專利名稱：分析扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系的方法，特別是涉及測定扇貝的線粒體DNA(mtDNA)核苷酸堿基序列中的非編碼區(qū)序列，以分析這種譜系的方法。
在過去，一直是從天然養(yǎng)魚場中捕捉和直接生產(chǎn)扇貝，但近年來因需求量日益增加而導(dǎo)致扇貝大量人工養(yǎng)殖。結(jié)果，采用了某些人工技術(shù)來控制種子扇貝的接種繁殖，然而這對整個生物體的遺體結(jié)構(gòu)造成不利影響，更不必說扇貝了。這種人工接種和培養(yǎng)控制將導(dǎo)致基因庫的減少和扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系品種的減少。這就意味著在不久的將來，特殊扇貝的群體將減少其譜系品種，而且其自身將不能適應(yīng)周圍環(huán)境的各種改變以留下其后式，造成意想不到的嚴(yán)重后果。因此，現(xiàn)在需要分析扇貝的特殊遺傳結(jié)構(gòu)，以確定作為保留其譜系多樣性之關(guān)鍵因素的DNA多態(tài)性或核苷酸序列高變區(qū)。
具體地說，日本扇貝(Patinopecten yessoensis)廣泛生存在日本北方島嶼、朝鮮半島北部、薩哈林島和千島群島的冷海岸，是用于食品和食品加工的最有吸引力的扇貝之一。從上面討論的人工培養(yǎng)問題的角度看，還特別需要最大可能地保留這種日本扇貝譜系。
分析一個扇貝群體的遺傳結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法是基于使用同工酶或異型酶。但是，已發(fā)現(xiàn)這些酶學(xué)方法的靈敏性較差，而且不足以用作特異性確定和分類特定日本海域中各個日本扇貝群體之譜系的工具。另外，這些常規(guī)方法的問題是需要大量的待分析樣品、耗費(fèi)的時間長，以及分析方法中有些步驟的效率低。
此外，迄今尚未報導(dǎo)全面分析每個不同的日本扇貝群體的遺傳特征，以及日本扇貝mtDNA之特定堿基序列的方法。因此，迄今尚不能得到有關(guān)日本扇貝譜系的數(shù)據(jù)。
從上述缺點看，本發(fā)明的主要目的是提供確保以高精確性和可靠性分析扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系的方法。
為此目的，本發(fā)明的方法基本上包括測定扇貝的線粒體DNA(mtDNA)的序列以確定mtDNA之核苷酸序列的步驟，其中核苷酸堿基序列包括其中存在有核苷酸堿基取代座位的非編碼區(qū)，所說的座位顯示作為扇貝之特定譜系指征的序列多態(tài)性。
在本發(fā)明的一個方面中，該方法可包括以下步驟從扇貝的閉殼肌中提取作為模板DNA的總DNA；使用基于已知有殼水生動物線粒體16S rRNA基因和12S rRNA基因間保守的核苷酸堿基序列而設(shè)計的適當(dāng)引物，以聚合酶鏈反應(yīng)法從模板DNA擴(kuò)增mtDNA；測定如此擴(kuò)增之mtDNA的序列同時確定其中的非編碼區(qū)；然后，使用基于已確定之mtDNA核苷酸堿基序列所設(shè)計的適當(dāng)引物，測定非編碼區(qū)的序列；定位非編碼區(qū)中的核苷酸序列取代座位，從而確定扇貝的特定譜系。
使用上述包括Pyso 16S BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)和Pyso 12S BR引物(5′-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3′)的適當(dāng)引物組，分析日本扇貝(Patinopecten yessoensis)線粒體DNA的核苷酸堿基序列，同時定位堿基序列中的非編碼區(qū)，然后用上述包括Pyso 16S BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)、Pyso NcR引物(5′-AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3′)和Pyso 12S AR引物(5′-ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3′)的適當(dāng)引物組測定mtDNA非編碼區(qū)的序列。
在本發(fā)明的另一個方面中，可以將使用上述適當(dāng)引物組經(jīng)前述聚合酶鏈反應(yīng)得到的不同扇貝樣品的多個不同的擴(kuò)增的mtDNA分成各自相當(dāng)于各個不同扇貝群體的不同組群，并測定擴(kuò)增的各mtDNA的序列同時確定其中的非編碼區(qū)。然后，使用上述適當(dāng)?shù)囊餃y定非編碼區(qū)的序列，以定位各個不同組群之非編碼區(qū)中的核苷酸序列取代座位，從而確定作為各組扇貝之特定譜系指征的序列多態(tài)性，并借以將不同的扇貝分類為特定的譜系。在那些步驟中，可以包括以下步驟比較各不同扇貝樣品間的核苷酸堿基序列取代座位；從不同的扇貝樣品中選擇出具有相同核苷酸堿基序列取代座位的特定扇貝樣品；得到這些特定樣品間的高群體頻率；并基于高群體頻率確定特定樣品間的祖先相同性，從而找出不同扇貝群體間的相同祖先。
在本發(fā)明的另一個方面，為了對多個扇貝樣品進(jìn)行高效分析，可在擴(kuò)增多個扇貝樣品的mtDNA后，使用Pyso 16S BF、Pyso NcR和Pyso 12S AR引物直接測定mtDNA非編碼區(qū)的序列，以定位非編碼區(qū)中的核苷酸序列取代座位，從而基于不同的扇貝群體快速分析各組多個扇貝樣品的譜系。
通過閱讀下面的說明書，并參照附圖本發(fā)明的其它各種優(yōu)點和特征將明顯可見。


圖1列出了用于擴(kuò)增扇貝的相關(guān)DNA區(qū)域并進(jìn)行測序的所有引物；圖2顯示了SAROMA和AOMORI群體中日本扇貝線粒體DNA之非編碼區(qū)的序列多態(tài)性；圖3顯示了已經(jīng)受LA-PCR擴(kuò)增的SAROMA、AOMORI和美國扇貝樣品中已擴(kuò)增之線粒體DNA的電泳圖形。
圖4(A)圖解顯示了SAROMO和AOMORI樣品共有的線粒體DNA的核苷酸堿基序列。
圖4(B)顯示了圖4(A)中所示線粒體DNA之完整核苷酸堿基序列的堿基序列密碼。
就脊椎動物和軟體動物的線粒體DNA而言，已確定了某些種的完整核苷酸堿基序列(例如參見Hoffmann et al.,Genetics 131:397-412,1992；Hatzoglou et al.,Genetics 140:1353-1366,1995)。脊椎動物線粒體DNA(mtDNA)在其基因組結(jié)構(gòu)中包括顯示有很大核苷酸堿基多樣性的非編碼區(qū)，即表明其中發(fā)生某些突變的高可變堿基序列(Wilding et al.,J.Mol.Evol.48:348-359,1999；Kurabayashi et al.,Mol.Biol.Evol.,17:266-277,2000)。因此，已將非編碼區(qū)作為譜系分析和系統(tǒng)發(fā)育研究及群體遺傳研究的標(biāo)準(zhǔn)。另外，mtDNA是母體遺傳的，并且已知其在脊椎動物中有高的突變率。
就扇貝來說，Sellos等人報道說已克隆了扇貝(Pecten maximus)的5.5kbp mtDNA區(qū)段，并且測序發(fā)現(xiàn)這種mtDNA區(qū)段含有兩種多肽的基因，兩個rRNA和5個tRNA，以及長度為8-125bp的基因間序列(Genbank登記號X92688,1997)。但他們并沒有作進(jìn)一步的研究。La Roche等人和Rigaa等人已表征了扇貝Placopectenmagellanicus和Pecten miximus之mtDNA中的重復(fù)元件(Mol.Biol.Evol.7:45-64,1990；J.Mol. Evol.41:189-195,1995)。根據(jù)Fuller和Zouros(1993)的報導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)元件負(fù)責(zé)扇貝Placopectenmagellanicus中mtDNA的個體間和個體內(nèi)長度變異(Curr.Genet.23:365-369,1993)。
從上述關(guān)于非日本扇貝種之mtDNA的在先發(fā)現(xiàn)來看，我們已對日本扇貝(Patinopecten yessoensis)之mtDNA的核苷酸堿基序列進(jìn)行了特定分析，并發(fā)現(xiàn)這種日本扇貝之mtDNA片段的序列含有一個可顯示各個不同扇貝群體之序列多態(tài)性的非編碼區(qū)。
下面將詳細(xì)描述我們已完成的，用于分析日本扇貝之兩個典型的不同群體中的mtDNA方法的一個優(yōu)選實例，并與外國扇貝進(jìn)行比較分析，以進(jìn)一步確定各個日本扇貝群體的詳細(xì)的系統(tǒng)發(fā)育譜系。
1．DNA提取在本實施例中，提供了下列三種不同的扇貝兩種不同的日本扇貝，一種是在日本的Lake Saroma,Hokkaido培養(yǎng)的，包括同一扇貝群體的多個個體(以下稱為“SAROMA”)；另一種是在日本的Aomori海岸培養(yǎng)的，也包括同一扇貝群體的多個個體(以下稱為“AOMORI”)；再一種則是于北美洲培養(yǎng)的外國扇貝(以下稱為“美國樣品”)。應(yīng)指出的是，為簡便起見，這部分說明中所提到的樣品只是取自上述SAROMA和AOMORI群體中的各一個樣品及一個美國樣品。
從上述三個不同的樣品中分別制備約50-100mg小塊閉殼肌，從而為下述DNA提取步驟提供約50-100mg的三種扇貝樣品。
向三個樣品中各加入500μl含有20mg/ml蛋白酶K的TNES-尿素緩沖液，然后于37℃保溫樣品2小時。保溫后，用苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)將裂解物提取2次(即所謂“苯酚-氯仿處理”)，然后，經(jīng)乙醇沉淀回收整個DNA并溶解在50μl蒸餾水中。根據(jù)Asahida等人(Fisheries Sci.62:727-730,1996)的方法進(jìn)行此DNA提取。為了用此方法處理多個樣品，使用Multiscreen 96孔濾板FB(Millipore)從保溫后的裂解物中回收DNA，并使用96孔DNA沉淀HL試劑盒(Edge Biosystems)以異丙醇沉淀法純化之。
2．mtDNA片段的擴(kuò)增為了從如此提取的各總DNA(模板DNA)中擴(kuò)增靶mtDNA，使用長而準(zhǔn)確的聚合酶鏈反應(yīng)(以下稱為LA-PCR,LA-PCR試劑盒購自Takara Shuzo)，并基于已知甲殼動物線粒體16S rRNA基因和12S rRNA基因間保守的核苷酸序列，設(shè)計如
圖1中所示的將用于LA-PCR的引物。具體地說，首先將大約5-10ng模板DNA與下列物料混合，以制備50μl反應(yīng)溶液LA-Tag聚合酶5單位；LA-PCR緩沖液1X；MgCl2:2.5 mM；dNTP各400μM；引物0.2μM。
使用下列八個引物的幾種組合，在前述反應(yīng)溶液中進(jìn)行LA-PCR:Pyso 16S AF、Pyso 16S AR、Pyso 16S BF、Pyso 16S BR、Pyso12S AF、Pyso 12S AR、Pyso 12S BF和Pyso 12S BR。這些引物的堿基序列如表1中所示。LA-PCR的步驟包括94℃初始變性7分鐘，然后進(jìn)行35次下列反應(yīng)98℃變性20秒，55℃退火1分鐘和72℃延伸10分鐘。
通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并經(jīng)溴化乙錠染色顯現(xiàn)之。電泳后，從瓊脂糖凝膠上切下擴(kuò)增的DNA并用GFX PCR DNA和凝膠帶純化試劑盒(Ameraham)純化之。然后，使用pGEM-T Easy(Promega)載體，以大腸桿菌XL1-1 Blue克隆如此處理的擴(kuò)增的DNA。使用T7引物、SP6引物或選自
圖1中所列引物中的適當(dāng)引物，借助染料終止法(如由PE Bioxystems生產(chǎn)的BigDye TerminatorCycle測序試劑盒)測定每個擴(kuò)增的DNA片段的核苷酸堿基序列。另外，也可以在按上述方法純化后，不經(jīng)前述克隆即直接用染料終止法進(jìn)行序列測定。
這些電泳圖形中顯現(xiàn)的擴(kuò)增的DNA片段如圖3所示，其中觀察到SAROMA和AOMORI樣品均在1.3kbp水平上顯示其各自與眾不同的帶，而美國樣品則在1.5kbp水平上顯示其與眾不同的帶(相對于凝膠介質(zhì)中的標(biāo)志參考帶(M)而言)。這一堿基對差異明顯地表明，日本扇貝在線粒體結(jié)構(gòu)上不同于美國扇貝。另外，實驗顯示可以從種和生境出發(fā)來容易地將這兩種扇貝彼此區(qū)分開。再者，這一結(jié)果使我們進(jìn)一步證實，兩種日本樣品的1.3kbp帶是用引物組Syso 16SBF和Pyso 12S BR檢測的，而美國樣品的1.5kbp帶是用引物組Pyso12S BF和Pyso 16S BR檢測的。使用適當(dāng)?shù)臏y序儀測定SAROMA和AOMORI樣品中1.3kbp DNA的序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SAROMA樣品的1.3kbp帶在堿基序列上只除了兩個堿基外，幾乎完全相同于AOMORI樣品的1.3kbp帶。使用NCBI BLAST服務(wù)器或tRNAscan-SE檢索服務(wù)器(htto://www.genetics.wustl.edu/eddv/tRNAscan-SE)，經(jīng)同源性檢索分析這兩種樣品的核苷酸堿基序列的數(shù)據(jù)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種日本樣品的堿基序列都含有下列三個特定的基因16S rRNA基因、tRNA基因和12S rRNA基因，并且進(jìn)一步含有下列第一和第二非編碼區(qū)NcR1和NcR2(參見圖4(A)和圖4(B))。我們還發(fā)現(xiàn)，16S rRNA和12S rRNA基因區(qū)各顯示與扇貝Pecten maximus之mtDNA的各自16SrRNA和12S rRNA基因區(qū)(由Sellos等人測序，1997)有最高同源性，故認(rèn)為所研究的1.3kbp DNA衍生于線粒體DNA，而不是核DNA。即是說，現(xiàn)在確定的1.3kbp是日本扇貝(Patinopecten yessoensis)的mtDNA，其堿基序列示于圖4(A)中。圖4(B)中特別是顯示日本扇貝之1.3kbp mtDNA的整個編碼的核苷酸堿基序列。
基于對某些個體之1.3kbp mtDNA的序列測定結(jié)果，我們確定非編碼區(qū)NcR1和NcR2似乎有很強(qiáng)的序列變異和高突變率。認(rèn)為這兩個非編碼區(qū)NcR1、NcR2是Saroma和Aomori扇貝群體的個體間發(fā)生特異性堿基取代或突變的區(qū)域。
3．對mtDNA中非編碼區(qū)的分析鑒于mtDNA是母體遺傳的并且具有高突變率，所以日本扇貝的mtDNA，特別是其中的非編碼區(qū)(NcR1和NcR2)也是母體遺傳的并且具有高突變率(如上所述)。取SAROMA扇貝1.3kbp mtDNA片段的總共19個樣品(即SAROMA群體中的19個扇貝個體)，并取AOMORI扇貝1.3kbp mtDNA片段的總共20個樣品(即AOMORI群體中的20個扇貝個體)，分析這些非編碼區(qū)的堿基序列。當(dāng)然，那些多個樣品已經(jīng)受到上述所有處理，包括LA-PCR，其中將擴(kuò)增的1.3kbp mtDNA片段分成有適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)標(biāo)記的不同組，然后在如上所述的同樣條件下進(jìn)行了測序。
可用任何一種適當(dāng)?shù)姆椒y定見于每個樣品mtDNA中的非編碼區(qū)(NcR1和NcR2)的序列。在本實施例中，使用下列三個引物進(jìn)行上述的染料終止法Pyso 16S BF、Pyso NcR和Pyso 12S AR，以確定每個SAROMA(19個)和AOMORI(20個)樣品的非編碼區(qū)特異的核苷酸堿基序列?；蛘?，也可以使用適當(dāng)?shù)囊锝M進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，以代替染料終止法。
最后，經(jīng)測定每個SAROMA和AOMORI樣品的非編碼區(qū)堿基序列，揭示出有多個不同核苷酸堿基取代座位定位于非編碼區(qū)內(nèi)(特別是第二非編碼區(qū)NcR2內(nèi)，參見圖2和圖4(B))，其表明扇貝個體間mtDNA中的序列多態(tài)性。從圖2可以看出，SAROMA群體包括10個不同的母系遺體譜系(Gs-1至Gs-10)，而AOMORI群體則包括5個不同的母系遺傳譜系(Ga-1至Ga-5)。
上述分析的結(jié)果進(jìn)一步顯示，SAROMA群體的單元型Gs-1和Gs-8在圖2所示核苷酸堿基序列號126至378范圍內(nèi)，在核苷酸堿基序列和序列取代座位上分別相當(dāng)于AOMORI群體的單元型Ga-1和Ga-4，并提示各個SAROMA和AOMORI單元型的母系遺體群體頻率總數(shù)分別高達(dá)42.11和80％。兩群體中共有單元型的這種高群體頻率提示，分別相當(dāng)于AOMORI之單元型Ga-1和Ga-4的SAROMA之單元型Gs-1和Gs-8，是日本扇貝群體中的母系遺傳祖先。但在這方面，可以從這一結(jié)果推斷，從SAROMA群體至AOMORI群體，或反之將會有某些人為遷移。而從圖2所示的數(shù)據(jù)看，這種推測并不太實際，因為圖2顯示扇貝個體的品種是各自特異于SAROMA和AOMORI群體的。
另外，就序列編號229至449而言，從這一分析結(jié)果我們計算出SAROMA群體有0.80％核苷酸堿基多樣性，而AOMORI群體有0.38％核苷酸堿基多樣性。也就是說，發(fā)現(xiàn)SAROMA群體的核苷酸堿基多樣性大約是AOMORI群體的兩倍，這表明前者相對于后者具有更大的基因庫。
根據(jù)以上對本發(fā)明所作的描述，可以理解到(ⅰ)借助PCR分析日本扇貝之mtDNA的核苷酸堿基序列。核苷酸堿基序列的編碼如圖4(B)中所示。進(jìn)一步測定顯示序列多態(tài)性的mtDNA的非編碼區(qū)的序列，以定位其中的核苷酸堿基取代座位，從而比較性確定某特定扇貝群體的每個扇貝個體中的群體頻率，并找出不同扇貝群體間的相同核苷酸堿基序列。基于那些群體頻率和相同核苷酸堿基序列，很容易將每個扇貝群體的個體分類為不同譜系，并且，確定不同扇貝群體間的相同核苷酸堿基序列也能判定它們中的某些群體屬于母系遺傳上同源的群體。因此，有可能用這種分析方法闡明扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系并將扇貝分類為不同的譜系，并且(ⅱ)與常規(guī)酶學(xué)分析方法相反，在本發(fā)明中將PCR和染料終止方法聯(lián)合使用，不僅大大提高了分析扇貝mtDNA的靈敏性和精確度，而且也提供了一種快速分析方法，因為該方法并不需要大量樣品，也不需要如見于酶學(xué)方法中的任何其它的復(fù)雜步驟。還可以以高精確度和高速度分析許多樣品。
在上述分析中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有必要在地域基礎(chǔ)上對天然扇貝群體和人工培養(yǎng)的扇貝群體間的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較檢索。
雖然已描述了本發(fā)明，但應(yīng)明確的是，本發(fā)明不只限于這些說明性實施例如實施方案，在不背離待批權(quán)利要求范圍的前提下可以對本發(fā)明作出許多其它改動、替代和增加。本發(fā)明的上述方法基本上也可應(yīng)用于日本扇貝以外的其它種類的扇貝，但為了分析這些扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系，可在設(shè)計所使用的引物、PCR條件等方面進(jìn)行某些調(diào)整。
權(quán)利要求
1．一種分析扇貝譜系的方法，該方法包括測定扇貝線粒體DNA的序列以確定線粒體DNA的核苷酸堿基序列。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的核苷酸堿基序列包括其中含有核苷酸堿基取代座位的非編碼區(qū)，所說的核苷酸堿基取代座位顯示作為所說扇貝特定譜系的指征的序列多態(tài)性的指征，并且其中測定所說的非編碼區(qū)的序列以定位其中的核苷酸堿基取代座位。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括下列步驟從所說扇貝的閉殼肌中提取作為模板DNA的總DNA；使用基于已知有殼水生動物線粒體16S rRNA基因和12S rRNA基因間保守的核苷酸堿基序列設(shè)計的適當(dāng)引物組，在聚合酶鏈反應(yīng)下從所說的模板DNA擴(kuò)增線粒體DNA；測定如此擴(kuò)增的線粒體DNA的序列同時確定其中的非編碼區(qū)，以便確定線粒體DNA的核苷酸堿基序列；然后，使用基于所說的擴(kuò)增的線粒體DNA的核苷酸堿基序列設(shè)計的適當(dāng)引物，測定所說的非編碼區(qū)的序列；定位所說非編碼區(qū)中的核苷酸堿基取代座位，并且由所說的核苷酸堿基取代座位確定序列多態(tài)性，從而分析所說的扇貝的特定譜系。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的擴(kuò)增的線粒體DNA是使用載體由大腸桿菌克隆，然后用染料終止方法測序的。
5．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的擴(kuò)增的線粒體DNA是未經(jīng)克隆而用染料終止法直接測序的。
6．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的擴(kuò)增的線粒體DNA和所說的非編碼區(qū)都是用染料終止法測序的。
7．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的扇貝是以多數(shù)給出的，以提供許多不同的扇貝，并且其中所說的多種不同扇貝的各線粒體DNA分別都是使用所說的適當(dāng)引物組，經(jīng)所說的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的，其后不經(jīng)克隆而使用所說的適當(dāng)引物以染料終止法直接測定線粒體DNA非編碼區(qū)的序列，從而定位所說的多數(shù)不同扇貝間的所說非編碼區(qū)中的多個不同的核苷酸堿基取代座位。
8．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的扇貝是日本扇貝Patinopecten yessoensis，其中所說的適當(dāng)引物組包括Pyso 16S BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)和Pyso 12S BR引物(5′-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3′)，并且其中所說的適當(dāng)引物包括Pyso 16S BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)、Pyso NcR引物(5′-AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3′)和Pyso 12S AR引物(5′-ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3′)。
9．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的扇貝是日本扇貝Patinopecten yessoensis，其中所說的適當(dāng)引物組包括Pyso 16S BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)和Pyso 12S BR引物(5′-AGAGCGACGGGCGATGTGTACAC-3′)，并且其中所說的適當(dāng)引物包括Pyso 16S BF引物(5′-CGGCGAAGCCAGGTCAGTTTCTATC-3′)、Pyso NcR引物(5′-AGGTAACCAGAACCAAACTACC-3′)和Pyso 12S AR引物(5′-ACTGCTGGCACCTGGTTGGA-3′)，其中所說的日本扇貝以多數(shù)給出以提供許多日本扇貝，其中所說的許多日本扇貝被分成至少一個扇貝群體，其中，在所說的擴(kuò)增線粒體DNA的步驟中，使用所說的Pyso 16S BF和Pyso 12S BR引物組擴(kuò)增所說的至少一個扇貝群體的各自的線粒體DNA，從而確定所說的各至少一個扇貝群體中的約1.3kbp線粒體DNA，其中，在所說的測定如此擴(kuò)增之線粒體DNA的序列的步驟中，確定所說的大約1.3kbp線粒體DNA的核苷酸堿基序列，同時確定其中的非編碼區(qū)，并且其中在測定非編碼區(qū)的序列的步驟中，使用所說的Pyso 16S BF、Pyso NcR和Pyso 12S AR引物測定所說的非編碼區(qū)的序列；以便定位所說的各至少一個扇貝群體非編碼區(qū)中的核苷酸堿基取代座位，從而確定其中的序列多態(tài)性，并將所說的至少一個扇貝群體中的許多日本扇貝分類為特定的譜系。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的至少一個扇貝群體包括棲居于日本Hokkaido的Saroma湖的一個扇貝群體和棲居于日本Aomori海岸線的另一個扇貝群體。
11．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的約1.3kbp線粒體DNA的核苷酸堿基序列如附圖4(B)中所示編碼。
12．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的扇貝是日本扇貝，并且其中所說的方法進(jìn)一步包括確定所說日本扇貝的線粒體DNA的過程，所說的過程包括以下步驟提供第一種外國扇貝；從所說的日本扇貝和第一種外國扇貝的閉殼肌中提取作為模板DNA的總DNA；使用適合于所說的日本扇貝和第一種外國扇貝的引物組，借助聚合酶鏈反應(yīng)從所說的總DNA擴(kuò)增靶DNA片段，以從日本扇貝得到第一個擴(kuò)增的DNA片段并從第一種外國扇貝得到第二個擴(kuò)增的DNA片段，其中所說的引物組是基于已知的有殼的水生動物線粒體16S rRNA和12S rRNA基因間保守的核苷酸序列設(shè)計的；測定所說的第一個和第二個擴(kuò)增的DNA片段的序列；進(jìn)一步證實所說的第一個和第二個擴(kuò)增的DNA片段間堿基對長度的差異，從而區(qū)分開日本扇貝和外國扇貝的基因組結(jié)構(gòu)；確定所說的第一個擴(kuò)增的DNA片段中16S rRNA和12S rRNA基因的位置；將所說的第一個擴(kuò)增的DNA片段的所說的16S rRNA和12SrRNA基因與具有Genbank登記號X92688中登記之核苷酸堿基序列的第二種外國扇貝Pecten maximus線粒體DNA中的相應(yīng)基因相比較；并且找出所說的第二種外國扇貝和所說的日本扇貝之間的同源性，從而確定所說的第一個擴(kuò)增的DNA片段為日本扇貝線粒體DNA。
13．分析多種扇貝的譜系的方法，該方法包括以下步驟提供選自所說的多種扇貝之不同群體的不同的扇貝樣品；從所說的不同扇貝樣品的各自的閉殼肌中提取作為模型DNA的總DNA；使用基于在已知有殼水生動物線粒體16S rRNA和12S rRNA基因之間保守的核苷酸堿基序列設(shè)計的適當(dāng)引物組，借助聚合酶鏈反應(yīng)從所說的各模板DNA擴(kuò)增線粒體DNA片段；針對各個所說的不同扇貝樣品對如此擴(kuò)增的線粒體DNA片段進(jìn)行分組，從而提供分別相當(dāng)于各個所說的不同扇貝群體的不同的組；測定各個所說的不同組中所說擴(kuò)增的線粒體DNA片段的序列，同時確定其中的非編碼區(qū)，以便確定線粒體DNA片段的核苷酸堿基序列；然后，使用基于所說的線粒體DNA片段的核苷酸堿基序列而設(shè)計的適當(dāng)引物測定所說的非編碼區(qū)的序列，以致就每個所說的不同組定位所說非編碼區(qū)中的核苷酸堿基取代座位，從而確定每個所說的不同組中的序列多態(tài)性；并且將所說的不同扇貝樣品分類成其在各所說不同扇貝群體中的各自的特定譜系。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中借助染料終止方法測定所說的擴(kuò)增之線粒體DNA片段和所說的非編碼區(qū)的序列。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟比較所說的不同扇貝樣品之間的核苷酸堿基取代座位；從所說的不同的扇貝樣品中選擇特定的扇貝樣品，所說的特定樣品在所說的核苷酸堿基取代座位上是彼此相同的；得到所說特定扇貝樣品之間的高群體頻率，并且基于所說的高群體頻率確定所說特定樣品間的祖先同一性，以便找出所說的不同扇貝群體間的同一祖先。
全文摘要
分析扇貝的系統(tǒng)發(fā)育譜系的方法,其包括測定扇貝線粒體DNA的序列以確定線粒體DNA的核苷酸堿基序列,其中核苷酸堿基序列包括其中含有核苷酸堿基取代座位的非編碼區(qū),其顯示作為特定的扇貝譜系指征的序列多態(tài)性。使用基于在已知的有殼水生動物線粒體16SrRNA和12SrRNA基因間保守的核苷酸堿基序列所設(shè)計的適當(dāng)?shù)囊锝M,經(jīng)PCR擴(kuò)增扇貝的線粒體DNA,然后測序以確定其中的非編碼區(qū)。在這種非編碼區(qū)中,定位核苷酸堿基取代座位,由此確定扇貝的特殊譜系?；谶@些步驟,分析日本扇貝Patinopecten yessoensis的核苷酸堿基序列和其譜系。
文檔編號A01K61/00GK1322845SQ0111089
公開日2001年11月21日 申請日期2001年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月16日
發(fā)明者長島浩二, 佐藤希實 申請人:北海道漁業(yè)協(xié)同組合連合會, 長島浩二