本發(fā)明涉及基因表達(dá)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

等位基因(allele又作allelomorph)一般指位于一對(duì)同源染色體的相同位置上控制著相對(duì)性狀的一對(duì)基因。

等位基因的不平衡表達(dá)(allelic expression imbalance，AEI)為同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，每個(gè)基因通常有2個(gè)拷貝，由于順式作用使基因的2個(gè)拷貝的表達(dá)比例偏離了1：l。等位基因的不平衡表達(dá)現(xiàn)象普遍存在，除了遺傳印跡基因的絕對(duì)不平衡表達(dá)外，有相當(dāng)數(shù)量的基因在部分個(gè)體、同一個(gè)體不同時(shí)空上存在AEI。并與基因組一些特定區(qū)域的多態(tài)位點(diǎn)相關(guān)。

目前，常用的等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)主要有基于電泳技術(shù)采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)、測(cè)序法、表達(dá)譜芯片法以及SNaPshot技術(shù)，測(cè)序法和SNaPshot價(jià)格比較昂貴，且須以相關(guān)的大型儀器平臺(tái)作為支撐，實(shí)驗(yàn)操作靈活性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)成本高、準(zhǔn)確性差的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

1)比較候選基因序列，篩選出標(biāo)記等位基因的SNPs位點(diǎn)；

2)根據(jù)所述步驟1)篩選到的SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物，所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對(duì)正向引物或反向引物3'末端與SNP位點(diǎn)3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾；

3)用所述qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物分別對(duì)待測(cè)樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；在PCR擴(kuò)增過程中檢測(cè)擴(kuò)增曲線，在PCR擴(kuò)增結(jié)束后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線；

4)若擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，根據(jù)PCR擴(kuò)增的Ct值計(jì)算得到待測(cè)樣本等位基因表達(dá)特異性；

所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對(duì)引物3'末端與SNP位點(diǎn)3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾。

優(yōu)選的，步驟3)中所述待測(cè)樣本為林木樹種。

優(yōu)選的，所述待測(cè)樣本為毛果楊或巨桉。

優(yōu)選的，當(dāng)待測(cè)樣品為毛果楊時(shí)，所述SNP位點(diǎn)位于熱激轉(zhuǎn)錄因子基因2上。

優(yōu)選的，所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和反向引物SEQ ID NO.4；所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾；所述簡(jiǎn)并引物包括正向簡(jiǎn)并引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4。

優(yōu)選的，當(dāng)待測(cè)樣品為巨桉時(shí)，所述SNP位點(diǎn)位于MYB轉(zhuǎn)錄因子基因上。

優(yōu)選的，所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和反向引物SEQ ID NO.8；所述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾；所述簡(jiǎn)并引物包括正向簡(jiǎn)并引物SEQ ID NO.7和反向引物SEQ ID NO.8。

優(yōu)選的，所述待測(cè)樣本cDNA的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃3min；變性94℃10s，退火62℃30s，延伸72℃40s；40個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選的，所述待測(cè)樣本cDNA的PCR擴(kuò)增體系包括：20ng/μL的待測(cè)樣品cDNA，1μL；SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，10μL；10μM的正向引物0.5μL；10μM的反向引物0.5μL；雙蒸水8μL。

優(yōu)選的，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述待測(cè)樣本等位基因表達(dá)特異性計(jì)算的公式為2^-ΔCt，ΔCt＝候選等位基因基因型R的Ct值-候選等位基因基因型R’的Ct值；所述基因型R為A、T、C和G中的一種，所述基因型R’為A、T、C和G中除R以外的三種中的一種。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所提供的方法，采用LNA鎖核酸修飾的引物對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，當(dāng)熔解曲線為單峰時(shí)，以PCR擴(kuò)增的Ct值計(jì)算等位基因不平衡表達(dá)特異性水平。本發(fā)明提供的方法采用LNA鎖核酸修飾引物，可提高退火溫度，增強(qiáng)堿基配對(duì)的特異性，能夠極大地降低錯(cuò)配發(fā)生的概率，增加了檢測(cè)結(jié)果的精確性和可靠性，并且所述方法僅僅采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器即可完成整個(gè)技術(shù)方案，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)配套條件，顯著地降低了實(shí)驗(yàn)成本。

附圖說明

圖1為毛果楊熱擊轉(zhuǎn)錄因子基因2的等位基因擴(kuò)增曲線；

圖2為巨桉MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的等位基因擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種植物等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)比較候選基因序列，篩選標(biāo)記等位基因的SNPs位點(diǎn)；2)根據(jù)篩選到的SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物；3)用qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物分別對(duì)待測(cè)樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；4)若擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，根據(jù)PCR擴(kuò)增的Ct值計(jì)算待測(cè)樣本等位基因表達(dá)特異性；所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對(duì)引物3'末端與SNP位點(diǎn)3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾。

本發(fā)明提供的檢測(cè)方法適用于植物等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)，優(yōu)選的待測(cè)樣本為林木樹種，更優(yōu)選的待測(cè)樣本為毛果楊或巨桉。

在本發(fā)明中，比較候選基因序列，篩選出標(biāo)記等位基因SNPs位點(diǎn)時(shí)針對(duì)物種的種類選擇以下兩種方法：針對(duì)模式物種，通過物種重測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行候選基因SNPs位點(diǎn)篩選，所述重測(cè)序數(shù)據(jù)庫優(yōu)選的為Phytozome數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址為https://phytozome.jgi.doe.gov/；具體的在利用重測(cè)序數(shù)據(jù)庫篩選SNPs位點(diǎn)時(shí)，篩選的SNPs位點(diǎn)滿足以下條件：篩選的SNPs位點(diǎn)在群體中的頻率大于5％，并且該位點(diǎn)在個(gè)體中為雜合狀態(tài)。

對(duì)于非模式物種，通過候選基因cDNA克隆進(jìn)行等位基因SNPs位點(diǎn)篩選，具體的在候選基因cDNA克隆進(jìn)行等位基因SNPs位點(diǎn)篩選時(shí)，至少進(jìn)行8個(gè)克隆測(cè)序，等位基因SNPs位點(diǎn)篩選成功率達(dá)到99.8％以上。所述候選基因cDNA克隆和篩選的方法采用本領(lǐng)域常規(guī)的基因克隆和篩選的方法即可，在本發(fā)明具體的包括以下步驟：根據(jù)候選基因保守序列設(shè)計(jì)引物,以cDNA為模板，擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段。使用Takara公司的PMD-18T載體進(jìn)行重組質(zhì)粒的連接，連接體系為：5μL Solution I,，1μLpMD-18T Vector(50ng/μL),2μL PCR產(chǎn)物，12μL雙蒸水，16℃連接過夜。然后進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：1)取5uL上述連接產(chǎn)物加入到50uL大腸桿菌TOP10感受細(xì)胞中，混勻，冰浴30min；2)42℃水浴熱激90s后冰浴3min；3)加入200uL LB液體培養(yǎng)基,混勻。在37℃培養(yǎng)箱中150rpm培養(yǎng)30-60min；4)取100uL培養(yǎng)液，涂布于含Amp50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上。37℃倒置培養(yǎng)過夜。最后，從平板上分別挑取10個(gè)單菌落于20μL液體LB培養(yǎng)基匯中。取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)陽性菌落測(cè)序完成后，根據(jù)獲得的基因序列設(shè)計(jì)5'與3'RACE引物，進(jìn)行RACE PCR擴(kuò)增，從而獲得全長(zhǎng)基因序列。

在本發(fā)明中，所述篩選到的標(biāo)記等位基因SNPs位點(diǎn)優(yōu)選的位于候選基因3'端的不保守區(qū)域，用于和基因家族中不同的成員進(jìn)行區(qū)分。在本發(fā)明中，當(dāng)待測(cè)樣本為毛果楊時(shí)，篩選到的SNP位點(diǎn)優(yōu)選的位于熱激轉(zhuǎn)錄因子基因2(編號(hào)為Potri.001G108100)上；當(dāng)待測(cè)樣品為巨桉時(shí)，篩選到的SNP位點(diǎn)優(yōu)選的位于MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(編號(hào)為Eucgr.K02470)上。

本發(fā)明在篩選獲得標(biāo)記等位基因SNPs位點(diǎn)后，根據(jù)篩選到的SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物。所述qPCR特異引物包括正向引物和反向引物，對(duì)正向引物或反向引物3'末端與SNP位點(diǎn)3'末端互補(bǔ)的核苷酸進(jìn)行LNA修飾。具體的在本發(fā)明中，所述正向引物或反向引物的3'末端倒數(shù)第一個(gè)或倒數(shù)第二個(gè)堿基與標(biāo)記等位基因的SNPs位點(diǎn)配對(duì)，并在進(jìn)行引物合成時(shí)將此堿基所在的核苷酸的糖環(huán)進(jìn)行LNA修飾，即鎖核酸橋聯(lián)修飾。LNA鎖核酸是指核苷酸糖環(huán)上的2'-O與4'-C由亞甲基橋相連的一類RNA衍生物，可以與DNA或RNA按照一般的堿基配對(duì)原則進(jìn)行配對(duì)。這種橋連結(jié)構(gòu)可增加核酸骨架的穩(wěn)定性，提高退火溫度，增強(qiáng)堿基配對(duì)的特異性，能夠極大地降低了錯(cuò)配發(fā)生的概率。在本發(fā)明中，由于待檢測(cè)SNPs位點(diǎn)一般有兩種基因型，所以本發(fā)明優(yōu)選的同時(shí)合成兩條LNA修飾的正向引物或兩條反向引物；優(yōu)選的，所述qPCR特異引物與SNPs位點(diǎn)只有單堿基差異，也就是說所述的qPCR特異性標(biāo)記引物中只有SNPs位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸有差異，其余核苷酸序列不變。另一條反向引物或正向引物可依據(jù)常規(guī)引物設(shè)計(jì)法則進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，不進(jìn)行LNA修飾。由于進(jìn)行LNA修飾的那條引物的位置相對(duì)固定，所以在確定是對(duì)正向引物還是對(duì)反向引物進(jìn)行LNA修飾時(shí)，可參考引物設(shè)計(jì)法則，選擇最容易與DNA鏈雜交結(jié)合的一條引物進(jìn)行LNA修飾。

在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增的目的在于以簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量與qPCR特異引物擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比較來判斷qPCR特異引物的擴(kuò)增是否存在非特異擴(kuò)增。公知簡(jiǎn)并引物可以同時(shí)擴(kuò)增SNP位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位位點(diǎn)，當(dāng)qPCR特異引物擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量小于等于簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量時(shí)，說明qPCR特異引物的擴(kuò)增不存在非特異擴(kuò)增；當(dāng)qPCR特異引物擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量大于簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量時(shí)，說明qPCR特異引物的擴(kuò)增存在非特異擴(kuò)增，后續(xù)數(shù)據(jù)不可靠。

在本發(fā)明中，具體的當(dāng)待測(cè)樣本為毛果楊時(shí)，篩選到的SNP位點(diǎn)優(yōu)選的位于熱激轉(zhuǎn)錄因子基因2上SNP8583997位，根據(jù)所述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)qPCR引物，所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.1：HSF2SNP8583997T F:5'-ACAGAACTCATGTTCTG-3'、SEQ ID NO.2：HSF2SNP8583997C F:5'-ACAGAACTCATGTTCTG-3'和反向引物SEQ ID NO.4：HSF2R:5'-TAGATGTGCTGCTGACTTCCTAC-3'；所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。在本發(fā)明中，根據(jù)所述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物包括正向簡(jiǎn)并引物SEQ ID NO.3：HSF2SNP8583997T/C F5'-ACAGAACTCATGTTCTG-3'和反向引物SEQ ID NO.4：HSF2R:5'-TAGATGTGCTGCTGACTTCCTAC-3'。

在本發(fā)明中，當(dāng)待測(cè)樣品為巨桉時(shí)，所述SNP位點(diǎn)位于MYB轉(zhuǎn)錄因子基因SNP8583997位上。根據(jù)所述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)qPCR引物，所述qPCR特異引物包括正向引物SEQ ID NO.5：MYBSNP8583997G F:5'-GAAGACTCTTTGTTTGTCTGTTG-3'、SEQ ID NO.6：MYBSNP8583997A F:5'-GAAGACTCTTTGTTTGTCTGT TG-3'和反向引物SEQ ID NO.8：MYBR:5'-GATCTAGTTGAGTTAGAACAAAG-3'；所述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的3'末端上的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸進(jìn)行LNA修飾。在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物包括正向簡(jiǎn)并引物SEQ ID NO.7：MYBSNP8583997G/A F:5'-GAAGACTCTTTGTTTGTCTGTTG-3'和反向引物SEQ ID NO.8：MYBR:5'-GATCTAGTTGAGTTAGAACAAAG-3'。

本發(fā)明在得到SNPs位點(diǎn)的qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物后，用所述qPCR特異引物和簡(jiǎn)并引物分別對(duì)待測(cè)樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明中所述的待測(cè)樣品cDNA是通過提取待測(cè)樣品的RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的。本發(fā)明對(duì)所述的RNA提取和反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的方法沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法即可。優(yōu)選的在本發(fā)明中，所述待測(cè)樣本cDNA的PCR擴(kuò)增程序獨(dú)立地為：預(yù)變性94℃3min；變性94℃10s，退火62℃30s，延伸72℃40s；40個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，所述待測(cè)樣本cDNA的PCR擴(kuò)增體系獨(dú)立地包括：20ng/μL的待測(cè)樣品cDNA，1μL；SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，10μL；10μM的正向引物0.5μL；10μM的反向引物0.5μL；雙蒸水8μL。

本發(fā)明在72℃～95℃區(qū)間獲得PCR產(chǎn)物的熔解曲線。在本發(fā)明中，若擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，則表明上述的PCR擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增，然后根據(jù)PCR擴(kuò)增的Ct值計(jì)算待測(cè)樣本等位基因表達(dá)特異性。具體的在本發(fā)明中，所述待測(cè)樣本等位基因不平衡表達(dá)特異性的計(jì)算方法采用2^-ΔCt計(jì)算方法，ΔCt＝候選等位基因基因型R的Ct值-候選等位基因基因型R’的Ct值；所述基因型R為A、T、C和G中的一種，所述基因型R’為A、T、C和G中除R以外的三種中的一種；計(jì)算結(jié)果即為等位基因不同基因型的不平衡表達(dá)差異水平。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的植物等位基因不平衡表達(dá)檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！

gene？search＝1&crown＝1&detail＝1&method＝0&searchText＝transcriptid:27040781)毛果楊熱擊轉(zhuǎn)錄因子基因2(HSF2)重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選位于該基因3’端不保守區(qū)域的SNPs位點(diǎn)用于標(biāo)識(shí)等位基因，該SNPs頻率在群體中的頻率需要大于5％,并且在該位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)個(gè)體內(nèi)呈雜合狀態(tài)。SNP8583997位點(diǎn)滿足以上要求，選擇該位點(diǎn)為雜合狀態(tài)的個(gè)體作為等位基因表達(dá)檢測(cè)材料。使用LNA修飾引物qPCR檢測(cè)熱激轉(zhuǎn)錄因子基因2(Potri.001G108100)的等位基因表達(dá)模式，利用毛果楊熱擊轉(zhuǎn)錄因子基因2(HSF2)中SNP8583997作為等位基因標(biāo)識(shí)位點(diǎn)，其所在區(qū)域的基因序列如下：

ACTCCAAGTATAGACGTGCTTCAGAACATGAGTTCTGTTACCACTTGCGATTGCTATT，斜體為SNP位點(diǎn)。

針對(duì)SNP8583997位點(diǎn)(黑體下劃線標(biāo)注)，實(shí)驗(yàn)材料體內(nèi)包含兩種類型的模板鏈，其中模板鏈I:5'-NNNNNNNNCAGAACATGAGTTCTGTNNNNN

NNNN-3'，模板鏈II:5'-5'-NNNNNNNNCAGAACATGAGTTCTGTNNNNNNN

N-3'。對(duì)應(yīng)的基因型分別為T和C。

設(shè)計(jì)合成兩條3'末端核苷酸LNA修飾(3'末端倒數(shù)第二個(gè)核苷酸)的正向引物：SEQ ID NO.1(HSF2SNP8583997T F:5'-GGTAACAGAACTCATGTTCTG-3')，SEQ ID NO.2(HSF2SNP8583997C F:5'-GGTAACAGAACTCATGTTCTGG-3')，簡(jiǎn)并引物SEQ ID NO.3

(HSF2SNP8583997T/C F5'-GGTAACAGAACTCATGTTCTG-3')，反向引物SEQ ID NO.4(HSF2R:5'-TAGATGTGCTGCTGACTTCCTAC-3')。擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為232bp。

用上述引物對(duì)高溫脅迫處理的毛果楊葉片cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。其反應(yīng)體系為高溫(42℃，6h)處理后提取的毛果楊cDNA(20ng/μL)，1μL；SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，10μL；正向引物(10μM)，0.5μL；反向引物(10μM)，0.5μL；補(bǔ)充雙蒸水至20μL。PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性94℃3min，變性94℃10s，退火63℃30s，延伸72℃40s，40個(gè)循環(huán)讀板，在72℃-95℃區(qū)間獲得PCR產(chǎn)物熔解曲線。

PCR擴(kuò)增曲線如圖1所示，其中A為HSF2基因簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增曲線，B為HSF2SNP8583997T引物qPCR擴(kuò)增曲線，C為HSF2SNP8583997C引物qPCR擴(kuò)增曲線。

三個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的熔解曲線都只出現(xiàn)一個(gè)峰，表明都進(jìn)行了特異性擴(kuò)增。SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2引物擴(kuò)增Ct值大于SEQ ID NO.3引物擴(kuò)增Ct值，表明在等位位點(diǎn)擴(kuò)增反應(yīng)中只擴(kuò)增了引物所對(duì)應(yīng)的等位基因模板。擴(kuò)增效率在90％-100％之間，表明三對(duì)引物擴(kuò)增效率一致性強(qiáng)，擴(kuò)增結(jié)果可以用于比較分析。

利用即2^-ΔCt法計(jì)算毛果楊熱擊轉(zhuǎn)錄因子基因2(HSF2)等位基因表達(dá)模式，其中ΔCt＝(Ct(HSF2-SNP8583997T)-Ct(HSF2-SNP8583997C))。

2^-ΔCt＝2^{-(26.81-30.42)}

＝2^-(-3.61)

＝12.21

即等位基因HSF2-SNP8583997T表達(dá)量比等位基因HSF2-SNP8583997C高12.21倍。

使用ACTIN2作為內(nèi)參基因，利用即2^-ΔΔCt法計(jì)算毛果楊熱擊轉(zhuǎn)錄因子基因2(HSF2)等位基因響應(yīng)高溫處理模式。ΔΔCt＝(Ct(高溫處理-HSF2-SNP8583997T)-Ct(高溫處理-ACTIN2))-Ct(對(duì)照-HSF2-SNP8583997T)-Ct(對(duì)照ACTIN2))。

2^-ΔΔCt＝2^{-(26.81-23.56)-(31.12-23.45)}

＝2^-(3.25-7.67)

＝2^-(-4.42)

＝21.4

即等位基因HSF2-SNP8583997T表達(dá)量在高溫處理下比對(duì)照上調(diào)21.4倍。

使用ACTIN2作為內(nèi)參基因，利用即2^-ΔΔCt法計(jì)算毛果楊熱擊轉(zhuǎn)錄因子基因2(HSF2)等位基因響應(yīng)高溫處理模式。ΔΔCt＝(Ct(高溫處理-HSF2-SNP8583997C)-Ct(高溫處理-ACTIN2))-Ct(對(duì)照-HSF2-SNP8583997C)-Ct(對(duì)照ACTIN2)))。

2^-ΔΔCt＝2^{-(30.42-23.56)-(31.54-23.45)}

＝2^-(6.86-8.09)

＝2^-(-1.23)

＝2.34

即等位基因HSF2-SNP8583997C表達(dá)量在高溫處理下比對(duì)照上調(diào)2.34倍。

實(shí)施例2

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！gene？search＝1&crown＝1&detail＝1&method＝0&searchText＝transcri ptid:32066262)巨桉MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(Eucgr.K02470)重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選位于該基因3’端不保守區(qū)域的SNPs位點(diǎn)用于標(biāo)識(shí)等位基因，該SNPs頻率在群體中的頻率需要大于5％,并且在該位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)個(gè)體內(nèi)呈雜合狀態(tài)。SNP8583997位點(diǎn)滿足以上要求，選擇該位點(diǎn)為雜合狀態(tài)的個(gè)體作為等位基因表達(dá)檢測(cè)材料。使用LNA修飾引物qPCR檢測(cè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(Eucgr.K02470)的等位基因表達(dá)模式，利用巨桉MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(Eucgr.K02470)中SNP 32768853作為等位基因標(biāo)識(shí)位點(diǎn)，其所在區(qū)域的基因序列如下：CTCTTTGTTTGTCTGTTGTGTTTATCG，斜體為SNP位點(diǎn)。

針對(duì)SNP 32768853位點(diǎn)(黑體下劃線標(biāo)注)，實(shí)驗(yàn)材料體內(nèi)包含兩種類型的模板鏈，其中模板鏈I:5'-NNNNNNNNTGTCTGTTGTGTTTNNNNN

NNNN-3'，模板鏈II:5'-5'-NNNNNNNNGTCTGTTGTGTTTNNNNNNN

N-3'。對(duì)應(yīng)的基因型分別為G和A。進(jìn)行退火溫度梯度PCR擴(kuò)增，以確定等位基因表達(dá)檢測(cè)的最佳qPCR擴(kuò)增條件。

設(shè)計(jì)合成兩條3'末端核苷酸LNA修飾(3'末端倒數(shù)第二個(gè)核苷酸)的正向引物：SEQ ID NO.5(MYBSNP8583997G F:5'-GAAGACTCTTTGTTTGTCTGTTG-3'),SEQ ID NO.6(MYBSNP8583997A F:5'-GAAGACTCTTTGTTTGTCTGT TG-3')，一組簡(jiǎn)并引物SEQ ID NO.7(MYBSNP8583997G/A F:5'-GAAGACTCTTTGTTTGTCTGTTG-3')，反向引物SEQ ID NO.8(MYBR:5'-GATCTAGTTGAGTTAGAACAAAG-3')。擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為176bp。

用上述對(duì)高溫脅迫處理的巨桉葉片cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。其反應(yīng)體系為巨桉cDNA(20ng/μL)，μL；SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，10μL；正向引物(10μM)，0.5μL；反向引物(10μM)，0.5μL；補(bǔ)充雙蒸水至20μL。PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性94℃3min，變性94℃10s，退火60℃30s，延伸72℃40s，40個(gè)循環(huán)讀板，在72℃-95℃區(qū)間獲得PCR產(chǎn)物熔解曲線。

PCR擴(kuò)增曲線如圖1所示，其中A為MYB基因簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增曲線，B為MYBSNP8583997G引物qPCR擴(kuò)增曲線，C為MYBSNP8583997A引物qPCR擴(kuò)增曲線。

三個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的熔解曲線都只出現(xiàn)一個(gè)峰，表明都進(jìn)行了特異性擴(kuò)增。SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2引物擴(kuò)增Ct值大于SEQ ID NO:3引物擴(kuò)增Ct值，表明在等位位點(diǎn)擴(kuò)增反應(yīng)中只擴(kuò)增了引物所對(duì)應(yīng)的等位基因模板。擴(kuò)增效率在90％-110％之間，表明三對(duì)引物擴(kuò)增效率一致性強(qiáng)，擴(kuò)增結(jié)果可以用于比較分析。

利用即2^-ΔCt法計(jì)算巨桉MYB轉(zhuǎn)錄因子(Eucgr.K02470)等位基因表達(dá)模式，其中ΔΔCt＝(Ct(MYB-MYBSNP8583997G)-Ct(MYBSNP8583997A))。

2^-ΔCt＝2^{-(25.97-28.85)}

＝2^-(-2.88)

＝7.36

即等位基因MYBSNP8583997G表達(dá)量比等位基因MYBSNP8583997A高7.36倍。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明所提供的方法，采用LNA鎖核酸修飾的引物對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增以計(jì)算等位基因的特異性表達(dá)水平，根據(jù)實(shí)施例中擴(kuò)增曲線和Ct值可知，所述的特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果的精確性和可靠性，并且僅僅使用PCR手段，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)配套條件，顯著地降低了實(shí)驗(yàn)成本。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。