胞中獲得DNA。將DNA引入原代細胞或修飾的細胞系時，這可能尤其是個問題。
[0007]本發(fā)明通過提供基于核酸的化合物或多核苷酸(例如，修飾的mRNA或修飾的核酸)解決這些顧慮，其中所述化合物或多核苷酸編碼目的多肽并且具有避免本領域中一個或多個問題的結構特征和/或化學特征，例如，可用于優(yōu)化基于核酸的治療藥的配制和遞送的特征，同時保留結構完整性和功能完整性、克服表達閾值、改善表達速率、半壽期和/或蛋白質(zhì)濃度、優(yōu)化蛋白質(zhì)定位并且避免有害生物反應如免疫反應和/或降解途徑。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本文中描述了用于設計、制備、制造和/或配制修飾的核酸分子或增強的核酸分子的組合物、方法、過程、試劑盒和裝置。
[0010]在以下說明書中敘述本發(fā)明的多種實施方案的詳細內(nèi)容。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將從本說明書及附圖并且從權利要求書中顯而易見。
[0011]在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過以下方式在有需要的非人類脊椎動物受試者的細胞、組織或體液中產(chǎn)生目的多肽的方法:施用包含編碼該目的多肽的核酸的藥物組合物。該藥物組合物可以如但不限于在鹽水和/或脂質(zhì)制劑中配制。該制劑用途是，例如但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和局部途徑。制劑可以按選自一日3次、一日2次、一日I次、每隔I日一次、每隔2日一次、每周、每兩周、每三周或每四周和每月的方案施用。另外，該制劑可以通過多次施用法施用。
[0012]在一個實施方案中，非人類脊椎動物可以選自駝羊、爪哇野牛、野牛(bison)、駱馬它、貓、牛、鹿、狗、驢、麋鹿、大額牛、山羊、豚鼠、馬、美洲馬它(llama)、小鼠、騾、豬、兔、大鼠、馴鹿、綿羊、水牛、牦牛、凱克鸚鵡(caiques)、金絲雀、牛背鷺、雞、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、錐尾鸚哥(conure)、鳩鴿、鴨、雀、鵝、情侶鸚鵡、金剛鸚鵡、長尾鸚鵡、鸚鵡、短尾鸚鵡、鴿、青銅翅鸚鵡(Pionus)、玫瑰鸚鵡、火雞、鬣蜥、蜥蜴、蛇、海龜、陸龜、蚓螈(caecilian)、蛙、蠑螈(newt)、鯛(salamander)和蟾蜍。在又一個實施方案中，非人類脊椎動物是小鼠,所述小鼠可以是轉基因、敲入和/或敲除小鼠。
[0013]在一個實施方案中，目的多肽可以在體液，如但不限于外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耵聹、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、尿道球腺液或預射精液、汗、糞尿、毛發(fā)、淚、囊腫液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、月經(jīng)、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽吸物、囊胚腔液和臍帶血中提供。
[0014]在一個實 施方案中，目的多肽可以在組織如但不限于肝、脾、腎、肺、心、腎周脂肪組織、胸腺和肌肉中提供。
[0015]由本發(fā)明涉及目的多肽可以包括但不限于胰島素、貓干擾素、紅細胞生成素、環(huán)孢菌素、胸腺肽β-4、精氨酸加壓素、牛促生長素、催產(chǎn)素、葛瑞林、戈那瑞林(gonadorelin)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、馬絨毛膜促性腺激素(ECG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素釋放激素類似物(GRHa)、胰酶、Cre重組酶、胰島素樣生長因子、hGH、tPA、白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、干擾素(IFN) a、IFNP、IFN Y、IFNco、IFNt、腫瘤壞死因子(TNF) a、TNF β、TNF y、TRAIL、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 和 VEGF。
[0016]在一個實施方案中，藥物組合物包含了帶一個或多個修飾的核酸。所述修飾可以包括但不限于嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-?；撬峒谆蜍铡?-?；撬峒谆?假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-?；撬峒谆?4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙?；铡?-甲?；铡4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、zebularine、5-氮雜-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮雜-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷、N6，N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷(wyosine)、懷丁昔(wybutosine)、7_去氣_鳥昔、7_去氣-8-氣雜_鳥昔、6_硫代_鳥昔、6_硫代-7-去氮-鳥苷、6-硫代-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基次黃嘌呤、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2，N2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鳥苷和它們的組合。[0017]在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于在有需要的非人類脊椎動物的細胞、組織和/或體液中產(chǎn)生第一目的多肽的試劑盒。在又一個實施方案中，所述試劑盒可以包含可編碼第二目的多肽的第二核酸。第二目的多肽可以與第一目的多肽相同或不同。
[0018]本發(fā)明的具體實施方案
[0019]對于治療藥、診斷藥、試劑并且對于生物測定法而言，人們很有興趣將核酸(例如核糖核酸(RNA))在體內(nèi)或離體遞送于細胞內(nèi)部，從而引起核酸的胞內(nèi)翻譯和所編碼多肽的產(chǎn)生。特別重要的是向非人類脊椎動物遞送非整合性核酸及其功能。
[0020]本文中提供了用于設計、制備、制造和/或配制核酸的組合物(包括藥物組合物)和方法，其中所述核酸編碼的多肽能夠在非人類脊椎動物受試者中作為目的生物學部分發(fā)揮作用。如本文所述，這些核酸能夠減少向其所引入的細胞群的天然免疫活性，從而提高蛋白質(zhì)在該細胞群中的產(chǎn)生效率。
[0021]修飾的核酸
[0022]本發(fā)明提供了含有一個或多個修飾核苷的核酸(稱作“修飾的核酸”)，包括RNA如mRNA，所述核酸具有有用特性，包括基本上不誘導向其中引入該mRNA的細胞的天然免疫反應。由于這些修飾的核酸增強蛋白質(zhì)產(chǎn)生的效率、核酸的胞內(nèi)保留作用和所接觸的細胞的生存力，以及具有減低的免疫原性，因此具有這些特性的這類核酸在本文中稱為“增強的核酸”。
[0023]術語“核酸”，在其最廣泛的含義上，包括摻入或者能夠摻入寡核苷酸鏈的任意化合物和/或物質(zhì)。本發(fā)明使用的示例性核酸包括但不限于本文中詳細描述的以下一種或多種:DNA、RNA (包括信使mRNA (mRNA))、其雜交分子、誘導RNAi的物質(zhì)、RNAi物質(zhì)、siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、核酶、催化性DNA、誘導三螺旋形成的RNA、適配體、載體等。
[0024]對核酸的修飾
[0025]本文提供了含有可翻譯區(qū)和一個、二個或多于二個不同核苷修飾的修飾核酸。在一些實施方案中，與相應的未修飾核酸相比，修飾的核酸在向其中引入該核酸的細胞中顯示出降解減少。示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)或其雜交分子。在優(yōu)選的實施方案中，修飾的核酸包括信使RNA (mRNA)。如本文所述，本發(fā)明的核酸基本不誘導其中引入mRNA的細胞胞的天然免疫反應。
[0026]在一些實施方案中，修飾的核苷包括嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-?；撬峒谆?假尿苷、5-?；撬峒谆?2-硫代-尿苷、1-?；撬峒谆?4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
[0027]在一些實施方案中，修飾的核苷包括5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙?；?、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、zebularine、5-氮雜-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮雜-2-硫代-zebularine、2-硫代-ZebUlarine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。
[0028]在其他實施方案中，修飾的核苷包括2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮-2.6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2.6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨甲?；佘铡6，N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
[0029]在特定的實施方案中，修`飾的核苷是V -0-(1-硫代磷酸酯)_腺苷、5' -0-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5' -0-(1-硫代磷酸酯)-鳥苷、5' -0-(1-硫代磷酸酯)_尿苷或5' -O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷。
[0030]
【權利要求】
1.一種在有需要的非人類脊椎動物受試者的細胞、組織或體液中產(chǎn)生目的多肽的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含編碼所述目的多肽的核酸的藥物組合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中藥物組合物是制成制劑的。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中制劑選自鹽水制劑或脂質(zhì)制劑。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中制劑是通過選自靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和局部的途徑施用。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中藥物組合物按選自一日3次、一日2次、一日I次、每隔I日I次、每隔2日I次、每周I次、每兩周I次、每三周I次或每四周I次和每月I次的方案施用。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中制劑是通過多次施用而施用的。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中非人類脊椎動物選自駝羊、爪哇野牛、野牛、駱駝、貓、牛、鹿、狗、驢、麋鹿、大額牛、山羊、豚鼠、馬、美洲騎、小鼠、驟、豬、兔、大鼠、馴鹿、綿羊、水牛、牦牛、凱克鸚鵡、金絲雀、牛背鷺、雞、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、錐尾鸚哥、鳩鴿、鴨、雀、鵝、情侶鸚鵡、金剛鸚鵡、長尾鸚鵡、鸚鵡、短尾鸚鵡、鴿、青銅翅鸚鵡、玫瑰鸚鵡、火雞、鬣蜥、蜥蜴、蛇、海龜、陸龜、蝴螺、蛙、蠑螈、鯢和蟾蜍。
8.根據(jù)權利要求 8所述的方法，其中非人類脊椎動物是小鼠。
9.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中小鼠選自轉基因小鼠、敲入小鼠和敲除小鼠。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中體液選自外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耵聹、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、尿道球腺液或預射精液、汗、糞尿、毛發(fā)、淚、囊腫液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、月經(jīng)、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽吸物、囊胚腔液和臍帶血。
11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中組織選自肝、脾、腎、肺、心、腎周脂肪組織、胸腺和肌肉。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中目的多肽選自胰島素、貓干擾素、紅細胞生成素、環(huán)孢菌素、胸腺肽β _4、精氨酸加壓素、牛促生長素、催產(chǎn)素、葛瑞林、戈那瑞林、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、馬絨毛膜促性腺激素(ECG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素釋放激素類似物(GRHa)、胰酶、Cre重組酶、胰島素樣生長因子、hGH、tPA、白介素(IL)_1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL_18、干擾素(IFN) a , IFN β、IFN Y、IFNco、IFN τ、腫瘤壞死因子(TNF) a、TNF β、TNF Y、TRAIL、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 和 VEGF。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中目的多肽選自胰島素、貓干擾素、紅細胞生成素、環(huán)孢菌素、胸腺肽β _4、精氨酸加壓素、牛促生長素、催產(chǎn)素、葛瑞林、戈那瑞林、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、馬絨毛膜促性腺激素(ECG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素釋放激素類似物(GRHa)、胰酶和Cre重組酶。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中核酸包含選自以下的一個或多個修飾:嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-?；撬峒谆蜍铡?-?；撬峒谆?假尿苷、5-?；撬峒谆?2-硫代-尿苷、1-?；撬峒谆?4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙?；?、5-甲?；?、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、zebularine、5-氮雜-zebularine、5-甲基-zebularine、5_ 氮雜-2-硫代-zebularine、2_ 硫代-zebularine、2_ 甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2，6- 二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-蘇氨酰氨甲?；佘铡?-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨甲?；佘铡6, N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、懷丁苷、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6_硫代-鳥苷、6_硫代-7-去氮-鳥苷、6_硫代-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基次黃嘌呤、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2，N2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷、和N2，N2- 二甲基-6-硫代-鳥苷和它們的組合。
15.一種用于在有需要的非人類脊椎動物受試者的細胞、組織或體液中產(chǎn)生第一目的多肽的試劑盒，所述試劑盒包含編碼所述第一目的多肽的第一核酸。
16.根據(jù)權利要求15所述的試劑盒，還包含第二核酸，所述第二核酸包含編碼第二目的多肽的核酸。
17.根據(jù)權利要求16所述的試劑盒，其中第二目的多肽不同于第一目的多肽。
18.根據(jù)權利要求15所述的試劑盒，其中非人類脊椎動物選自駝羊、爪哇野牛、野牛、駱馬它、貓、牛、鹿、狗、5戶、麋鹿、大額牛、山羊、膝鼠、馬、美洲騎、大鼠、驟、豬、兔、小鼠、馴鹿、綿羊、水牛、牦牛、凱克鸚鵡、金絲雀、牛背鷺、雞、雞尾鸚鵡、美冠鸚鵡、錐尾鸚哥、鳩鴿、鴨、雀、鵝、情侶鸚鵡、金剛鸚鵡、長尾鸚鵡、鸚鵡、短尾鸚鵡、鴿、青銅翅鸚鵡、玫瑰鸚鵡、火雞、鬣蜥、蜥蜴、蛇、海龜、陸龜、蝴螺、娃、蠑螺、鯛和蟾蜍。
19.根據(jù)權利要求15所述的試劑盒，其中目的多肽選自胰島素、貓干擾素、紅細胞生成素、環(huán)孢菌素、胸腺肽β _4、精氨酸加壓素、牛促生長素、催產(chǎn)素、葛瑞林、戈那瑞林、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、馬絨毛膜促性腺激素(ECG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促性腺激素釋放激素類似物(GRHa)、胰酶、Cre重組酶、胰島素樣生長因子、hGH、tPA、白介素(IL)_1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL_18、干擾素(IFN) a , IFN β、IFN Y、IFNco、IFN τ、腫瘤壞死因子(TNF) α、TNF β、TNF GAMAM、TRAIL、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 和 VEGF。
20.根據(jù)權利要求15所述的試劑盒，其中核酸包含選自以下的一個或多個修飾:嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-?；撬峒谆蜍?、1-?；撬峒谆?假尿苷、5-?；撬峒谆?2-硫代-尿苷、1-?；撬峒谆?4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙?；?、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、zebularine、5-氮雜-zebularine、5-甲基-zebularine、5_ 氮雜-2-硫代-zebularine、2_ 硫代-zebularine、2_ 甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2，6- 二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨甲酰基腺苷、N6, N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、懷丁苷、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6_硫代-鳥苷、6_硫代-7-去氮-鳥苷、6_硫代-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基次黃嘌呤、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2，N2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基_8_氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷和N2，N2- 二甲基-6-硫代-鳥苷以及它們的組合。
【文檔編號】C12P21/06GK103687957SQ201280035252
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年5月16日 優(yōu)先權日:2011年5月17日
【發(fā)明者】努巴爾·B·埃非揚, 格雷戈里·J·西茲克維克茲, 斯蒂芬·邦塞爾 申請人:現(xiàn)代治療公司