本發(fā)明屬于副溶血性弧菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種海產(chǎn)品副溶血性弧菌toxR基因的實時熒光定量PCR快速檢測引物及其試劑盒。

背景技術(shù)：

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一種生長在港灣和河口地區(qū)的革蘭氏陰性嗜鹽菌，可通過水生動物的濾食活動富集在生物體內(nèi)，因此廣泛存在于多種海產(chǎn)品中，包括魚類、甲殼類、雙殼貝類等。其中，牡蠣中含量最高。人食用污染該菌的海產(chǎn)品后可引起腹痛、腹瀉，嚴(yán)重時還可引起敗血癥、休克、昏迷而死亡。近年來，由副溶血弧菌引起的食物中毒在全球范圍內(nèi)暴發(fā)，特別是在中國沿海地區(qū)的食物中毒病例中，副溶血弧菌已成為微生物性食物中毒的首要病原菌，其引發(fā)的食源性疾病已成為當(dāng)前全球面臨的公共衛(wèi)生問題之一。我國是水產(chǎn)品出口大國，副溶血性弧菌則是我國出口頭足類水產(chǎn)品的必檢項目，因此在飲水、食品檢測和食物中毒源調(diào)查、傳染病源調(diào)查等工作中，經(jīng)常要檢測副溶血弧菌。

目前，食品中副溶血弧菌檢測方法主要以國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，這些方法檢驗周期長，受主觀影響較多，不能滿足食品衛(wèi)生快速反應(yīng)體系的需求。近年來，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于本領(lǐng)域，常規(guī)PCR方法中開管操作易于污染，造成假陽性的缺陷。熒光定量PCR檢測技術(shù)具有快速、簡便、直觀、定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢，在病原菌檢測中已得到廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、準(zhǔn)確、靈敏并可實時定量的海產(chǎn)品副溶血性弧菌toxR基因的實時熒光定量PCR快速檢測引物及其試劑盒，以便于基層簡便、快捷準(zhǔn)確地檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

海產(chǎn)品副溶血性弧菌toxR基因的實時熒光定量PCR快速檢測引物，包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，它們具有以下堿基序列：

上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，

下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。

上述PCR快速檢測引物在PCR擴(kuò)增副溶血性弧菌toxR基因方面的應(yīng)用。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃5s，60℃30s(收集FAM熒光信號)擴(kuò)增40個循環(huán)，反應(yīng)耗時45min。

海產(chǎn)品副溶血性弧菌toxR基因的實時熒光定量PCR快速檢測試劑盒，該試劑盒包含A液、B液、C液和PCR反應(yīng)管；

A液為PCR反應(yīng)液，含SYBR Premix Ex TaqTM(2×)(Takara寶生物工程大連有限責(zé)任公司，規(guī)格：1ml×5，Code No.：RR820L，內(nèi)含TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I)12.5μL和上游引物toxR-F

(10μmol/L)和下游引物toxR-R(10μmol/L)各1μL，去離子水8.5μL；

B液為副溶血性弧菌toxR基因的DNA，作為陽性對照；

上述C液為去離子水，作為陰性對照；

上游引物toxR-F和下游引物toxR-R具有以下堿基序列：

上游引物toxR-F：CGCTCGCTGACCAACAAA，

下游引物toxR-R：CGCCAAACAAACTCGTGAA。

上述PCR快速檢測試劑盒在PCR擴(kuò)增副溶血性弧菌toxR基因方面的應(yīng)用。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃5s，60℃30s(收集FAM熒光信號)擴(kuò)增40個循環(huán)，反應(yīng)耗時45min。

針對現(xiàn)有海產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測存在的問題，發(fā)明人以副溶血性弧菌toxR基因為研究對象結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)(Real-time PCR，RT-PCR)，設(shè)計了海產(chǎn)品副溶血性弧菌toxR基因的實時熒光定量PCR快速檢測引物，包括上游引物toxR-F和下游引物toxR-R，擴(kuò)增產(chǎn)物130bp。據(jù)此，發(fā)明人還組裝了相應(yīng)檢測試劑盒并建立了相應(yīng)檢測方法。通過特異性試驗、敏感度試驗、重復(fù)性試驗證實，本發(fā)明的特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測耗時短，是快速檢測副溶血弧菌的有效方法。本發(fā)明的試劑盒在同一樣品重復(fù)性試驗以及同一樣品不同批次試驗中結(jié)果顯示，該方法可用于基層大批量海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測并且所建立的副溶血弧菌熒光定量PCR快速檢測方法重復(fù)性好，可對海產(chǎn)品中副溶血性弧菌進(jìn)行穩(wěn)定可靠的檢測。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的突出優(yōu)點具體在于：

1)特異性強(qiáng)

本發(fā)明的PCR反應(yīng)試劑盒中的引物是基于副溶血性弧菌toxR的保守序列設(shè)計合成的，試驗結(jié)果表明可以特異性檢測出海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，所檢測的陰性對照細(xì)菌和水對照均無陽性結(jié)果出來。

2)靈敏度高

本發(fā)明檢測方法旨在為基層檢疫工作者提供一種高效靈敏檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測技術(shù)，最低檢測限約為1.69×10^-1pg/ml，具有很高的靈敏度，是普通PCR的1000倍且檢測過程中不受其他相關(guān)腸道細(xì)菌的影響，充分展示了其特異性高、靈敏性好的特點。

3)穩(wěn)定性好

同一次試驗內(nèi)的30個平行樣的擴(kuò)增曲線在閾值線附近基本上重合，CT值平均讀數(shù)為20.95，標(biāo)準(zhǔn)差為0.40，變異系數(shù)為1.9％。同一樣品在不同30次試驗中所獲得的CT值也基本相同，CT值平均值為22.15，標(biāo)準(zhǔn)差為0.5155，變異系數(shù)為2.5％。以上統(tǒng)計結(jié)果表明，本實驗所建立的副溶血弧菌熒光定量PCR快速檢測方法重復(fù)性好，可對海產(chǎn)品中副溶血性弧菌進(jìn)行穩(wěn)定可靠的檢測。

4)簡便快捷，易操作；

相較于常規(guī)檢測技術(shù)，該熒光PCR檢測技術(shù)可以通過建立的副溶血性弧菌DNA濃度與Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算待測樣品中副溶血性弧菌的DNA的濃度，該反應(yīng)擴(kuò)增程序用時短，單循環(huán)僅需65s全程反應(yīng)只需45min即可完成；另外相較于通過試劑盒提DNA，該方法中的細(xì)菌DNA提取技術(shù)是煮沸法，僅需要簡單的加熱裝置，操作簡單，用時短，DNA純度高，30min內(nèi)就能提取樣品DNA，這大大縮減了檢測時間和檢測費(fèi)用，適合各種樣品的大批量檢測。

附圖說明

圖1是RT-PCR擴(kuò)增(引物濃度10μmol/L，退火溫度60℃)曲線圖。

圖2是副溶血性弧菌toxR基因的熒光PCR擴(kuò)增片段電泳圖，圖中：M是100 lader Marker 1500，1-2分別副溶血性弧菌DNA組、陰性對照組。

圖3是標(biāo)準(zhǔn)樣品toxR基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中：X軸為副溶血性弧菌DNA濃度對數(shù)值，Y軸為CT值。

圖4是副溶血性弧菌RT-PCR特異性試驗擴(kuò)增曲線圖，圖中：S型擴(kuò)增曲線為副溶血性弧菌，其他為非O1霍亂弧菌、大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌，變形桿菌，糞球桿菌，藤黃微球菌。

圖5是副溶血性弧菌RT-PCR特異性試驗擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖中：M是100 lader Marker 1500，1-7分別為大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌，變形桿菌，糞球桿菌，藤黃微球菌；8是副溶血性弧菌；9是非O1霍亂弧菌。

圖6是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性試驗擴(kuò)增曲線圖，圖中：從左到右樣品DNA濃度分別為1.69×10⁸pg/mL、1.69×10⁷pg/mL、1.69×10⁶pg/mL、1.69×10⁵pg/mL、1.69×10⁴pg/mL、1.69×10³pg/mL、1.69×10²pg/mL、1.69×10¹pg/mL、/1.69×10⁰pg/mL、/1.69×10^-1pg/mL。

圖7是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性試驗溶解曲線圖。

圖8是副溶血性弧菌RT-PCR敏感性試驗擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖中：M是Marker 2000，1-10分別為1.69×10⁸pg/mL、1.69×10⁷pg/mL、1.69×10⁶pg/mL、1.69×10⁵pg/mL、1.69×10⁴pg/mL、1.69×10³pg/mL、1.69×10²pg/mL、1.69×10¹pg/mL、/1.69×10⁰pg/mL、/1.69×10^-1pg/mL。

圖9是副溶血性弧菌RT-PCR重復(fù)性試驗擴(kuò)增曲線圖。

圖10是副溶血性弧菌RT-PCR重復(fù)性試驗溶解曲線圖。

具體實施方式

1 材料與方法

1.1 菌株

非O1霍亂弧菌、大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，均采購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；綠膿桿菌，變形桿菌，糞球桿菌，藤黃微球菌為廣西大學(xué)藥理實驗室提供；副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC17802)采購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；臨床分離菌株為廣西部分地區(qū)的農(nóng)貿(mào)市場或菜市場銷售的海產(chǎn)品中分離得到。

1.2 主要儀器和試劑

美國Bio-rad公司CFX96TM Real-Time system儀，美國Bio-rad公司凝膠成像系統(tǒng)，Simplinano超微量紫外分光光度計，Sigma低溫微量超速離心機(jī)、水浴鍋；SYBR PremixEx Taq II，購自TaKaRa，DNA Marker 2000、購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)菌培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)副溶血弧菌toxR基因序列，采用DNAStar軟件中的Seqman進(jìn)行同源性分析，確定在副溶血弧菌菌株內(nèi)保守、其他菌株間特異的片段，引物由大連寶生物工程有限公司合成，擴(kuò)增片段長度為130bp；

上游引物toxR-F序列：CGCTCGCTGACCAACAAA

下游引物toxR-R序列：CGCCAAACAAACTCGTGAA

toxR擴(kuò)增序列(130bp)。

1.4 細(xì)菌基因組DNA提取

接種單個菌落于含有1ml的營養(yǎng)肉湯的EP管中，37℃培養(yǎng)18-24h，然后12000r離心5min，棄去上清液，加入200μL去離子水用封口膜密封后混勻，于100℃沸水中煮沸10min，最后12000r離心5min，取上清液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序的建立及優(yōu)化

參照TaKaRa公司產(chǎn)品Taq酶(RR820A)說明書，將熒光定量PCR上游引物、下游引物和ddH₂O同時加入反應(yīng)體系中，于CFX96^TMReal-Time system儀進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。對熒光定量PCR反應(yīng)體系中各組分濃度和反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，特別是對引物濃度進(jìn)行篩選，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值(ΔRn)。選用2、4、6、8、10μmol/L的引物終濃度以及不同的退火溫度58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、篩選引物的最佳濃度和最佳退火溫度。

1.6 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802的DNA為模板，采用優(yōu)化的反應(yīng)條件擴(kuò)增目的基因，獲得片段大小為130bp的PCR產(chǎn)物(圖3)。用Simplinano超微量紫外分光光度計測定其濃度，用雙蒸水對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10×倍比稀釋，稀釋梯度為1.69×10⁸-1.69×10^-1pg/mL，采用優(yōu)化好的體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，建立副溶血性弧菌DNA濃度與CT值對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 副溶血性弧菌熒光定量PCR的特異性試驗

以非O1霍亂弧菌、大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌，變形桿菌，糞球桿菌，藤黃微球菌等9株食物中常見的細(xì)菌作為陰性對照菌株，并用高純水作為無模板空白對照進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過觀察擴(kuò)增曲線驗證引物的特異性。

1.8 副溶血性弧菌熒光定量PCR的敏感度試驗

為評價該方法對副溶血性弧菌的檢測靈敏度，將副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌液在37℃培養(yǎng)18-24小時，提取細(xì)菌基因組DNA后測定其濃度為1.69×10⁸pg/mL，OD260nm/OD280nm值為1.805，再按10×倍比稀釋成1.69×10⁸-1.69×10^-1pg/mL的梯度，對每個梯度菌液各取2μL分別進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測和普通PCR檢測，比較兩者的最低檢測值。

1.9 副溶血性弧菌熒光定量PCR的重復(fù)性

通過在同一試驗內(nèi)和不同試驗間對同一樣品檢測的Ct值變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值的平均數(shù))來初步評估該方法的重復(fù)性。

1.10

結(jié)果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序的建立及優(yōu)化

結(jié)果表明toxR上下游引物濃度均為10μmol/L時，獲得的CT值較小而且熒光強(qiáng)度增加值較大，且退火溫度為60℃時，擴(kuò)增效果最好(圖1)。因此優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)12.5μL；PCR Forward Primer(10μmol/L)1μL；PCR ReversePrimer(10μmol/L)1μL；DNA模板2.0μL；去離子水8.5μL，體系總體積25μL。優(yōu)化后的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃5s，60℃30s，擴(kuò)增40個循環(huán)。

2.2 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以標(biāo)準(zhǔn)副溶血性弧菌DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與預(yù)期相符，大小為130bp(圖2)。對標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋，取1.69×10⁸-1.69×10^-1pg/mL 10個梯度濃度為模板，進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)各稀釋度與Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)、擴(kuò)增曲線(圖6)和溶解曲線(圖7)。實驗結(jié)果顯示，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.69×10⁴-1.69×10⁸DNA濃度范圍之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9995，斜率約為-2.978，截距為41.609，得出細(xì)菌DNA濃度與Ct值的線性方程為：y＝-2.978x+41.609。

2.3 副溶血性弧菌熒光定量PCR的特異性試驗

將上述9株細(xì)菌提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測。結(jié)果如圖顯示，只有副溶血弧菌產(chǎn)生S型擴(kuò)增熒光曲線，其他8株非副溶血弧菌菌株均未出現(xiàn)S型熒光擴(kuò)增曲線(圖4)。對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，只有副溶血弧菌在130bp處才有明顯的特異性擴(kuò)增條帶(圖5)。

2.4 副溶血性弧菌熒光定量PCR的敏感度試驗

采用所建立的實時熒光定量PCR方法能檢測到副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)品DNA的下限濃度為1.69×10^-1pg/ml。采用普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)能檢測到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的下限濃度為1.69×10²pg/ml(圖8)。相比較之下，本發(fā)明建立的副溶血性弧菌實時熒光定量PCR比普通的PCR敏感度高了1000倍。

2.5 副溶血性弧菌熒光定量PCR的重復(fù)性

對同一樣品在同一次試驗和不同試驗間獲得的CT值進(jìn)行統(tǒng)計，同一次試驗內(nèi)的30個平行樣的擴(kuò)增曲線在閾值線附近基本上重合(圖9、圖10)，CT值平均讀數(shù)為20.95，標(biāo)準(zhǔn)差為0.40，變異系數(shù)為1.9％。同一樣品在不同30次試驗中所獲得的CT值也基本相同，CT值平均值為22.15，標(biāo)準(zhǔn)差為0.5155，變異系數(shù)為2.5％。以上統(tǒng)計結(jié)果表明，本實驗所建立的副溶血弧菌熒光定量PCR快速檢測方法重復(fù)性好，可對海產(chǎn)品中副溶血性弧菌進(jìn)行穩(wěn)定可靠的檢測。

3.檢測試劑盒的組裝

根據(jù)以上研究結(jié)果，組裝檢測試劑盒以方便使用。

該試劑盒包含A液、B液、C液和PCR反應(yīng)管；

A液為PCR反應(yīng)液，含SYBR Premix Ex TaqTM(2×)(Takara寶生物工程大連有限責(zé)任公司，規(guī)格：1ml×5，Code No.：RR820L，內(nèi)含TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I)12.5μL和上游引物toxR-F(10μmol/L)和下游引物toxR-R(10μmol/L)各1μL，去離子水8.5μL；

B液為副溶血性弧菌toxR基因的DNA，作為陽性對照；

C液為去離子水，作為陰性對照。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西大學(xué)

<120> 海產(chǎn)品副溶血性弧菌toxR基因的實時熒光定量PCR快速檢測引物及其試劑盒

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<400> 1

cgctcgctga ccaacaaa 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<400> 2

cgccaaacaa actcgtgaa 19