本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體及其擴(kuò)培方法。
背景技術(shù)：
目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各種物理或化學(xué)的方法，包括各種抗生素的使用。物理或化學(xué)的方法都存在著明顯的弊端。首先，物理的方法對(duì)各種致病菌的消除作用只能應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的某一環(huán)節(jié)，不能實(shí)現(xiàn)整個(gè)領(lǐng)域所有環(huán)節(jié)的應(yīng)用，其次，化學(xué)方法中的酸堿處理雖可以取得一定防治效果，但在有害菌形成生物膜后，這些方法的效果就極不理想；最后，抗生素雖然開始使用效果顯著，但是長(zhǎng)期使用，不僅會(huì)增強(qiáng)病原菌的抗藥性，而且抑制有益菌群，最終不能有效地控制、消除致病菌。
近年來，微生物生態(tài)制劑的研究開發(fā)受到各方關(guān)注，特別是噬菌體的研究受到人們的青睞。噬菌體自1896年被發(fā)現(xiàn)以來，因其高效裂解其宿主，且對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害，而備受關(guān)注。噬菌體是一種細(xì)菌病毒，它能夠?qū)λ拗骷?xì)菌產(chǎn)生特異性的裂解作用，并在細(xì)菌培養(yǎng)板上形成空斑，因而將其命名為噬菌體。噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體，其中烈性噬菌體對(duì)宿主菌具有很強(qiáng)的裂解效率，其復(fù)制效率和繁殖能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于宿主菌；烈性噬菌體在宿主菌內(nèi)能穩(wěn)定增殖后，一個(gè)噬菌體顆粒能夠殺死數(shù)億個(gè)宿主菌。噬菌體效價(jià)(滴度)是單位體積內(nèi)(ml)內(nèi)有的噬菌體個(gè)數(shù)。由于噬菌體對(duì)宿主菌的高效裂解能力，用于治療細(xì)菌感染，特別是治療耐藥細(xì)菌感染的噬菌體制劑的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，受到越來越多的生物技術(shù)公司和研究機(jī)構(gòu)的重視。
專利號(hào)為cn200910038392.x名稱為一種分離的副溶血弧菌噬菌體及其在殺菌和防菌中的應(yīng)用的國(guó)家發(fā)明專利公開了一種分離的副溶血弧菌噬菌體(vibrioparahaemolyticus)及其在殺菌和防菌中的應(yīng)用。分離出的噬菌體單體命名為bph-vp-1，對(duì)副溶血弧菌具有廣譜的殺菌能力。
專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510872234.x名稱為一種副溶血弧菌噬菌體及其制備方法和應(yīng)用涉及一種副溶血弧菌噬菌體及其作為生物殺菌劑在食品及水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境中的殺菌應(yīng)用。分離的副溶血弧菌噬菌體，保藏號(hào)cctccm2015577，對(duì)副溶血弧菌具有高效的裂解活性，其分離培養(yǎng)物及復(fù)配制劑能夠作為食品添加劑或環(huán)境消毒劑防控食品中副溶血弧菌的污染。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體及其擴(kuò)培方法，具有噬菌體裂解性強(qiáng)的特點(diǎn)，該噬菌體具有殺菌速度快、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，同時(shí)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，避免了副溶血弧菌對(duì)環(huán)境的危害。
該噬菌體的保藏單位代碼為cctcc-中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心地址為：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期是2016年12月9日，保藏編號(hào)為cctccno：m2016740，保藏檢測(cè)結(jié)果為存活，名稱為副溶血弧菌噬菌體vp11，分類命名為vibrioparahaemolyticusbacteriophagevp11。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體，其特征在于包括如下步驟：
步驟a：宿主菌的分離純化，本發(fā)明的副溶血弧菌從大量南美白對(duì)蝦的病蝦腸道中分離獲得；
步驟b：宿主菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，在nb或lb液體培養(yǎng)基中加入1-5％的nacl，121℃高壓滅菌20min，冷卻至室溫，采用如下兩種接種方法，第一種接種方法是單菌落接種，在無(wú)菌條件下挑取保種平板上的單菌落接種，發(fā)酵溫度為28-35℃，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，發(fā)酵時(shí)間14-18h；第二種接種方法是液體接種，加入培養(yǎng)基體積10-20％的cfu為106-108pfu/ml的副溶血弧菌菌液至nb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28-35℃，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，發(fā)酵時(shí)間10-16h；
步驟c：噬菌體分離，從大量海水中分離獲得；
步驟d：噬菌體擴(kuò)培，對(duì)分離出來的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)培；
步驟e：將所得的發(fā)酵液，在2-10℃下1000-8000rpm離心5-20min，使得宿主菌沉降于底部，取上層澄清部分，即得噬菌體微生態(tài)制劑，其效價(jià)為1010-1012pfu/ml；
步驟f：噬菌體用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的裂解生長(zhǎng)曲線測(cè)定；
步驟g：南美白對(duì)蝦攻毒實(shí)驗(yàn)，取大小規(guī)格為50尾/斤的健康南美白對(duì)蝦，每缸60尾，分別養(yǎng)殖在15個(gè)玻璃缸內(nèi)，其中9個(gè)為實(shí)驗(yàn)缸，分為a、b、c組；剩余6個(gè)為對(duì)照缸，分為陰性對(duì)照d和空白對(duì)照e組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)玻璃缸內(nèi)加120l鹽度為25的海水；對(duì)蝦染病的方法采用浸泡感染，即在28℃條件下，使用步驟b發(fā)酵好的副溶血弧菌菌液，根據(jù)菌液濃度和玻璃缸體積計(jì)算出每組需要加入菌液的體積，分別加入a、b、c和陰性對(duì)照d組，最終使玻璃缸內(nèi)水體含菌量達(dá)1×108cfu/ml，對(duì)照e組不做任何處理，3組實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)分別加噬菌體1×105pfu/ml、1×104pfu/ml、1×103pfu/ml，a組、b組、c組，記錄南美白對(duì)蝦死亡情況。
優(yōu)選的，所述步驟b中副溶血弧菌為對(duì)蝦強(qiáng)致病菌，單菌落接種發(fā)酵時(shí)間14-18h；第二種接種方法的接種菌液cfu為106-108之間，接種比例10-20％，發(fā)酵時(shí)間10-16h。
優(yōu)選的，所述步驟d中用于接種噬菌體的pfu為104-108pfu/ml，接種體積為發(fā)酵液體積的1-20％之間。
優(yōu)選的，所述步驟d中擴(kuò)培條件為溫度為28～37℃，轉(zhuǎn)速為50～200rpm；
優(yōu)選的，擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間控制在8-12h之間。
優(yōu)選的，所述步驟e中，在2～10℃溫度下1000-8000rpm離心5～20min，使得宿主菌沉降于底部，取上層澄清部分，即得噬菌體生態(tài)制劑，其效價(jià)為1010～1012pfu/ml。
一株用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體的擴(kuò)培方法，應(yīng)用一株用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體，噬菌體的擴(kuò)培是將1-20％的pfu為104-108pfu/ml噬菌體加到上述發(fā)酵好的副溶血弧菌發(fā)酵液中，發(fā)酵溫度28-37℃，轉(zhuǎn)速50-200rpm，發(fā)酵時(shí)間8-12h。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明利用南美白對(duì)蝦感染的副溶血弧菌在海水中分離得到一株強(qiáng)裂解性噬菌體，該噬菌體產(chǎn)量高(其效價(jià)為達(dá)1010-1012pfu/ml)，發(fā)酵周期短(8-12h)，對(duì)于治療副溶血弧菌引起的病害具有重大意義。該噬菌體命名為vp11，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心cctcc，地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期是2016年12月9日，保藏編號(hào)為cctccno：m2016740。具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.分離的噬菌體能夠高效價(jià)裂解副溶血弧菌，具有靶向特異殺菌、長(zhǎng)期持續(xù)作用、對(duì)環(huán)境安全等特點(diǎn)；2.生長(zhǎng)周期短，培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)量高；3.采用噬菌體處理養(yǎng)殖用水，相對(duì)于抗生素，具有不污染水質(zhì)、避免耐藥菌株產(chǎn)生且成本低廉的優(yōu)勢(shì)；4.可以用于治療對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中副溶血弧菌引起的病害，促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖的豐產(chǎn)和豐收；5.在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，避免了副溶血弧菌對(duì)環(huán)境的危害。
附圖說明
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
圖1是本發(fā)明用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體及其擴(kuò)培方法中噬菌體一步生長(zhǎng)曲線圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體包括如下步驟：步驟a：宿主菌的分離純化，本發(fā)明的副溶血弧菌從大量南美白對(duì)蝦的病蝦腸道中分離獲得。步驟b：宿主菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，在nb或lb液體培養(yǎng)基中加入1-5％的nacl，121℃高壓滅菌20min，冷卻至室溫。有兩種接種方法：一是單菌落接種，在無(wú)菌條件下挑取保種平板上的單菌落接種，發(fā)酵溫度為28-35℃，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，發(fā)酵時(shí)間14-18h；二是液體接種，加入培養(yǎng)基體積10-20％的cfu為106-108pfu/ml的副溶血弧菌菌液至nb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28-35℃，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，發(fā)酵時(shí)間10-16h；步驟c：噬菌體分離，從大量海水中分離獲得。步驟d：噬菌體擴(kuò)培，對(duì)分離出來的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)培。步驟e：將所得的發(fā)酵液，在2-10℃下1000-8000rpm離心5-20min，使得宿主菌沉降于底部，取上層澄清部分，即得噬菌體微生態(tài)制劑，其效價(jià)為1010-1012pfu/ml。步驟f：噬菌體用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的裂解生長(zhǎng)曲線測(cè)定，見表1。步驟g：南美白對(duì)蝦攻毒實(shí)驗(yàn)，取大小規(guī)格為50尾/斤的健康南美白對(duì)蝦，每缸60尾，分別養(yǎng)殖在15個(gè)玻璃缸內(nèi)，其中9個(gè)為實(shí)驗(yàn)缸，分為a、b、c組；剩余6個(gè)為對(duì)照缸，分為陰性對(duì)照d和空白對(duì)照e組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)玻璃缸內(nèi)加120l鹽度為25的海水。對(duì)蝦染病的方法采用浸泡感染，即在28℃條件下，使用步驟b發(fā)酵好的副溶血弧菌菌液，根據(jù)菌液濃度和玻璃缸體積計(jì)算出每組需要加入菌液的體積，分別加入a、b、c和陰性對(duì)照d組，最終使玻璃缸內(nèi)水體含菌量達(dá)1×108cfu/ml，對(duì)照e組不做任何處理，3組實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)分別加噬菌體1×105pfu/ml(a組)、1×104pfu/ml(b組)、1×103pfu/ml(c組)，記錄南美白對(duì)蝦死亡情況。結(jié)果，見表1，發(fā)現(xiàn)：未施加噬菌體的陰性對(duì)照組d，對(duì)蝦72h內(nèi)全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組發(fā)病對(duì)蝦癥狀較輕；噬菌體使用濃度越高，對(duì)蝦的發(fā)病程度越輕，存活率就越高，實(shí)驗(yàn)組存活率達(dá)到85％以上。
表1噬菌體防治南美白對(duì)蝦副溶血弧菌病的攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果(72h)
本發(fā)明利用南美白對(duì)蝦感染的副溶血弧菌在海水中分離出一株強(qiáng)裂解性噬菌體，該噬菌體發(fā)酵后效價(jià)達(dá)1010-1012pfu/ml，發(fā)酵周期為8-12h。具有如下優(yōu)點(diǎn)：分離的噬菌體能夠高效價(jià)裂解性噬菌體，具有靶向特異殺菌、長(zhǎng)期持續(xù)作用、對(duì)環(huán)境安全等特點(diǎn)；發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)量高；采用噬菌體處理養(yǎng)殖用水，相對(duì)于抗生素，具有不污染水質(zhì)、避免耐藥菌株產(chǎn)生且成本低廉的優(yōu)勢(shì)；可以用于治療對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中副溶血弧菌引起的病害，促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖的豐產(chǎn)和豐收；在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，避免了副溶血弧菌對(duì)環(huán)境的危害。
用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體的檢測(cè)，采用上述的用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體，采用點(diǎn)滴法將過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌均勻涂布于lb平板，待平板干透，滴加20-50ul的擴(kuò)培液，保持環(huán)境溫度28-37℃并靜置培養(yǎng)8-18小時(shí)，觀察有無(wú)噬菌斑出現(xiàn)；采用雙層平板法，將凝固的nb或lb半固體培養(yǎng)基加熱至完全融化，待溫度降至45℃時(shí)，加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的副溶血弧菌0.2ml和富集液0.1ml，倒入lb平板上層，待凝固后，于28-37℃培養(yǎng)8-18小時(shí)，觀察有無(wú)噬菌斑出現(xiàn)；若采用上述的點(diǎn)滴法和雙層平板法兩種方法檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性，則證明存在噬菌體。
用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體的效價(jià)鑒定，基于用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體的檢測(cè)，將噬菌體濾液連續(xù)十倍倍比稀釋，采用雙層平板法培養(yǎng)過夜，接著統(tǒng)計(jì)噬菌斑個(gè)數(shù)，噬菌斑個(gè)數(shù)以每na或lb平板30-300個(gè)為準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)三次，取三次的平均值為最終噬菌體的效價(jià)，其中，效價(jià)換算公式為：噬菌體效價(jià)＝噬菌斑個(gè)數(shù)3*稀釋倍數(shù)/加入的噬菌體濾液體積。效價(jià)鑒定過程中若每na或lb平板的噬菌斑個(gè)數(shù)若成倍大于或者成倍小于每na或lb平板30-300個(gè)，則需成倍增加或者成倍減少噬菌體濾液稀釋倍數(shù)。
一株用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體的擴(kuò)培方法，應(yīng)用一株用于防治對(duì)蝦副溶血弧菌病的噬菌體，噬菌體的擴(kuò)培是將1-20％的pfu為104-108pfu/ml噬菌體加到上述發(fā)酵好的副溶血弧菌發(fā)酵液中，發(fā)酵溫度28-37℃，轉(zhuǎn)速50-200rpm，發(fā)酵時(shí)間8-12h。
如圖1所示的噬菌體一步生長(zhǎng)曲線，將噬菌體接種于宿主菌菌懸液中，取時(shí)間0，25，50，75，100，125，150，175，200，720，1440min，利用雙層板法，進(jìn)行噬菌體數(shù)量檢測(cè)，得到噬菌體一步生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，噬菌體vp11對(duì)于副溶血弧菌vp11裂解性能強(qiáng)，具有極強(qiáng)的殺弧菌能力，可達(dá)1010pfu/ml以上。
最后需要說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制性技術(shù)方案，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，那些對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本技術(shù)方案的宗旨和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。