本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

副溶血性弧菌（vibrioparahaemolyticus，vp）是一種嗜鹽性弧菌，存在于近海的海水、海底沉積物和魚(yú)類、貝類等海產(chǎn)品或鹽腌漬品中，它是我國(guó)沿海地區(qū)最為常見(jiàn)的一種食源性致病菌。其引起的食物中毒，主要引起急性胃腸炎甚至敗血癥。近年來(lái)由副溶血性弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)超過(guò)沙門(mén)氏菌，躍居微生物食源性疾病病原菌第一位，成為我國(guó)首要的食源性致病菌。因而，加強(qiáng)對(duì)食品中副溶血性弧菌的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)研究十分必要。

目前對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及鑒定法、免疫學(xué)方法及基于pcr的分子生物學(xué)方法等。分離培養(yǎng)及鑒定法是檢測(cè)副溶血弧菌的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，它包括前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過(guò)程。該方法檢測(cè)結(jié)果相對(duì)可靠，但存在分離細(xì)菌操作步驟復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以滿足當(dāng)今社會(huì)對(duì)食源性致病菌快速檢測(cè)的需要。免疫學(xué)方法是基于抗原和抗體特異反應(yīng)的原理而進(jìn)行的一種檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)靈敏性及特異性易受抗體吸附能力和抗體特異性以及基質(zhì)背景干擾等因素的影響，同時(shí)存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性受限。以pcr為基礎(chǔ)的定性、定量分析方法是目前應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，雖然可以滿足快速檢測(cè)的要求，但操作過(guò)程中易出現(xiàn)交叉污染和錯(cuò)誤信號(hào)的放大等缺點(diǎn)，造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。pcr應(yīng)用要求有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)室管理和質(zhì)量控制措施，對(duì)設(shè)備和操作人員的要求較高，不利于在基層日常的檢測(cè)工作中普及和應(yīng)用。此外，由于食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)，通常需要較復(fù)雜的樣本處理及長(zhǎng)時(shí)間的預(yù)增菌過(guò)程，尤其在病原菌含量較低情況下難于檢出。因此，采用一種有效的樣品前富集技術(shù)，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的副溶血性弧菌檢測(cè)方法，對(duì)加強(qiáng)食源性疾病的預(yù)防和控制具有重要意義。

近年來(lái)，一些新的病原體檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)，并逐漸應(yīng)用于衛(wèi)生檢驗(yàn)工作中。免疫磁珠分離(immunomagneticseparation，ims)技術(shù)是將免疫學(xué)反應(yīng)與微球的磁性相結(jié)合的一種免疫學(xué)技術(shù)，它可將富集、分離融為一體，在免疫學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)純化等方面有廣泛應(yīng)用，具有操作簡(jiǎn)便、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。在食源性致病菌的檢測(cè)方面，ims法有效結(jié)合抗原-抗體反應(yīng)的特異性和磁珠的磁場(chǎng)響應(yīng)性，可實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜基質(zhì)中對(duì)目標(biāo)菌的快速分離和富集，能夠有效消除基質(zhì)干擾，從而提高檢測(cè)效率，是有效的樣品前處理方法，具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。雞卵黃抗體（igy）是通過(guò)免疫注射產(chǎn)蛋雞，從雞蛋中分離出的抗體，制備技術(shù)方法簡(jiǎn)單，制備的抗體產(chǎn)量高且性質(zhì)穩(wěn)定，可以彌補(bǔ)單克隆抗體制備繁瑣、抗體產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，在微生物檢測(cè)和疾病治療等方面已廣泛應(yīng)用。因此，在獲得理想效價(jià)及高特異性的igy抗體的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于免疫學(xué)方法檢測(cè)食品中的vp，可有效縮短檢測(cè)時(shí)間、提高方法準(zhǔn)確性。量子點(diǎn)(quantumdots，qds)是一種新型的半導(dǎo)體納米材料，具有較好的光化學(xué)特性和光譜特性，作為一種新型的標(biāo)記材料，與傳統(tǒng)的熒光染料相比，具有熒光壽命長(zhǎng)，激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，對(duì)稱性好，易于合成和生物修飾等特點(diǎn)，使量子點(diǎn)作為熒光探針在分析化學(xué)、衛(wèi)生檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本研究擬聯(lián)合利用免疫磁珠分離技術(shù)、雞卵黃抗體技術(shù)和量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)，依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)的原理，通過(guò)免疫磁珠上的抗體與樣品中目標(biāo)菌的特異性結(jié)合，從樣品中富集分離出目標(biāo)菌，再利用制備的量子點(diǎn)納米熒光生物探針進(jìn)行標(biāo)記，得到磁珠-細(xì)菌抗原-量子點(diǎn)“三明治”復(fù)合物，通過(guò)對(duì)復(fù)合物的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的快速、定量的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為解決針對(duì)現(xiàn)有副溶血性弧菌檢測(cè)方法存在的問(wèn)題，而提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒。

基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗副溶血性弧菌的納米熒光生物探針；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用edc和nhs活化后，再與兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體igg共價(jià)偶聯(lián)；所述的納米熒光生物探針是羧基化的熒光量子點(diǎn)活化后，與副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy偶聯(lián)；

所述的兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體igg的蛋白濃度為1mg/ml；

所述的副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy是以副溶血性弧菌全菌為抗原，經(jīng)滅活后，免疫spf級(jí)健康高產(chǎn)蛋雞，采用peg6000法對(duì)所述的免疫后雞蛋中的卵黃抗體igy進(jìn)行純化；蛋白濃度為1mg/ml；

所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是由下述方法制備的：

①取羧基化磁珠100μl至1.5ml離心管中，置于磁力架上磁性分離后棄去上清，加入mest緩沖溶液400μl清洗3次；所述mest緩沖液各成分含量如下：0.1mol/l2-(n-嗎啡啉)乙磺酸，0.5ml/l吐溫-20；所述的mest緩沖液ph為5.0；

②依次加入濃度為10mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亞胺鹽酸鹽mest緩沖液的溶液200μl，濃度為10mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺mest緩沖液的溶液200μl，利用垂直混合儀在25℃下活化30min；反應(yīng)結(jié)束后用pbst清洗3遍；所述的pbst緩沖液各成分：8gnacl，0.2g/lkcl、1.44g/lna2hpo4、0.24gkh2po4，0.5ml/ltween-20；所述的pbst緩沖液ph為7.4；

③活化后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用pbst緩沖液稀釋的副溶血性弧菌兔多克隆抗體igg孵育2h漩渦混勻后，利用垂直混合儀在25℃下反應(yīng)2h；偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，置于磁力架上磁性分離后棄去上清，400μlpbst溶液清洗3遍，加入1ml1%的bsa封閉；封閉結(jié)束后，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用400μlulpbs緩沖液洗滌3遍后，重懸于400μl的pbs溶液中，4℃保存；所述的pbs緩沖液各成分含量如下：8gnacl，0.2g/lkcl、1.44g/lna2hpo4、0.24gkh2po4；所述的pbs緩沖液ph為7.4；

所述的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗副溶血性弧菌的納米熒光生物探針由下述方法制備的：取10ul羧基化的熒光量子點(diǎn)于1.5ml棕色進(jìn)樣瓶中，加入用mest緩沖液配制的5mg/mledc和5mg/mlnhs各200μl，漩渦混勻后，利用垂直混合儀在25℃下活化30min；活化結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至微量離心管中，12000rpm離心5min；棄去上清并用pbst清洗1遍，活化后的量子點(diǎn)重懸于400μl的pbst中；加入副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy120μg，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下避光反應(yīng)2h；將量子點(diǎn)溶液移至微量離心管中，12000rpm離心5min，棄去上清并用pbst清洗1遍；加入1ml1%的bsa，渦旋混勻后利用垂直混合儀在25℃下繼續(xù)避光孵育1h進(jìn)行封閉；封閉結(jié)束后，將量子點(diǎn)溶液轉(zhuǎn)移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，棄去上清并用pbst清洗1遍；重懸于400μl的pbs溶液中，4℃保存；

所述的基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒，還包括陰性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，所述的陽(yáng)性質(zhì)控品為含有滅活的副溶血性弧菌的pbs溶液；所述陰性質(zhì)控品為無(wú)菌pbs溶液。

本發(fā)明提供了基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的副溶血性弧菌檢測(cè)試劑盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗副溶血性弧菌的納米熒光生物探針；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用edc和nhs活化后，再與兔抗副溶血性弧菌多克隆抗體igg共價(jià)偶聯(lián)；所述的納米熒光生物探針是羧基化的熒光量子點(diǎn)活化后，與副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy偶聯(lián)；利用本發(fā)明制備的試劑盒進(jìn)行副溶血性弧菌的檢測(cè)具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)食品中副溶血性弧菌的快速檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1免疫磁珠最佳加入量結(jié)果；

圖2為免疫磁珠富集時(shí)間的確定結(jié)果；

圖3量子點(diǎn)標(biāo)記的納米熒光生物探針最佳標(biāo)記時(shí)間的確定結(jié)果；

圖4量子點(diǎn)標(biāo)記的納米熒光生物探針最佳標(biāo)記量的確定結(jié)果；

圖5檢測(cè)方法的檢出限確定結(jié)果；

圖6檢測(cè)方法的特異性結(jié)果；

圖7模擬樣檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是根據(jù)免疫學(xué)中的抗體抗原特異性反應(yīng)原理，利用免疫磁珠對(duì)樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)，建立的一種具備多重信號(hào)放大、靈敏度高、特異性好、簡(jiǎn)便快速檢測(cè)副溶血性弧菌的方法，具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行具體的描述。實(shí)施中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方案，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1副溶血性弧菌兔克隆抗體igg的制備

取濃度為1×10⁹cfu·ml^-1滅活菌液與等量的弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑乳化完全，制備滅活疫苗。首次免疫取濃度為1×10⁹cfu·ml^-1弗氏完全佐劑疫苗免疫健康新西蘭大白兔（由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），采用背部皮下多點(diǎn)注射法，每只免疫2ml，在第二周、第三周采用同等劑量的弗氏不完全佐劑疫苗對(duì)兔進(jìn)行第二次免疫、第三次免疫。10天后，用滅活菌液加強(qiáng)免疫兩次。每次免疫前兔耳緣靜脈取血，測(cè)定血清效價(jià)。達(dá)到分離標(biāo)準(zhǔn)，兔心臟采血，分離血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法對(duì)所述的抗血清中的多克隆抗體igg進(jìn)行純化；采用間接elisa法對(duì)純化后抗體的效價(jià)和特異性進(jìn)行測(cè)定，表1為免疫前后兔血清及抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，血清抗體效價(jià)逐漸升高，最終獲得的副溶血性弧菌兔多克隆抗體效價(jià)可以達(dá)到1:1024000；表2為兔多克隆抗體igg特異性結(jié)果，結(jié)果顯示，制備的抗體特異性較好；采用bca蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的igg抗體的濃度進(jìn)行測(cè)定，并用pbs緩沖液將其蛋白濃度調(diào)整為1mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1免疫前后兔血清及抗體igg效價(jià)測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例2副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy的制備。

按實(shí)施例1的方法制備副溶血性弧菌弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑疫苗即可用來(lái)免疫蛋雞。采用肌肉多點(diǎn)注射的方式將疫苗接種于雞胸。首次免疫采用弗氏完全佐劑疫苗，每只雞1ml，間隔兩周后采用弗氏不完全佐劑疫苗進(jìn)行第二次免疫，隨后每隔兩周進(jìn)行一次強(qiáng)化免疫。收集免疫前后的雞蛋，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。采用peg6000鹽析法對(duì)雞蛋中的卵黃抗體進(jìn)行提取。采用間接elisa法對(duì)純化前后卵黃抗體的效價(jià)和特異性進(jìn)行測(cè)定，表3為免疫前后雞血清及抗體igy效價(jià)測(cè)定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，雞血清中的抗體效價(jià)逐漸升高，最后一次免疫后，抗體效價(jià)高達(dá)1：64000，經(jīng)提取純化后，最終獲得的副溶血性弧菌igy抗體效價(jià)可以達(dá)到1:128000。表4為雞卵黃抗體igy特異性結(jié)果，結(jié)果顯示制備的igy抗體特異性較好；采用bca蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的igy抗體的濃度進(jìn)行測(cè)定，并用pbs緩沖液將其蛋白濃度調(diào)整為1mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3免疫前后雞血清及抗體igy效價(jià)測(cè)定結(jié)果

表4雞卵黃抗體igy特異性結(jié)果

實(shí)施例3抗副溶血性弧菌免疫磁珠的制備

取羧基化磁珠（10mg/ml）100μl至1.5ml離心管中，置于磁力架上磁性分離后棄去上清，加入mest緩沖溶液400μl清洗3次；依次加入10mest緩沖溶液配置的濃度為10mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亞胺鹽酸鹽（edc）和n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）各200μl，渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下活化30min，活化結(jié)束后置于磁力架上磁性分離后棄去上清，將活化后的磁珠重懸于280μl的pbst中，得到活化后的磁珠；然后所制備的副溶血性弧菌兔多克隆抗體igg加入100μg孵育2h孵育2h，用400μlpbst溶液清洗3遍，加入1ml1%的bsa封閉磁珠表面未共價(jià)偶聯(lián)抗體的羧基官能團(tuán)；封閉結(jié)束后，將離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用400μlulpbs緩沖液洗滌3遍后,重懸于400μl的pbs溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4量子點(diǎn)標(biāo)記的抗副溶血性弧菌的納米熒光生物探針的制備

取10ul羧基化的熒光量子點(diǎn)于1.5ml棕色進(jìn)樣瓶中，加入用mest緩沖液配制的5mg/mledc和nhs各200μl，漩渦混勻后，利用垂直混合儀在25℃下活化30min?；罨Y(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至微量離心管中，12000rpm離心5min。棄去上清并用pbst清洗1遍，活化后的量子點(diǎn)重懸于400μl的pbst中。加入所制備的副溶血性弧菌雞卵黃抗體igy120μg，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下避光反應(yīng)2h。偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將量子點(diǎn)溶液移至微量離心管中，12000rpm離心5min，棄去上清并用pbst清洗1遍。加入1ml1%的bsa，渦旋混勻后利用垂直混合儀在25℃下繼續(xù)避光孵育1h進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，將量子點(diǎn)溶液轉(zhuǎn)移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，棄去上清并用pbst清洗1遍。最后重懸于400μl的pbs溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5緩沖液的配置

pbs緩沖液:取nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo41.44g、kh2po40.24g，溶于800ml蒸餾水中，用naoh調(diào)節(jié)ph至7.4，在定溶至1000ml。

實(shí)施例6菌液標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取﹣80℃保存菌種，進(jìn)行菌株活化。將活化后的菌株在3%氯化鈉胰蛋白胨瓊脂平板上劃線分純，37℃培養(yǎng)18~24h后，挑取單個(gè)菌落，接種3%氯化鈉胰蛋白胨液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12~18h。取1ml菌液10倍倍比稀釋平板傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。剩余的菌液用1%甲醛在室溫下滅活10min，將滅活的菌液3000rpm離心3min，收集菌體，然后用pbs溶液充分混勻，制成菌懸液并，用pbs溶液調(diào)節(jié)菌懸液濃度為10⁹cfu·ml^-1，存于4℃冰箱中備用。

實(shí)施例7質(zhì)控品的制備

①陽(yáng)性質(zhì)控品：陽(yáng)性質(zhì)控品由含10^3~10⁵滅活的副溶血性弧菌的pbs溶液構(gòu)成；

②陰性質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品由滅菌后的pbs溶液構(gòu)成。

實(shí)施例8基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的副溶血性弧菌檢測(cè)方法的建立

1.免疫磁珠最佳加入量的選擇

取25、50、75、100、150μl由實(shí)施例3所制備好的免疫納米磁珠分別加入到1ml含10⁵cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩沖液中，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下富集反應(yīng)1h，進(jìn)行免疫捕獲，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。將沉淀重懸于300μl的pbs中，加入100μl由實(shí)施例4所制備的熒光量子點(diǎn)生物探針，漩渦混勻后利用垂直混合儀在室溫25℃下避光孵育1h，進(jìn)行熒光標(biāo)記。孵育結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，得到磁珠—菌體抗原—量子點(diǎn)“三明治”夾心復(fù)合物。將得到的復(fù)合物重懸于1ml的pbs溶液中，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。圖1為免疫磁珠加入量?jī)?yōu)化結(jié)果，結(jié)果顯示當(dāng)隨著磁珠加入量的增加，樣品熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)免疫納米磁珠加入量達(dá)到50μl時(shí)，熒光值達(dá)到最大。再繼續(xù)增加免疫磁珠的量,熒光值反而降低。故選擇50μl作為免疫磁珠的最佳加入量。

2.免疫磁珠富集時(shí)間的選擇

取6份實(shí)施例3所制備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含10⁵cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩沖液中，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下分別富集15，30，45，60，90，120min。富集結(jié)束后通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，加入100μl由實(shí)施例4所制備的熒光量子點(diǎn)生物探針在25℃下避光孵育1h進(jìn)行標(biāo)記。孵育結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸于1ml的pbs溶液，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。圖2為免疫磁珠富集時(shí)間的確定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著富集時(shí)間的增加，樣品的熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。在富集時(shí)間為60min之后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度有所上升，但差異并不明顯。故選擇60min作為免疫磁珠最佳富集時(shí)間。

3.量子點(diǎn)標(biāo)記的納米熒光生物探針最佳標(biāo)記時(shí)間的確定

取6份實(shí)施例3所制備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含10⁵cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩沖液中，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結(jié)束后通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加100μl量子點(diǎn)探針，在25℃下避光孵育15，30，45，60，90，120min進(jìn)行標(biāo)記。孵育結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸于1ml的pbs溶液，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。圖3為量子點(diǎn)標(biāo)記的納米熒光生物探針最佳標(biāo)記時(shí)間的確定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著量子點(diǎn)探針標(biāo)記時(shí)間的增加，樣品的熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。而當(dāng)量子點(diǎn)探針的標(biāo)記時(shí)間在90min繼續(xù)增大時(shí)，樣品的熒光強(qiáng)度增加不明顯，故選擇90min作為量子點(diǎn)探針的最佳標(biāo)記時(shí)間。

4.量子點(diǎn)標(biāo)記的納米熒光生物探針最佳標(biāo)記量的確定

取6份實(shí)施例3所制備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含10⁵cfu/ml的副溶血性弧菌的pbs緩沖液中，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結(jié)束后通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加入50、100、200、300、400、500μl量子點(diǎn)探針，在25℃下避光孵育90min進(jìn)行標(biāo)記。孵育結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸于1ml的pbs溶液，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。圖4為量子點(diǎn)標(biāo)記的納米熒光生物探針最佳標(biāo)記量的確定結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著量子點(diǎn)探針用量的增加，樣品的熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。而當(dāng)量子點(diǎn)探針的量在300μl繼續(xù)增大時(shí)，樣品的熒光強(qiáng)度增加不明顯，故選擇300μl作為量子點(diǎn)探針的最佳標(biāo)記量。

檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

（1）檢出限實(shí)驗(yàn)

取7份實(shí)施例3所制備的免疫磁珠50μl，分別加入1ml含0，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶cfu/ml副溶血性弧菌的pbs緩沖液中，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結(jié)束后通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加300μl量子點(diǎn)探針，在25℃下避光孵育90min。孵育結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸于1ml的pbs溶液，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。圖5為檢測(cè)方法的檢出限確定結(jié)果，以樣品熒光強(qiáng)度值與空白對(duì)照熒光值之比≥2.1為判定該方法的最低檢測(cè)限。結(jié)果顯示當(dāng)菌液濃度為10²到10⁶cfu/ml時(shí)，復(fù)合物的熒光強(qiáng)度與菌液濃度呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=57.06x+13.80(r²=0.989)，該方法的最低檢測(cè)限（lod）為10²cfu/ml。

（2）特異性實(shí)驗(yàn)

取8份實(shí)施例3所制備的免疫磁珠50μl，分別加入1mlpbs和1ml含10⁵cfu/ml的副溶血性弧菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌的菌液以及副溶血性弧菌和沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌o157：h7、副溶血性弧菌和單增李斯特菌的混合菌液，漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下富集60min。富集結(jié)束后通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次，分別加300μl量子點(diǎn)探針，在25℃下避光孵育90min。孵育結(jié)束后，通過(guò)磁吸分離法用pbs溶液清洗3次。重懸于1ml的pbs溶液，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。圖6為檢測(cè)方法的特異性結(jié)果，結(jié)果顯示用本方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌時(shí)，復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值與空白對(duì)照pbs溶液的熒光強(qiáng)度值相近，故該方法不能識(shí)別沙門(mén)氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌；而使用本方法檢測(cè)副溶血性弧菌與沙門(mén)氏菌、大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌的混合菌液時(shí)，復(fù)合物的熒光強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照副溶血性弧菌相近，故本方法特異性較好，能特異性識(shí)別副溶血性弧菌。

（3）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取10²，10⁴，10⁶cfu/ml三種濃度的待測(cè)菌液，每個(gè)濃度的菌液設(shè)3個(gè)平行樣，按照所建立的方法，對(duì)待測(cè)樣品在同一天進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的日內(nèi)重復(fù)性。按照所建立的方法，對(duì)待測(cè)樣品連續(xù)三天進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的日間重復(fù)性。表5為檢測(cè)方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，日內(nèi)變異系數(shù)在4.03%~7.41%、，日間變異系數(shù)在2.03%~7.83%，均小于10%，表明建立的檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

表5檢測(cè)方法重復(fù)性結(jié)果

實(shí)施例9試劑盒的制備

由實(shí)施例3所描述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠、實(shí)施4例所描述的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗副溶血性弧菌的納米熒光生物探針、實(shí)施例5所描述的緩沖液、實(shí)施例6所描述的菌液標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)施例7所描述的質(zhì)控品共同組成基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)副溶血性弧菌抗原的試劑盒。

實(shí)施例10試劑盒的使用方法

待檢食品樣品研磨后，取5g勻漿，加入試劑盒中的pbs緩沖液10ml，充分混勻后，將1ml浸提液轉(zhuǎn)入離心管中，向該離心管中加入試劑盒中的抗副溶血性弧菌免疫磁珠50μl,漩渦混勻后利用垂直混合儀在25℃下富集60min,富集結(jié)束后將離心管插入磁力架分離，用移液器吸出上清。添加試劑盒中的pbs緩沖液洗滌3遍，磁分離后吸出洗滌液，再加入300μl試劑盒中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗副溶血性弧菌的納米熒光生物探針，室溫下置于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng),在25℃下避光孵育90min，通過(guò)量子點(diǎn)上的抗體與免疫納米磁珠上的副溶血性弧菌抗原的免疫結(jié)合，量子點(diǎn)被標(biāo)記到副溶血性弧菌表面，形成磁珠—副溶血性弧菌抗原—量子點(diǎn)“三明治”復(fù)合物。反應(yīng)完成后，磁吸分離，除去多余的量子點(diǎn)標(biāo)記探針，并用pbs緩沖液清洗3遍，復(fù)合物重新分散在1mlpbs緩沖液中，利用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm時(shí)，檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。按上述同樣的方法檢測(cè)試劑盒中提供的陰性質(zhì)控品及陽(yáng)性質(zhì)控品樣品，并利用標(biāo)準(zhǔn)菌液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，若陽(yáng)性質(zhì)控品樣品的熒光值小于陰性質(zhì)控品，則表明試劑盒失效。

實(shí)施例11模擬樣品的檢測(cè)

將蛤蜊去殼碾磨后，稱取5g溶解于10ml的pbs溶液中4℃浸泡24h，過(guò)濾收集浸出液。用該浸出液稀釋副溶血性弧菌，分別配制成濃度為0，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶cfu/ml的菌懸液然后按照所建立的方法，檢測(cè)模擬樣品。圖7為模擬樣檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著菌液濃度的增加，反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)菌液濃度為10²到10⁶cfu/ml時(shí)，復(fù)合物的熒光強(qiáng)度與菌液濃度呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=24.41x+33.50(r²=0.968)。根據(jù)樣品熒光強(qiáng)度值與空白對(duì)照熒光值之比≥2.1為判定該方法的最低檢測(cè)限，則此方法在該樣品中的檢測(cè)限為10²cfu/ml

綜上，利用本發(fā)明制備的試劑盒進(jìn)行副溶血性弧菌的檢測(cè)具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)食品中副溶血性弧菌的快速檢測(cè)。