專利名稱：一個與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的人類新基因netrin－g2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類基因，具體是與層粘連蛋白相關(guān)的NETRIN家族成員的人類新基因NETRIN-G2的cDNA全長克隆，在人體胚胎大腦發(fā)育過程中和成年時期的詳細(xì)表達(dá)。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)是一個由神經(jīng)元相互連接而成的精細(xì)而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。每一個神經(jīng)元是怎樣遷移、生長到達(dá)其最終的位點(diǎn)是人們非常關(guān)心的問題。脊椎動物和無脊椎動物的胚胎學(xué)實(shí)驗證明在某些信號蛋白及其受體的相互作用下，產(chǎn)生吸引或排斥的引導(dǎo)信息，使神經(jīng)軸突延正確方向生長，到達(dá)最終位點(diǎn)(Tessier-lavigne and Goodman，1996)。NETRIN家族被認(rèn)為是能指導(dǎo)軸突生長的家族之一。它是一個具有較大分子量(70-80KD)分泌型可溶蛋白家族，其氨基酸序列與細(xì)胞外基質(zhì)分子(層粘連蛋白)有較高同源性，在軸突生長、細(xì)胞遷移和細(xì)胞調(diào)亡中有重要作用(Livesey FJ，1999)。
NETRIN家族蛋白廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物中，線蟲、果蠅、非洲爪蟾、雞、小鼠和人中都有相關(guān)基因的報導(dǎo)。NETRIN蛋白從N-末端到C-末端依次由信號肽、LamNT(VI domain)，三個類似于EGF的重復(fù)序列(LEdomain)和C結(jié)構(gòu)域(C domain)等結(jié)構(gòu)域組成。其中LamNT結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是在胚胎發(fā)育過程中與其他細(xì)胞外基質(zhì)組分相互作用而介導(dǎo)細(xì)胞的固著、遷移和機(jī)體建成；C結(jié)構(gòu)域可能和蛋白的定位相關(guān)。由于C結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的差異，通常人們將NETRIN家族分為兩個亞家族，即經(jīng)典的NETRIN亞家族和NETRIN-G亞家族。NETRIN-G的C結(jié)構(gòu)域一般稱為C′結(jié)構(gòu)域，因其含有一個GPI(glycosyl phoshatidylinositol)的錨定信號而命名為NETRIN-G亞家族。經(jīng)典的NETRIN亞家族通過與其受體的相互作用而對軸突產(chǎn)生吸引和排斥作用。與其發(fā)生作用的受體可分為兩大類DCC(deleted incolorectal carcinoma)家族和UNC-5家族。而NETRIN-G亞家族只在小鼠和人中發(fā)現(xiàn)，由于它通過GPI錨定在細(xì)胞膜上，而且不與經(jīng)典NETRIN亞家族的兩類受體結(jié)合，因此它的功能與經(jīng)典NETRIN蛋白有一定的差異。
NETRIN家族的mRNA主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，如NETRIN-1在小鼠的脊髓中強(qiáng)烈表達(dá)。NETRIN-1缺陷型小鼠表現(xiàn)出脊椎縫合處軸突投射的缺陷，這與它強(qiáng)表達(dá)的部位是吻合的。NETRIN-G亞家族則主要是在胚胎和成體的大腦中表達(dá)。另外，小鼠的離體實(shí)驗表明，固定化的重組NETRIN-G1或NETRIN-G2能夠使丘腦和新腦皮神經(jīng)元軸突延長，促其生長。雖然NETRIN-G亞家族的功能還不是很清楚，但它與大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長有密切關(guān)系，可能與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的人類新基因NETRIN-G2，并分析該基因在人體胚胎(特別是大腦)發(fā)育過程中和成年時期的表達(dá)及其在染色體上的定位，以探索其對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的功能，進(jìn)而揭示其與人類神經(jīng)疾病的關(guān)系，開發(fā)相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療的新藥物。
在研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子調(diào)節(jié)機(jī)理時，我們得到了本發(fā)明，即從人類早期胚胎大腦cDNA文庫中分離得到一新的NETRIN-G亞家族成員，我們把它命名為NETRIN-G2。
本發(fā)明根據(jù)NETRIN-G亞家族LamNT結(jié)構(gòu)域氨基酸序列設(shè)計兼并引物NGs和NGas，以20周的胚胎大腦文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，克隆到pUCm-T(SANGON)載體，轉(zhuǎn)化的克隆子任意挑選測序，把所得的序列用Blastn去搜索dbEST發(fā)現(xiàn)是EST BF791911的部分序列，把EST BF791911用blastn nr去搜索Genbank，發(fā)現(xiàn)BF791911屬于一個新基因，再根據(jù)EST BF791911和該新基因的一個EST BM126382設(shè)計一對基因特異引物Els和Elas，以20周的胚胎大腦文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條特異帶，經(jīng)測序，此片段長1761bp，是該基因的部分序列。再以從20周胚胎大腦中提取的mRNA為模板，分別用五條引物NRp(此條引物為5′磷酸化引物)，N5Ros，N5Roas，N5Ris和N5Rias，以及N3R和3sites Adaptor Primer(TaKaRa 3′-Full RACE Core Set試劑盒提供)分別進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE快速擴(kuò)增末端。RACE反應(yīng)分別得到了372bp和844bp的目的片段，經(jīng)T-載體克隆、測序，它們?yōu)樵摶虻?′端和3′端，將它們拼接為全長cDNA，共2428 bp即為NETRIN-G2基因的全長cDNA。
NETRIN-G2全長為2428bp，編碼530個氨基酸，大約60 kD，起始密碼子ATG開始于核苷酸86，終止密碼子TGA在核苷酸1678的位置，SAMRT程序分析表明NETRIN-G2從N-末端到C-末端依次含有含信號肽、LamNT(VIdomain)，三個類似于EGF的重復(fù)序列(LE domain)和C′結(jié)構(gòu)域(C domain)。其中C′結(jié)構(gòu)域含有GPI的錨定信號。(圖1)。
用DNASTAR程序的CLUSTAL分析其與經(jīng)典的NETRIN亞家族以及NETRIN-G亞家族其他蛋白相似性發(fā)現(xiàn)，人的NETRIN-G2與小鼠的同名蛋白相似性非常高，整個蛋白質(zhì)序列的相似性達(dá)到94.5％，與小鼠NETRIN-G1的相似性大約為50％左右，而與經(jīng)典NETRIN亞家族的相似性只有20％-30％(圖1)。說明NETRIN-G2應(yīng)屬于NETRIN-G亞家族，而且在功能上應(yīng)與小鼠NETRIN-G2有很高的相似性，可能也與丘腦、新腦皮等處的神經(jīng)元軸突生長相關(guān)。
用全長cDNA檢索GenBank的Blastn nr，發(fā)現(xiàn)人類基因組序列中ACCESSION number為AL353631和AL159997的兩段基因組序列中包含了該基因，整個基因序列大約為71Kb，定位于9q34的細(xì)胞學(xué)位點(diǎn)上。該基因含有7個外顯子和6個內(nèi)含子，外顯子的大小由24bp-956bp不等，其中第1、2個外顯子編碼LamNT結(jié)構(gòu)域。
8種正常成人組織mRNA的Northern雜交分析表明2.4kb的NETRIN-G2mRNA在成人大腦中非常特異的表達(dá)(圖2A)，此結(jié)果表明NETRIN-G2在成體的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，可能對大腦的晚期發(fā)育和功能發(fā)揮起重要作用。
進(jìn)行19周，21周，24周的人體胚胎各種組織總RNA膜的Northern雜交分析，結(jié)果表明該基因在人體不同發(fā)育時期的胚胎的表達(dá)情況與在成人的表達(dá)情況略有不同。NETRIN-G2在胚胎各時期的大腦中強(qiáng)烈表達(dá)(圖2B-2D)，另外在胚胎的肺中也有一定量的表達(dá)，但在成人中卻檢測不到，說明該基因可能也參與了肺的早期發(fā)育。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.提供了一個人類新基因NETRIN-G2基因的全長cDNA序列，并描述了其編碼的蛋白產(chǎn)物與其他NETRIN家族蛋白的相似性，推測到其可能的功能。
2.該基因編碼的蛋白產(chǎn)物為可溶性分泌蛋白，可能是一種神經(jīng)軸突生長誘導(dǎo)因子，并且在成人及胚胎組織中大量限制在大腦表達(dá)，有可能成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的基因工程藥物。
本發(fā)明通過以下附圖和具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1.NETRIN-G2的氨基酸與NETRIN家族氨基酸的同源比較圖中黑色陰影表示氨基酸同源部分，各個結(jié)構(gòu)域都用線段和箭頭分別表示出來圖2.NETRIN-G2在人類組織的Northern雜交2-A成人組織2-B 19周胚胎組織2-C 21周胚胎組織2-D 24周胚胎組織圖中1心臟 2腦 2′顳葉 2″額葉 3胎盤 4肺 5肝6骨骼肌 7腎 8胰腺 9胃 10小腸 11皮膚 12舌 13脾
具體實(shí)施例方式NETRIN-G2基因的克隆，測序及其表達(dá)。
1.利用NETRIN家族LamNT結(jié)構(gòu)域設(shè)計兼并引物NGs sense5′-ACSTGYGGAGACCCYCCTGARNGasantisense5′-CTGRTAGGGCTGCCAKGTPCR反應(yīng)以腦cDNA文庫為模板，反應(yīng)條件為94℃變性4分鐘；然后94℃30秒，50℃30秒，72℃60秒共25個循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘，擴(kuò)增的帶，進(jìn)行T-載體連接，轉(zhuǎn)化，任意挑選轉(zhuǎn)化子去測序。測序結(jié)果去進(jìn)行dbEST檢索，發(fā)現(xiàn)該片段是EST BF791911的部分片段，用此EST進(jìn)行Blastn nr檢索得到一新基因，再進(jìn)行dbEST檢索。根據(jù)EST BF791911和該新基因的EST BM126382設(shè)計引物
Els sense5′-CGAGTCCCGCCTGACCCCGTElasantisense5′-CCGCACCCTTCTCACCGCCC以大腦文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，T-載體連接，轉(zhuǎn)化，測序，得到了該基因的部分序列，長共1761bp。
2.NETRIN-G2全長cDNA的克隆和測序以檢索獲得的cDNA序列設(shè)計RACE引物NRp5′-CCATGCAGTCCTCGGCGTN5Rossense 5′-CATCACCCTTTCGTGGAACAN5Roas antisense 5′-GTAGCGGCTCCAGGTGATGN5Rissense 5′-GACGACGTGGTGATGACCTTN5Riasantisense 5′-CCCTCCTCCTCCTTGTCGAN3R5′-TGCGACCCCGCCGACGATG3sites Adaptor 5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC本實(shí)驗中取大腦組織mRNA 0.5ug為模板，利用TaKaRa公司的5′和3′RACE試劑盒做5′端和3′端RACE。具體操作按該公司protocol進(jìn)行。將RACE產(chǎn)物克隆入T載體并測序獲得NETRIN-G2的5′端和3′端序列。將它們拼接為全長cDNA共2824bp。
3.Northern雜交(1)組織總RNA的提取(按王雁云，羅開梅等，一種快速的總RNA提取方法，《生命科學(xué)研究》，5(1)88-90(2001)進(jìn)行)。
(2)總RNA的電泳及轉(zhuǎn)膜，均按《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)》介紹的方法進(jìn)行(盧圣棟主編，第二版)。
(3)Northern雜交將從CLONTECH公司買的成人組織mRNA膜和轉(zhuǎn)有20ug人體胚胎多種組織的總RNA尼龍膜，放入培養(yǎng)皿中，加入經(jīng)68℃預(yù)熱的快速雜交液(Clontech公司)10ml，68℃預(yù)雜交30分鐘，加入變性的同位素標(biāo)記的NETRIN-G2的cDNA片段，68℃雜交過夜。用2XSSC，0.05％SDS，65℃洗兩次，15分鐘/次；0.1XSSC，0.1％SDS，65℃洗兩次，15分鐘/次。
(4)-80℃曝光幾天，洗X光片。
(5)用0.1×SSC和0.5％SDS在95℃洗10分鐘膜用β-actin cDNA重新標(biāo)記，做Northern雜交進(jìn)行陽性對照。
NETRIN-G2 cDNA的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列ccatgctgaggccgc gagtcccgcc tgaccccgtc 35gctgcctctc cagggcttct ctgggccgcg cctctgcaga ctgcgcagcc 85atg ctg cat ctg ctg gcg ctc ttc ctg cac tgc ctc cct ctg gcc 130Met Leu His Leu Leu Ala Leu Phe Leu His Cys Leu Pro Leu Ala1 5 10 15tct ggg gac tat gac atc tgc aaa tcc tgg gtg acc aca gat gag 175Ser Gly Asp Tyr Asp Ile Cys Lys Ser Trp Val Thr Thr Asp Glu16 20 25 30ggc ccc acc tgg gag ttc tac gcc tgc cag ccc aag gtg atg cgc 220Gly Pro Thr Trp Glu Phe Tyr Ala Cys Gln Pro Lys Val Met Arg31 35 40 45ctg aag gac tac gtc aag gtg aag gtg gag ccc tca ggc atc aca 265Leu Lys Asp Tyr Val Lys Val Lys Val Glu Pro Ser Gly Ile Thr46 50 55 60tgt gga gac ccc cct gag agg ttc tgc tcc cat gag aat ccc tac 310Cys Gly Asp Pro Pro Glu Arg Phe Cys Ser His Glu Asn Pro Tyr61 65 70 75cta tgc agc aac gag tgt gac gcc tcc aac ccg gac ctg gcc cac 355Leu Cys Ser Asn Glu Cys Asp Ala Ser Asn Pro Asp Leu Ala His76 80 85 90ccg ccc agg ctc atg ttc gac aag gag gag gag ggc ctg gcc acc 400Pro Pro Arg Leu Met Phe Asp Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Thr91 95 100 105tac tgg cag agc atc acc tgg agc cgc tac ccc agc ccg ctg gaa 445Tyr Trp Gln Ser Ile Thr Trp Ser Arg Tyr Pro Ser Pro Leu Glu106 110 115 120gcc aac atc acc ctt tcg tgg aac aag acc gtg gag ctg acc gac 490Ala Asn Ile Thr Leu Ser Trp Asn Lys Thr Val Glu Leu Thr Asp121 125 130 135gac gtg gtg atg acc ttc gag tac ggc cgg ccc acg gtc atg gtc 535Asp Val Val Met Thr Phe Glu Tyr Gly Arg Pro Thr Val Met Val136 140 145 150ctg gag aag tcc ctg gac aac ggg cgc acc tgg cag ccc tac cag 580Leu Glu Lys Ser Leu Asp Asn Gly Arg Thr Trp Gln Pro Tyr Gln151 155 160 165ttc tac gcc gag gac tgc atg gag gcc ttc ggt atg tcc gcc cgc 625Phe Tyr Ala Glu Asp Cys Met Glu Ala Phe Gly Met Ser Ala Arg166 170 175 180cgg gcc cgc gac atg tca tcc tcc agc gcg cac cgc gtg ctc tgc 670Arg Ala Arg Asp Met Ser Ser Ser Ser Ala His Arg Val Leu Cys181 185 190 195acc gag gag tac tcg cgc tgg gca ggc tcc aag aag gag aag cac 715
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NETRIN-G2的部分核苷酸序列。
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1.一個與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的人類新基因NETRIN-G2，其特征在于該基因的cDNA的核苷酸序列和編碼氨基酸序列如下ccatg ctgaggccgc gagtcccgcc tgaccccgtc 35gctgcctctc cagggcttct ctgggccgcg cctctgcaga ctgcgcagcc 85atg ctg cat ctg ctg gcg ctc ttc ctg cac tgc ctc cct ctg gcc 130Met Leu His Leu Leu Ala Leu Phe Leu His Cys Leu Pro Leu Ala1 5 10 15tct ggg gac tat gac atc tgc aaa tcc tgg gtg acc aca gat gag 175Ser Gly Asp Tyr Asp Ile Cys Lys Ser Trp Val Thr Thr Asp Glu16 20 25 30ggc ccc acc tgg gag ttc tac gcc tgc cag ccc aag gtg atg cgc 220Gly Pro Thr Trp Glu Phe Tyr Ala Cys Gln Pro Lys Val Met Arg31 35 40 45ctg aag gac tac gtc aag gtg aag gtg gag ccc tca ggc atc aca 265Leu Lys Asp Tyr Val Lys Val Lys Val Glu Pro Ser Gly Ile Thr46 50 55 60tgt gga gac ccc cct gag agg ttc tgc tcc cat gag aat ccc tac 310Cys Gly Asp Pro Pro Glu Arg Phe Cys Ser His Glu Asn Pro Tyr61 65 70 75cta tgc agc aac gag tgt gac gcc tcc aac ccg gac ctg gcc cac 355Leu Cys Ser Asn Glu Cys Asp Ala Ser Asn Pro Asp Leu Ala His76 80 85 90ccg ccc agg ctc atg ttc 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全文摘要
一個與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的人類新基因NETRIN－G2涉及人類基因，該基因的cDNA全長2428bp，位于染色體9q34，編碼的蛋白質(zhì)為530個氨基酸，大約60KD，該基因在胚胎各時期和成人的大腦中表達(dá)，有望開發(fā)成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的基因藥物。
文檔編號C07K14/435GK1490324SQ0213975
公開日2004年4月21日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者吳秀山, 劉明耀, 李大力, 王躍群, 李永青, 朱傳炳, 袁婺洲 申請人:湖南師范大學(xué)