本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記，尤其涉及一種將腫瘤特異性的融合基因作為腫瘤診斷分子標(biāo)志及臨床治療的分子靶標(biāo)。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活環(huán)境及飲食習(xí)慣等的變遷，惡性腫瘤已經(jīng)成為人類健康的頭號(hào)殺手之一，近年來(lái)在全球范圍內(nèi)患病人數(shù)不斷增加，為全球經(jīng)濟(jì)和人類社會(huì)的發(fā)展帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多步驟并伴隨多基因遺傳或表觀遺傳發(fā)生變化的過(guò)程。鑒定致瘤性的遺傳異常是腫瘤研究的一個(gè)重要目標(biāo)，能夠?yàn)槟[瘤治療提供潛在的靶點(diǎn)。其中值得注意的是，染色體重排導(dǎo)致兩基因的融合，作為一種新的突變形式在腫瘤發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了腫瘤基因的范疇。

融合基因作為腫瘤基因新類型，其促進(jìn)腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化主要通過(guò)兩種方式：第一，一個(gè)基因的啟動(dòng)子或/和增強(qiáng)子元件等由于染色體重排異常地跟一個(gè)原癌基因緊靠在一起，驅(qū)使癌基因的異常表達(dá)，例如B細(xì)胞腫瘤IG-MYC、T細(xì)胞腫瘤TCR-MYC導(dǎo)致癌基因MYC活化；第二，兩基因融合產(chǎn)生有新功能的融合蛋白，例如BCR-ABL1。然而，超過(guò)80％的已知融合基因存在于僅占人類腫瘤的10％的白血病、淋巴瘤、骨及軟組織肉瘤中，而在較為常見(jiàn)上皮性實(shí)體瘤卻只發(fā)現(xiàn)10％融合基因。

近年來(lái)隨著分析及檢測(cè)方法的進(jìn)步，腫瘤學(xué)家分別在50％前列腺癌和1-5％肺癌(5-10％非小細(xì)胞肺癌)發(fā)現(xiàn)新的融合基因TMPRSS2-ERG，EML4-ALK，并進(jìn)一步闡明它們的致癌機(jī)制，為前列腺癌和肺癌的分型診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)?？梢?jiàn)染色體重排導(dǎo)致兩基因融合同樣可以是上皮性實(shí)體瘤的癌變機(jī)制之一。融合基因因其在腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)，可作為理想的治療靶點(diǎn)，例如針對(duì)CML的融合基因BCR-ABL設(shè)計(jì)的分子靶向藥物imatinib/Gleevec已經(jīng)在臨床得到應(yīng)用，同樣地臨床前及臨床1期、2期數(shù)據(jù)表明ALK激酶抑制劑對(duì)治療EML4-ALK陽(yáng)性病人有效，因此癌癥的融合基因的研究已經(jīng)日益成為熱點(diǎn)。

BCL6基因位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂3q27，以轉(zhuǎn)錄本NM_001706為例。其轉(zhuǎn)錄的mRNA包含9個(gè)外顯子，編碼706個(gè)氨基酸。BCL6與多種淋巴腫瘤相關(guān)，并且在淋巴腫瘤中存在多種融合基因，但是不存在BCL6-SPECC1L的存在。

SPECC1L基因位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂22q11，以轉(zhuǎn)錄本NM_001145468為例，其轉(zhuǎn)錄mRNA包含16個(gè)外顯子，編碼1117個(gè)氨基酸。該基因與細(xì)胞骨架相關(guān)，與腫瘤相關(guān)報(bào)道較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種用于診斷和治療上皮腫瘤的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為腫瘤的診斷及臨床治療提供了新的分子靶標(biāo)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種用于診斷和治療上皮腫瘤的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)志為融合基因BCL6-SPECC1L，所述融合基因同時(shí)包含基因BCL6和基因SPECC1L的部分序列。

優(yōu)選的，所述融合基因BCL6-SPECC1L至少包含如下序列：

BCL6部分：

ATGGCCTCGCCGGCTGACAGCTGTATCCAGTTCACCCGCCATGCCAGTGATGTTCTTCTCAACCTTAATCGTCTCCGGAGTCGAGACATCTTGACTGATGTTGTCATTGTTGTGAGCCGTGAGCAGTTTAGAGCCCATAAAACGGTCCTCATGGCCTGCAGT；

SPECC1L部分：

GTGTTCTTGGGGAAGATCCCGACTAAGCCATTTTCCAGTGGCACCTCTTCCATCATGAGTTCCTGA。

優(yōu)選的，所述融合基因BCL6-SPECC1L的融合形式為BCL6exon 7/9：SPECC1L exon 2/17(5’-BCL6^exon7-SPECC1L^exon2-3’)。

優(yōu)選的，所述制劑中含有可檢測(cè)權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的分子標(biāo)志或其表達(dá)產(chǎn)物的試劑。

優(yōu)選的，所述腫瘤選自頭頸部腫瘤。

優(yōu)選的，所述腫瘤選自鼻咽癌、喉癌或口腔部鱗癌。

優(yōu)選的，所述生物制劑下調(diào)融合基因BCL6-SPECC1L在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量或使融合基因BCL6-SPECC1L融合蛋白不表達(dá)。

優(yōu)選的，所述生物制劑含有融合基因BCL6-SPECC1L的siRNA或融合基因BCL6-SPECC1L的抗體。

優(yōu)選的，所述抗體為融合基因BCL6-SPECC1L的蛋白特異性兔多克隆抗體。

優(yōu)選的，所述抗體的氨基酸序列為：VFLGKIPKPFSSGTSSIMSS。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明所述分子標(biāo)記有助于腫瘤的早期診斷以及治療，提高篩查效率，降低篩查成本，為個(gè)體化治療提供方向，改善病人的存活率和生存質(zhì)量；本發(fā)明所述診斷制劑，通過(guò)檢測(cè)融合基因的表達(dá)情況，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期篩查，有助于腫瘤的早期介入和預(yù)防。

附圖說(shuō)明

圖1為利用RNA-seq發(fā)現(xiàn)鼻咽癌存在新的融合基因BCL6-SPECC1L，1A為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)融合基因及跨融合斷裂位點(diǎn)序列，1B為運(yùn)用sanger測(cè)序方法鑒定轉(zhuǎn)錄組和基因組融合位點(diǎn)，1C為預(yù)測(cè)斷裂基因組斷裂方式，1D為預(yù)測(cè)蛋白轉(zhuǎn)錄融合方式；

圖2為鑒定出融合基因BCL6-SPECC1L的mRNA全長(zhǎng)，并預(yù)測(cè)出蛋白序列，并設(shè)計(jì)出特異性抗體，2A為陽(yáng)性樣品cDNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證融合基因膠圖，2B為陽(yáng)性樣品基因組DNA進(jìn)行融合基因驗(yàn)證膠圖，2C&2D為預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本和蛋白編碼序列，2E為設(shè)計(jì)特異性針對(duì)特異表位的抗體anti-BS與陽(yáng)性對(duì)照抗體對(duì)比圖；

圖3為過(guò)表達(dá)融合基因BCL6-SPECC1L和BCL6發(fā)現(xiàn)融合基因丟失BCL6的抑癌作用，3A為融合基因BCL6-SPECC1L失去BCL6在HNE1中對(duì)增殖的抑制作用，3B為融合基因定位發(fā)生核漿的改變，3C為融合基因失去對(duì)含有BCL6結(jié)合位點(diǎn)luciferase的抑制作用。

具體實(shí)施方式

為更好地說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1融合基因BCL6-SPECC1L的發(fā)現(xiàn)

本申請(qǐng)發(fā)明人采用paired-end RNA-seq方法對(duì)10例鼻咽癌組織RNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。經(jīng)過(guò)強(qiáng)大計(jì)算機(jī)集群對(duì)測(cè)序的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，利用融合基因檢測(cè)流程，在測(cè)序樣品271中發(fā)現(xiàn)新融合基因BCL6-SPECC1L，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1)收集新鮮10例鼻咽癌組織組織，置于RNA later溶液中，4℃浸泡過(guò)夜后，在-80℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存；

2)利用OMEGA生物制劑公司的E.Z.N.A.total DNA/RNA分離試劑盒(R6731-02，200次)提取及純化組織的總RNA和DNA；

具體步驟如下：

(1)研磨組織：

a)洗凈所用的研缽和研杵，然后浸泡在醫(yī)用消毒液中過(guò)夜(約12個(gè)小時(shí)左右)，次日用清水沖洗干凈后擦干，用錫箔紙包裹好研缽和研杵，放入烤箱中用180℃烘烤3個(gè)小時(shí)備用。(用錫箔紙包裹是防止研缽和研杵在烘烤過(guò)后使用前，有異物或RNA酶污染。)從-80℃冰箱取出所需的組織，放入研缽中，加入液氮冷凍組織后將組織研磨成粉末，標(biāo)記好組織編號(hào)。此步驟需注意：先研磨非癌組織，再研磨腫瘤組織，盡量避免交叉污染；

b)每20-30mg的組織加入700μl的GTC Lysis Buffer，收集入1.5ml EP管中，用10ml的一次性注射器反復(fù)抽打，使組織更好的裂解；

c)13000×g室溫離心5min，將上清移至已經(jīng)插入2ml收集管的HiBind^TMDNA Column中，離心一分鐘，13000×g/min；

d)將收集管里的液體分別移到1.5ml的EP管中，此步驟之后DNA和RNA就分開(kāi)提取。

(2)RNA提取：

a)加入與1.5ml EP管中等體積的70％的乙醇(約350μl)，此時(shí)可看到白色沉淀，上下顛倒幾次后用震蕩器劇烈震蕩15sec以上；

b)將液體轉(zhuǎn)移至HiBind^TM RNA分離柱中，≥10000×g離心1min，棄掉收集管中離心出來(lái)的液體；

c)向HiBind^TM RNA分離柱中加入500μl RNAWash BufferⅠ，≥10000×g離心1min，棄掉收集管中離心出來(lái)的液體；

d)向HiBind^TM RNA分離柱中加入500μl RNAWash BufferⅡ，≥10000×g離心1min，棄掉收集管中離心出來(lái)的液體；

e)重復(fù)第d)的步驟；

f)將空的HiBind^TM RNA分離柱，離心，≥10000×g，2min；

g)丟掉上一步所用的收集管，將HiBind^TM RNA分離柱放入新的1.5ml EP管中，向HiBind^TM RNA分離柱中心滴加40μl的DEPC水，室溫孵育3min后離心，≥10000×g，2min。離心下來(lái)的為RNA，分裝后放入-80℃中保存。

(3)DNA提?。?/p>

a)將HiBindTM DNA分離柱插入新的2ml的收集管中；

b)向HiBindTM DNA分離柱中加入500μl的HB Buffer，離心，≥10000×g，1min；棄去收集管里的液體；

c)向HiBindTM DNA分離柱中加入700μl DNAWash Buffer，離心，≥10000×g，1min；棄去收集管里的液體；

d)將空的HiBindTM DNA分離柱中離心，≥10000×g，2min；

e)將HiBindTM DNA分離柱放入新的1.5ml EP管中，向每個(gè)HiBindTM DNA分離柱中心滴加60μl Elution Buffer。室溫孵育3min后離心，≥10000×g，2min。提取的DNA分裝后放在-80℃保存。

3)將純化好的總RNA干冰運(yùn)送到深圳華大基因公司，利用agilent 2100檢測(cè)，質(zhì)檢合格后進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序：

(1)總RNA用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；

(2)加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段；

(3)以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈；

(4)經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加polyA并連接測(cè)序接頭；

(5)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，約200bp，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(6)在Illumina HiSeq^TM 2000平臺(tái)進(jìn)行paird-end測(cè)序；

4)利用生物信息分析方法，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用一套成熟的流程檢測(cè)樣品中的融合基因，并發(fā)現(xiàn)融合基因BCL6-SPECC1L，見(jiàn)圖1A。

實(shí)施例2鼻咽癌新融合基因BCL6-SPECC1L的鑒定

根據(jù)RNA-seq reads比對(duì)結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人在RNA融合位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)引物，聯(lián)用PCR擴(kuò)增以及sanger測(cè)序在測(cè)序樣品271中驗(yàn)證BCL6-SPECC1L的存在，引物序列：

BCL6-SPECC1L-RT-sense：

5’-ATGGCCTCGCCGGCTGACAGCTGTA-3’；

BCL6-SPECC1L-RT-antisense：

5’-TCAGGAACTCATGATGGAAGAGGTG-3’。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1)RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA

使用Invitrigen公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA.C28025-032)，按說(shuō)明書(shū)用Oligo(dT)為逆轉(zhuǎn)錄引物，取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系共20μl冰上操作，配置體系如下：

共10μl體系，在PCR儀中完成變性過(guò)程，65℃5min，4℃至少1min；取出反應(yīng)體系立即置于冰上，立即配置如下反應(yīng)體系：

加入標(biāo)記好的EP管中各10μl，在PCR儀中完成如下步驟：

37℃50min；70℃終止反應(yīng)15min；4℃forever將上述逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA分裝保存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2)PCR擴(kuò)增

使用TaKaRa公司Taq^TM Hot Start Version，按說(shuō)明書(shū)使用BCL6-SPECC1L檢測(cè)引物，配置50μl PCR體系如下：

在PCR熱循環(huán)儀上完成PCR過(guò)程：預(yù)變性95℃5min變性95℃30sec退火60℃30sec延伸72℃1min 72℃10min 4℃forever循環(huán)數(shù)：45cycles；

3)取5μl PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳鑒定特異性擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2A；

4)剩下PCR產(chǎn)物送去Invitrogen公司，在3500遺傳分析儀平臺(tái)進(jìn)行sanger測(cè)序，測(cè)序鑒定見(jiàn)圖1B上；

5)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，證實(shí)新融合基因BCL6-SPECC1L存在。

實(shí)施例3基因組融合位點(diǎn)的鑒定

為了進(jìn)一步證明BCL6與SPECC1L間的融合是由于染色體重排產(chǎn)生的，利用TaKaRa公司的TaKaRa LA Hot Start Version，以基因組DNA為模板，使用同一對(duì)引物進(jìn)行l(wèi)ong Range PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序，鑒定基因組融合位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

設(shè)計(jì)基因組引物：BS-genomic-f：CAGCGAGAGCCACTCACCACTCTAC；BS-genomic-r：GATTTAAAATTGGCTCTACCCCACC。

1)配置50μl PCR反應(yīng)體系：

2)PCR擴(kuò)增：

95℃5min 95℃30sec 58℃30sec 72℃5min 10cycles 5min+10sec/cycle 35cycles 72℃10min 4℃forever；

3)取5μl PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳，明確擴(kuò)增出特異條帶；

4)剩下PCR產(chǎn)物送到Invitrogen公司，在3500遺傳分析儀平臺(tái)進(jìn)行sanger測(cè)序分析；

5)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，明確基因組融合位點(diǎn)。

從圖1B的下圖可知，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示以測(cè)序樣品271的DNA為模板，利用long range PCR特異地?cái)U(kuò)增出約4.5kb的片段，見(jiàn)圖2B，測(cè)序結(jié)果證實(shí)BCL6與SPECC1L間的融合發(fā)生在DNA水平(測(cè)序鑒定見(jiàn)圖1B下)，具體基因組融合序列為：AAATTTGCATGGCATTAAAGATGTTCCTATTCTGATCATTGTT，融合位點(diǎn)為chr3:187446134-chr22:24669692(hg19)。

6)預(yù)測(cè)融合形式及全長(zhǎng)序列

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組基因組融合位點(diǎn)的鑒定，預(yù)測(cè)染色體融合形式如圖1C。預(yù)測(cè)mRNA融合形式見(jiàn)圖1D上，編碼蛋白R(shí)NA序列見(jiàn)圖2C；預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域融合形式見(jiàn)圖1D下，具體序列見(jiàn)圖2D。

實(shí)施例4融合基因及野生型基因功能研究

通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人認(rèn)為BCL6-SPECC1L融合基因可通過(guò)破壞BCL6抑癌基因的功能從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

(1)引物設(shè)計(jì)與合成(Invitrogen公司)

BCL6-SPECC1L-full length-sense：

5’-CGGGATCCCAGCGAGAGCCACTCACCACTCTAC-3’；

BCL6-SPECC1L-full length-antisense：

5’-CGGAATTCGATTTAAAATTGGCTCTACCCCACC-3’；

(2)PCR擴(kuò)增

采用Takara公司的primer start高保真DNA聚合酶，模板是包含該融合方式的鼻咽癌標(biāo)本cDNA，反應(yīng)體系如下：

(3)瓊脂糖電泳以及膠回收

配置1％瓊脂糖膠；

1g瓊脂糖粉；

100ml 1XTAE電泳緩沖液；

膠回收用的是天根公司的膠回收試劑盒(DP209)，并按照說(shuō)明書(shū)操作。

(4)膠回收的PCR以及pCDNA3.1(+)空載體酶切

50μl酶切體系配置：

37℃孵育30min以上；

(5)瓊脂糖電泳及膠回收，步驟同上，其中回收產(chǎn)物用20μl ddH₂O洗脫，空載用50μl ddH₂O洗脫。

(6)連接

15μl連接體系

16℃連接30min以上。

(7)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

根據(jù)天根公司的DH5α感受態(tài)細(xì)胞(CB101)轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。

(8)挑單克隆

10μl槍頭挑至少2個(gè)菌落至含100ng/ml氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12-20h。

(9)小提質(zhì)粒

按照天根公司小提質(zhì)粒的試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。

(10)酶切鑒定

酶切體系同上。

(11)瓊脂糖電泳，目的片段大小判斷；

(12)鑒定正確的質(zhì)粒送測(cè)序，鑒定沒(méi)有突變；

(13)質(zhì)粒大量提純：

測(cè)序鑒定沒(méi)有突變的質(zhì)粒，需要經(jīng)行質(zhì)粒的大量提取，本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室采用氯化銫密度梯度離心法。

(14)磷酸鈣轉(zhuǎn)染和磷酸鈣包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒

a)提前一天鋪293FT細(xì)胞,因?yàn)榧?xì)胞貼壁不牢，培養(yǎng)皿需要用明膠預(yù)先處理：在10cm培養(yǎng)板中加2-3ml 0.1％的明膠覆蓋培養(yǎng)皿底部在37度放置至少15min；

b)消化293FT細(xì)胞，吸走培養(yǎng)皿中的明膠，10cm培養(yǎng)皿鋪1-1.2x10⁶細(xì)胞數(shù)，放培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

c)24h后，待細(xì)胞密度達(dá)40％左右時(shí)，進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染：

加反應(yīng)體系：

I.目的質(zhì)粒稀釋至1ug/ul，病毒包裝質(zhì)粒PIK也稀釋至1ug/ul；

II.取1.5ml離心管，每管加20-25ul目的質(zhì)粒，然后加等量PIK；

III.加100ul超純水；

IV.加50ul 1M的CaCl₂；

V.加200ul HBS(PH＝6.75)，緩慢逐滴加入，混勻。

d)EP管在室溫下靜置15-30min；

e)將待轉(zhuǎn)染的293FT細(xì)胞取出，吸走部分培養(yǎng)基，是剩下的培養(yǎng)基4-5ml；

f)將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒(DNA-磷酸鈣沉淀)均勻滴入轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕搖動(dòng)使混勻；

g)每培養(yǎng)皿中加40ul氯喹(終濃度25uM)，輕輕混勻；

h)37度，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)；

i)6小時(shí)候后，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，小心吸去培養(yǎng)基；

j)用1x的solution A洗細(xì)胞兩次，輕輕搖晃，至沉淀全部溶解；

k)培養(yǎng)皿加入含10％FBS的新鮮培養(yǎng)基6.5ml在37度，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(15)病毒收集和細(xì)胞感染

a)18小時(shí)后，開(kāi)始收集病毒，每4小時(shí)收集一次，用注射器吸取培養(yǎng)皿上清，0.45um過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。病毒液可以直接用于感染細(xì)胞；

b)病毒液也可以保存于病毒凍存管中，-80度保存。

2×HBS(PH＝6.75)：

50mmol/L HEPES，

130mmol/L NaCl，

1.5mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄

調(diào)PH＝6.75

過(guò)濾后分裝4度保存

1mol/L CaCl₂：111g CaCl₂溶于900ml水中，攪拌溶解，定容至1000ml，過(guò)濾。

(16)建立穩(wěn)定細(xì)胞株

病毒2天內(nèi)感染3次后，加入含抗生素puromycin(1ug/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)5天,注意每隔兩天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)正常后收取蛋白和RNA用于鑒定。

(17)MTT assay

a)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)；

b)取200μl細(xì)胞懸液含2000cell加入96孔板內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)平行的復(fù)孔，連續(xù)測(cè)6天；

c)5％CO₂、37℃培養(yǎng)；

d)實(shí)驗(yàn)中止前4h加入5mg/ml MTT液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；

e)棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μl DMSO，37℃10分鐘，待結(jié)晶溶解后在酶聯(lián)檢測(cè)儀上檢測(cè)490nm波長(zhǎng)下每孔的OD值；

f)待6天檢測(cè)完后，利用每天的OD值做生長(zhǎng)曲線。見(jiàn)圖3A可以看出融合基因失去了BCL6在鼻咽癌細(xì)胞株中HNE1的抑制增殖的功能。

(18)免疫熒光實(shí)驗(yàn)

a)在24孔板中放入經(jīng)消毒的蓋薄片

b)消化細(xì)胞，每孔接種的細(xì)胞數(shù)為5*10⁴

c)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗，5min*2次(搖床快洗)

d)4％多聚甲醛固定10min,PBS洗，5min*2次(搖床快洗)

e)5％BSA室溫封閉20分鐘

f)用PBST(T為Triton X-100，配置PBST的濃度為0.1％)冰上破膜10min

g)然后用5％BSA稀釋一抗anti-flag(1:100)，4℃過(guò)夜。

h)PBST(T為吐溫)(洗液的PBST中T均為吐溫)洗，5min*5次

i)用PBS稀釋熒光二抗anti-mouse(1:1000)，室溫45min(避光)

j)PBST(T為吐溫)洗，5min*5次(避光)

k)DAPI孵育，室溫5min，PBST(T為吐溫)洗，5min*1次(避光)

l)antifade(抗淬滅劑)封片，熒光顯微鏡或熒光共聚焦下觀察拍照，結(jié)果見(jiàn)圖3B，發(fā)現(xiàn)融合基因?yàn)榧?xì)胞漿定位，而B(niǎo)CL6定位與細(xì)胞核，說(shuō)明融合基因發(fā)生了核漿定位改變從而失去了BCL6在細(xì)胞核中影響基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子功能。

(19)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

a)消化293T細(xì)胞成單個(gè)，計(jì)數(shù)，24孔板，1*10⁵個(gè)/well；

b)24h后，用lipo3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)入293T細(xì)胞中；

c)培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗棄一次；

d)每孔加入100ul細(xì)胞裂解液PLB，室溫裂解搖15min，然后轉(zhuǎn)入EP管中；

e)然后放在熒光發(fā)光儀上，分別加入LAR2和STOP&Glo來(lái)檢測(cè)螢光蟲(chóng)螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性；

f)最后見(jiàn)過(guò)見(jiàn)圖3C，發(fā)現(xiàn)融合基因與BCL6的DNA結(jié)合功能域缺失突變體BCL6^1-513一樣，失去了對(duì)BCL6-reporter的抑制功能。

(20)特異性抗體的制備

根據(jù)融合基因BCL6-SPECC1L會(huì)特異性表達(dá)蛋白序列VFLGKIPTKPFSSGTSSIMSS，并且該序列并沒(méi)有在人類蛋白組上有同源序列，因此根據(jù)該特異性序列與艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司合作，針對(duì)該多肽設(shè)計(jì)兔多克隆抗體，得到多克隆抗體anti-BS，然后通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2E，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該抗體能特異結(jié)合融合基因BCL6-SPECC1L。說(shuō)明該抗體具有靶向特異性檢測(cè)與靶向治療的潛力。

實(shí)施例5BCL6-SPECC1L在多種上皮腫瘤的臨床標(biāo)本上表達(dá)

進(jìn)一步驗(yàn)證BCL6-SPECC1L是否為鼻咽癌特異性的融合基因，本發(fā)明人采用PCR擴(kuò)增和sanger法測(cè)序聯(lián)用的方法，在47例頭頸鱗癌、143例食管癌以及206例鼻咽癌臨床標(biāo)本檢測(cè)BCL6-SPECC1L的表達(dá)。結(jié)果顯示：頭頸鱗癌和食管癌發(fā)現(xiàn)1例標(biāo)本表達(dá)該融合基因，證實(shí)BCL6-SPECC1L并不是鼻咽癌特異性的。

最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。