β-谷甾醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種β?谷甾醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的建立方法。首先取β?谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度，用氣相色譜儀檢測(cè)得到不同濃度的峰面積，經(jīng)計(jì)算得到峰面積與濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式。然后分別從油茶籽、橄欖果子提取的油茶籽油和橄欖油，或商品油取微量樣品進(jìn)行高溫皂化處理，用石油醚萃取β?谷甾醇，用氣相色譜儀檢測(cè)得到樣品中β?谷甾醇的峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式，得到樣品的β?谷甾醇含量。最后，對(duì)所有油茶籽油、橄欖油的β?谷甾醇含量作差異統(tǒng)計(jì)分析，得出油茶籽油、橄欖油的β?谷甾醇含量。本發(fā)明樣品前處理簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)直觀可靠，重復(fù)性好。
【專利說明】
卜谷甾醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢測(cè)中油脂檢測(cè)領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及一種用谷甾醇作為 橄欖油和油茶籽油鑒別依據(jù)的氣相色譜檢測(cè)方法及判別標(biāo)準(zhǔn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 橄欖油是一種原產(chǎn)于地中海的古老油種，具有減少心腦血管疾病發(fā)生、改善人體 消化系統(tǒng)功能、抗癌、防衰老、促進(jìn)血液循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多種功效，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在世 界早已得到公認(rèn)，被譽(yù)為"液體黃金"，"植物油皇后"。油茶籽油是從山茶科油茶樹種子中提 煉出的中國本土古老的油種，其化學(xué)性質(zhì)與橄欖油極其相似，尤其是脂肪酸組成。油茶籽油 因其具有預(yù)防心血管疾病、抗氧化清除自由基等功效也具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有著"東方橄 欖油"、"長(zhǎng)壽油"的美譽(yù)。
[0003] 中國是油茶的原產(chǎn)地，是世界上最大的油茶籽油生產(chǎn)國，深受國內(nèi)消費(fèi)者歡迎，因 產(chǎn)量有限，近年來價(jià)格處于上漲趨勢(shì)。國內(nèi)市場(chǎng)的橄欖油主要從歐洲進(jìn)口。橄欖油分為壓油 和溶劑提取的果渣油兩類，通常壓榨橄欖油作為食用油，價(jià)格較高，而果渣油一般作為工業(yè) 用油，用于化妝品和日化用品、飼料，價(jià)格不高，甚至大大低于國產(chǎn)油茶籽油。過去中國市場(chǎng) 出現(xiàn)的油茶籽油一般是其價(jià)格較低的棕櫚油等。隨著食用油檢測(cè)中氣相色譜儀的普遍采 用，通過脂肪酸分布和含量，用其常用食用油冒充油茶籽油已很容易鑒別，近年來為此不法 商人開始用脂肪酸分布和比例與油茶籽油相似的進(jìn)口劣質(zhì)果渣橄欖油冒充油茶籽油，在浙 江省已查處多起用果渣橄欖油冒充油茶籽油的重大案件。據(jù)2012年8月8日衢州日?qǐng)?bào)報(bào)道， 該市質(zhì)監(jiān)部門曾針對(duì)用橄欖果渣油冒充油茶籽油的違法失信行為開展了專項(xiàng)治理。安徽省 霍山縣專項(xiàng)整治油茶籽油活動(dòng)中也曾將"油橄欖果渣油"冒充油茶籽油作為查處內(nèi)容。但迄 今尚未見可有效鑒別橄欖油冒充油茶籽油的現(xiàn)成檢測(cè)方法。
[0004] 現(xiàn)行中國國標(biāo)《GB11765-2003油茶籽油》中沒有關(guān)于對(duì)脂肪酸組成類似的橄欖油 的鑒別方法，公開的專利申請(qǐng)中有利用物理檢測(cè)手段鑒別橄欖油品種及橄欖油品質(zhì)的內(nèi) 容，如采用拉曼光譜特征峰信號(hào)強(qiáng)度比值的橄欖油快速檢測(cè)方法（申請(qǐng)?zhí)?200810106530.9)，但它所指的摻假油脂并未涉及油茶籽油和橄欖油的鑒別，且所需儀器價(jià) 格昂貴，不易操作，數(shù)據(jù)分析繁瑣。有關(guān)于油茶籽油鑒別的專利，如"一種鑒別油茶籽油真?zhèn)?的簡(jiǎn)捷方法（申請(qǐng)?zhí)朇N201010217382.5 )"，根據(jù)該專利申請(qǐng)描述，利用油茶籽油含留體成分 與顯色劑可顯色的特點(diǎn)，可區(qū)別其他不含留體的植物油，但該方法對(duì)橄欖油和其他含有甾 體成分的植物油并不適用。此外，顯色反應(yīng)精確度不高，不適合定量分析。也有一些文獻(xiàn)和 標(biāo)準(zhǔn)有涉及油茶籽油摻偽的鑒別方法，主要依據(jù)是油茶籽油的脂肪酸組成，如浙江省地方 標(biāo)準(zhǔn)《9種摻假山茶油定性鑒別氣相色譜法(DBA3/T 735-200)》采用油茶籽油的脂肪酸組 成:棕櫚酸大于10%，油酸小于74%，亞麻酸大于0.6%，芥酸大于0.5%作為鑒別指標(biāo)，但因 橄欖油的脂肪酸組成也與此基本相似，所以該檢測(cè)方法難以將油茶籽油與脂肪酸組成相似 的橄欖油區(qū)別開來。周建平和郭華在"油茶籽油定量測(cè)定方法研究"（《中國油脂》2003年第 28卷第2期55-57頁)采用了醋酸酐-濃硫酸顯色發(fā)鑒別油茶籽油中有色絡(luò)合物方法，但其化 學(xué)原理可能是與殘留的茶皂素產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，但我們通過反復(fù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該法效果不穩(wěn)定， 重現(xiàn)行不好，特別是對(duì)純度較高的油茶籽油不適用。
[0005] 鐘冬蓮等的《氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食用植物油中谷甾醇含量》《中國油脂》 2015年第40卷第2期95-97頁中有關(guān)于多種油脂，包括油茶籽油和橄欖油中谷留醇含量的 測(cè)定，楊春英等的《氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定14種食用植物油中的植物留醇》《中國糧油學(xué) 報(bào)》2013年第28卷第2期123-125頁中也有關(guān)于橄欖油中谷甾醇的測(cè)定，但兩篇論文只涉 及谷留醇檢測(cè)的方法學(xué)論證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的主要在于提供一種谷留醇作為橄欖油 和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的建立方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 一種谷留醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的建立方法，包括以下步驟：
[0009] (1)取谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)正己烷配制成梯度溶液，通過GC測(cè)定，建立標(biāo)準(zhǔn) 曲線；
[0010] (2)將橄欖果破碎去殼，用物理壓榨法提取橄欖油；通過化學(xué)溶劑法提取油茶籽 油；
[0011] (3)取微量標(biāo)準(zhǔn)橄欖油或者油茶籽油;橄欖油的取樣量為5mg，油茶籽油為100mg;
[0012] (4)加入氫氧化鉀-乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行高溫皂化處理；
[0013] (5)7令卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液后用石油醚萃取樣品中的谷甾醇；
[0014] (6)靜置分層，分離上清液后加入純水，洗至中性；
[0015] (7)靜置分層，分離上清液后加入少量無水硫酸鈉；
[0016] (8)震蕩后離心，取上清液并用氮?dú)獯蹈桑?br>[0017] (9)加入有機(jī)溶劑復(fù)溶后過膜;所述有機(jī)溶劑為正己烷，過0.45M1的有機(jī)膜；
[0018] (10)氮?dú)獯蹈珊蠹尤胝和閺?fù)溶后進(jìn)GC進(jìn)行檢測(cè)；
[0019] (11)將氣相色譜圖上谷甾醇峰面積參考標(biāo)準(zhǔn)曲線得到谷甾醇含量;對(duì)油茶籽 油和橄欖油谷留醇含量進(jìn)行差異性分析;所述的差異性分析采用方差分析，得到橄欖油 和油茶籽油中谷留醇含量差別P值；
[0020] (12)利用GC-MS對(duì)樣品中e-谷甾醇和標(biāo)準(zhǔn)品e-谷甾醇的出峰時(shí)間、碎片圖和化學(xué) 結(jié)構(gòu)比對(duì)；
[0021] (13)確認(rèn)谷甾醇適合作為鑒別茶籽油、橄欖油的標(biāo)記物。
[0022] 步驟（11)中所述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的線性回歸方程：y = 0.3163x_1.7637，R2 = 0.9999。
[0023] 所述步驟（11)中，橄欖油、油茶籽油中谷甾醇含量分別為1.45 ± 0.40mg/g和0.2 ±0.05mg/g，p = 0.0001，具有顯著性差異。
[0024] 所述步驟(4)中氫氧化鉀-乙醇溶液濃度為2mol/L，添加量為5mL，皂化溫度為85 °C，皂化時(shí)間為60min。
[0025] 所述步驟(8)中，離心速度為2000r/min，離心時(shí)間為5min。
[0026] 所述步驟（11)氣相色譜中，所用色譜柱為HP-5MS，30mX0.25mmX0.25wn，儀器為 Agilent 7890A型氣相色譜儀器。
[0027]進(jìn)一步，所述氣相色譜條件為:載氣:氮?dú)?進(jìn)樣口溫度:250°C ;檢測(cè)器溫度270°C ; 柱溫 100°(：，21^11，15°(：/111111升溫至290°(：，10111111;進(jìn)樣量1此，分流比50 :1。
[0028] -種所述谷甾醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的應(yīng)用，包括以下步驟:從 待測(cè)的橄欖油或油茶籽油中取樣品進(jìn)行高溫皂化處理，用石油醚萃取谷甾醇，用氣相色 譜儀檢測(cè)得到待測(cè)樣品中谷留醇的峰面積，將峰面積代入所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣 品的谷甾醇含量;將待測(cè)樣品的谷甾醇含量與參考橄欖油或參考油茶籽油中的谷甾 醇含量相比較，判斷待測(cè)的橄欖油或油茶籽油的種屬來源或者真?zhèn)巍?br>[0029] 本發(fā)明的有益效果是：
[0030] (1)本發(fā)明以谷甾醇為標(biāo)記物，對(duì)橄欖油和油茶籽油進(jìn)行鑒別，方法簡(jiǎn)便，一般 具有氣相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行；
[0031] (2)該方法重復(fù)性好，結(jié)果可靠，加標(biāo)回收率95%-100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在1.47%-3.26% ；
[0032] (3)該方法取樣量少，極大的減少了樣品的損耗，檢測(cè)效率高；
[0033] (4)該方法能對(duì)目前沒有鑒別橄欖油和油茶籽油的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)提供極大參考；
[0034] (5)該方法直接從原料中提取油脂，極大避免了加工過程中對(duì)谷甾醇含量的影 響和人為添加的因素。
【附圖說明】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0036]圖1是谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜；
[0037]圖2是油茶籽油與橄欖油谷甾醇含量差異分析；
[0038]圖3是提取油茶籽油GC-MS圖譜；
[0039]圖4是提取油茶籽油中谷甾醇結(jié)構(gòu)式；
[0040]圖5是鮮榨橄欖油GC-MS圖譜；
[0041]圖6是鮮榨橄欖油中谷甾醇結(jié)構(gòu)式；
[0042] 圖7是谷甾醇標(biāo)樣GC-MS圖譜；
[0043]圖8是谷甾醇標(biāo)樣結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明系統(tǒng)地論證了多種自提和市售橄欖油及油茶籽油中谷甾醇的含量，建立 了一種基于谷留醇含量鑒別橄欖油和油茶籽油的氣相色譜檢測(cè)方法及判別標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明 采用化學(xué)方法，以最為常用的氣相色譜儀為檢測(cè)工具，通過簡(jiǎn)單的前處理過程，能夠較好的 分離谷留醇，通過峰面積的比較可直接做出結(jié)果判斷，通過外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線則可以 定量測(cè)定油品中的谷留醇濃度，從而鑒別橄欖油和油茶籽油，方法重復(fù)性好，數(shù)據(jù)直觀可 與巨〇
[0045] 1、取谷留醇標(biāo)準(zhǔn)品，配制成梯度溶液，用氣相色譜儀器檢測(cè)，通過濃度和峰面積 的關(guān)系得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和濃度計(jì)算公式。
[0046] 2、從油茶籽和橄欖果子中提取油茶籽油和橄欖油，油茶籽油的提取采用化學(xué)溶劑 法，提取溶劑為正己烷，橄欖油的提取采用物理壓榨法。
[0047] 3、取微量(茶油為100mg，橄欖油為5mg)待測(cè)樣品于30mL試管中，加入5mL的2mol/L K0H-乙醇溶液;置于85 °C水浴鍋中皂化lh后移出冷卻；加入5mL飽和NaCl溶液，再加入4mL石 油醚;充分震蕩后靜置分層，取上清液于試管中，加入4mL純水水洗至中性，取上層液體于另 一試管中，并加入少量無水硫酸鈉;震蕩后以2000r/min離心5min;轉(zhuǎn)移上清液于新試管中， 氮吹至無液體;加入2mL正己烷(分析純）充分溶解后過過膜13*0.45wii有機(jī)濾膜）；再次 氮吹至干，1〇〇此正己烷(色譜純)復(fù)溶后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。檢測(cè)步驟如下：
[0048] 4、氣相色譜分析：用Agilent 7890A型氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸，用安捷倫化學(xué)工作 站采集圖譜，并處理分析所采集的譜圖數(shù)據(jù)。色譜峰采用谷留醇標(biāo)樣來進(jìn)行鑒定。定量方 式采用面積法，定量方法為外標(biāo)法。
[0049] 5、譜圖采集處理:采用與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)照的方法定性，即根據(jù)相對(duì)保留值定 性;采用外標(biāo)法定量，即通過不同濃度谷留醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣 品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出相應(yīng)濃度。
[0050] 6、氣相色譜分析條件:色譜條件:HP-5MS( 30m X 0 ? 25mm X 0 ? 25WH)毛細(xì)管柱;載氣： 高純氮?dú)?進(jìn)樣口溫度:250°C;檢測(cè)器(FID)溫度270°C;柱溫100°C(2min)，15°C/min升溫至 290°C(10min);進(jìn)樣量1此，分流比50:1。
[0051 ] 7、利用GC-MS對(duì)樣品中谷甾醇和標(biāo)準(zhǔn)品谷甾醇的出峰時(shí)間、碎片圖和化學(xué)結(jié) 構(gòu)比對(duì)。GC-MS色譜條件和GC相同，質(zhì)譜條件為：溶劑延遲3.5min;離子源:EI;離子源溫度： 230°C ;電子能量70eV;MSD傳輸線溫度:250°C ; 谷留醇定性離子m/z 231.2和329.3。
[0052] 實(shí)施例一:建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0053]以正己烷為溶劑，配制濃度為20-600mg/L的谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。以谷甾醇濃度 (mg/L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)，0_谷留醇的線性回歸方程:y = 0.3163x-1.7637(R2 = 0.9999)。最低檢出限（L0D):以基線噪音的3倍所對(duì)應(yīng)的濃度為標(biāo) 準(zhǔn)，本方法為3.57yg/mL。
[0054]檢測(cè)具體樣品時(shí)，將樣品中谷甾醇峰面積代入回歸方程可計(jì)算得到樣品濃度， 再將濃度代入以下計(jì)算公式，可換算得到相應(yīng)的含量(yg/g):
[0056] 式中:X:原樣品油中谷留醇含量，單位為毫克每克(mg/g);
[0057] Cs:進(jìn)樣溶液中谷甾醇含量，由樣中谷甾醇面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得，單位 為毫克每升(mg/g);
[0058] V:進(jìn)樣溶液總體積，單位為微升(yL);
[0059] m:前處理時(shí)待測(cè)樣品取樣量，單位為克(g)。
[0060]實(shí)施例二:樣品采集及e-谷甾醇含量測(cè)定 [0061 ] 1、油茶籽及橄欖果采集及油脂提取
[0062]本實(shí)施例中所檢測(cè)的共有20種油茶籽油和橄欖油(表1)。其中編號(hào)1-11的油茶籽 和編號(hào)13-16的橄欖果由中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所提供。
[0063] 表1待檢測(cè)樣品明細(xì)
[0065]將鮮橄欖果粉碎后取出果核，加入少量水，充分粉碎并攪拌后離心，上清液即為鮮 榨橄欖油。取適量油茶籽仁置于50°C烘箱中一定時(shí)間。從烘箱中取出后冷卻至室溫，精確稱 量烘干后的油茶籽仁6g，用剪刀將油茶籽仁剪碎置于玻璃管中，按料液比l:5g/mL加入正己 烷，在水浴溫度50°C條件下超聲輔助萃取30min后離心分層，取上清。將含有油茶籽油的上 清液旋蒸后烘干至恒重后即得油茶籽油。
[0066] 2、樣品前處理
[0067]取微量（茶油為100mg，橄欖油為5mg)待測(cè)樣品于30mL試管中，加入5mL的2mol/L K0H-乙醇(5.6g氫氧化鉀，50mL無水乙醇)溶液;置于85 °C水浴鍋中皂化lh后移出冷卻;加入 5mL飽和NaCl溶液，再加入4mL石油醚;充分震蕩后靜置分層，取上清液于試管中，加入4mL純 水水洗至中性，取上層液體于另一試管中，并加入少量無水硫酸鈉;震蕩后以2000r/min離 心5min;轉(zhuǎn)移上清液于新試管中，氮吹至無液體;加入2mL正己烷(分析純）充分溶解后過過 膜(0.45M1有機(jī)濾膜）；再次氮吹至干，lOOiiL正己烷(色譜純)復(fù)溶后進(jìn)樣。
[0068] 3、儀器及條件
[0069] 儀器型號(hào)：Agilent 7890A;色譜條件：HP-5MS(30mX0 ? 25mmX0 ? 25_)毛細(xì)管柱； 載氣：高純氮?dú)?進(jìn)樣口溫度:250°C ;檢測(cè)器(FID)溫度270°C ;柱溫100°C(2min)，15°C/min 升溫至290°C(10min);進(jìn)樣量1此，分流比50:1。
[0070] 4、檢測(cè)結(jié)果
[0071 ]將前處理后通過氣相色譜檢測(cè)出的谷甾醇的峰面積代入谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線可 定量計(jì)算出谷甾醇在每一樣品中的實(shí)際濃度。再將濃度代入以下計(jì)算公式，
.可換算得到相應(yīng)的含量(yg/g):式中：x:樣品油中谷留醇含量，單位為 毫克每克(mg/g);Cs:進(jìn)樣溶液中谷留醇濃度，由樣品中谷留醇峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì) 算所得，單位為毫克每升(mg/g)); V:進(jìn)樣溶液總體積，單位為微升(此）;m:前處理時(shí)待測(cè)樣 品取樣量，單位為克(g)。
[0072] 14種油茶籽油中谷甾醇含量的檢測(cè)結(jié)果如表2所示，6種橄欖油中谷甾醇含量 的檢測(cè)結(jié)果如表3所示。
[0073] 表2各種油茶籽油谷甾醇含量測(cè)定結(jié)果
[0075]表3各種橄欖油的谷甾醇含量測(cè)定結(jié)果
[0077] 5、橄欖油和油茶籽油中谷甾醇含量分析
[0078] 將24種油茶籽油和6種橄欖油中谷甾醇含量進(jìn)行對(duì)比（圖2)，結(jié)合表2和表3中可 以看出橄欖油、油茶籽油中谷甾醇含量分別為1.45 ± 0.40mg/g和0.2 ± 0.05mg/g，橄欖油 的谷甾醇含量是油茶籽油的7.25倍，具有顯著性差異(p = 0.0001<0.01)，此結(jié)果表明^3-谷甾醇是一種有效的鑒別橄欖油和油茶籽油的標(biāo)記物。
[0079] 實(shí)施例二谷甾醇加標(biāo)回收
[0080] 取0. lg油茶籽油，按具體實(shí)施方法中的描述進(jìn)行樣品前處理，每個(gè)樣品重復(fù)5次。 同時(shí)取0. lg油茶籽油樣品兩份，分別添加含有0. lmg/g和0.4mg/g的谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。方法精密度與回收率見表4。結(jié)果標(biāo)明該方法回收率在100%-95 %之間，相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.47 % -3.26 %之間。
[0081]表4油茶籽油中加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0083] 實(shí)施例三:GC-MS對(duì)樣品中谷甾醇和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì) [0084] 1、樣品前處理
[0085] 取微量（茶油為100mg，橄欖油為5mg)待測(cè)樣品于30mL試管中，加入5mL的2mol/L K0H-乙醇(5.6g氫氧化鉀，50mL無水乙醇)溶液;置于85 °C水浴鍋中皂化lh后移出冷卻;加入 5mL飽和NaCl溶液，再加入4mL石油醚;充分震蕩后靜置分層，取上清液于試管中，加入4mL純 水水洗至中性，取上層液體于另一試管中，并加入少量無水硫酸鈉;震蕩后以2000r/min離 心5min;轉(zhuǎn)移上清液于新試管中，氮吹至無液體;加入2mL正己烷(分析純）充分溶解后過過 膜(0.45M1有機(jī)濾膜）；再次氮吹至干，lOOiiL正己烷(色譜純)復(fù)溶后進(jìn)樣。
[0086] 2、儀器條件
[0087]儀器型號(hào)：Agilent 6890B;色譜條件：HP-5MS UI(30mX0.25mmX0.25wii)超高惰 性毛細(xì)管柱;載氣:高純氦氣;進(jìn)樣口溫度:250°C;柱溫100°(：(21^11)，15°(：/111111升溫至2901€ (lOmin);進(jìn)樣量1此。質(zhì)譜條件:溶劑延遲3.5min;離子源:EI;離子源溫度:230°C ;電子能量 70eV;MSD傳輸線溫度:250°C ;谷留醇定性離子m/z 231.2和329.3。3、結(jié)果分析 [0088] 油茶籽油和橄欖油經(jīng)過前處理后，樣品通過GC-MS檢測(cè)（如圖3和圖5)，與質(zhì)譜庫中 數(shù)據(jù)對(duì)比后相似度最高的物質(zhì)為谷甾醇。直接用谷甾醇標(biāo)樣進(jìn)入GC-MS檢測(cè)（如圖7)， 發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間完全吻合，谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖見圖8,樣品中谷甾醇的質(zhì)譜圖見圖4 和圖6。由以上可見樣品中谷甾醇和標(biāo)準(zhǔn)品谷甾醇的保留時(shí)間、化學(xué)結(jié)構(gòu)式和離子碎片 一致。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種β-谷留醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的建立方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 取β-谷留醇標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)正己烷配制成梯度溶液，通過GC測(cè)定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2) 將橄欖果破碎去殼，用物理壓榨法提取橄欖油;通過化學(xué)溶劑法提取油茶籽油； (3) 取微量標(biāo)準(zhǔn)橄欖油或者油茶籽油;橄欖油的取樣量為5 mg，油茶籽油為100 mg; (4) 加入氫氧化鉀-乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行高溫皂化處理； (5 )冷卻至室溫，加入飽和氯化鈉溶液后用石油醚萃取樣品中的β-谷甾醇； (6 )靜置分層，分離上清液后加入純水，洗至中性； (7 )靜置分層，分離上清液后加入少量無水硫酸鈉； (8) 震蕩后離心，取上清液并用氮?dú)獯蹈桑? (9) 加入有機(jī)溶劑復(fù)溶后過膜;所述有機(jī)溶劑為正己烷，過0.45 μπι的有機(jī)膜； (10) 氮?dú)獯蹈珊蠹尤胝和閺?fù)溶后進(jìn)GC進(jìn)行檢測(cè)； (11) 將氣相色譜圖上β-谷留醇峰面積參考標(biāo)準(zhǔn)曲線得到β-谷留醇含量;對(duì)油茶籽油和 橄欖油β-谷留醇含量進(jìn)行差異性分析;所述的差異性分析采用方差分析，得到橄欖油和油 茶籽油中β-谷留醇含量差別P值； (12) 利用GC-MS對(duì)樣品中β-谷甾醇和標(biāo)準(zhǔn)品β-谷甾醇的出峰時(shí)間、碎片圖和化學(xué)結(jié)構(gòu) 進(jìn)行比對(duì)； (13) 確認(rèn)β-谷留醇適合作為鑒別茶籽油、橄欖油的標(biāo)記物。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(11)中所述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的線性回歸方 程：y=0 · 3163χ-1 · 7637，R2=0 · 9999。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（11)中，橄欖油、油茶籽油中β_谷甾 醇含量分別為1·45±0·40 mg/g和0·2±0·05 mg/g，p=0.0001，具有顯著性差異。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中氫氧化鉀-乙醇溶液濃度為2 mol/L，添加量為5 mL，皂化溫度為85 °C，皂化時(shí)間為60 min。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(8)中，離心速度為2000 r/min，離 心時(shí)間為5 min。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（11)氣相色譜中，所用色譜柱為即-5MS，30 mXO.25 mmXO.25 μπι，儀器為Agilent 7890A型氣相色譜儀器。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的氣相色譜條件為:載氣:氮?dú)?進(jìn)樣口 溫度：250 °C;檢測(cè)器溫度270 °C;柱溫100 °C，2 min，15 °C/min升溫至290 °C，10 min;進(jìn) 樣量I yL，分流比50:1。8. -種如權(quán)利要求1所述β_谷留醇作為橄欖油和油茶籽油鑒別標(biāo)記物的應(yīng)用，其特征 在于，包括以下步驟:從待測(cè)的橄欖油或油茶籽油中取樣品進(jìn)行高溫皂化處理，用石油醚萃 取β-谷甾醇，用氣相色譜儀檢測(cè)得到待測(cè)樣品中β-谷甾醇的峰面積，將峰面積代入所述的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品的β-谷甾醇含量;將待測(cè)樣品的β-谷甾醇含量與參考橄欖油或參 考油茶籽油中的β -谷甾醇含量相比較，判斷待測(cè)的橄欖油或油茶籽油的種屬來源或者真 偽。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105911159SQ201610218423
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月7日
【發(fā)明人】沈立榮, 翟量, 辛?xí)澡? 祝洪剛
【申請(qǐng)人】浙江常發(fā)糧油食品有限公司, 浙江大學(xué)