本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：免疫細(xì)胞療法作為繼手術(shù)，放療，化療之后第四種治療癌癥的新方法最近幾年已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，當(dāng)前免疫細(xì)胞以高效的殺瘤活性和無副作用已經(jīng)受到醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可，cik作為免疫治療中較為成熟的治療方法，目前存在很多種誘導(dǎo)方法，其質(zhì)量和數(shù)量也參差不齊；也有在不同方向?qū)ik制備方面的研究，但實(shí)際應(yīng)用中因受到細(xì)胞因子和制劑較多，周期較長，制備標(biāo)準(zhǔn)不一的影響，出現(xiàn)制備工藝繁瑣，不穩(wěn)定，細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量不能有效控制，甚至出現(xiàn)污染等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑及其培養(yǎng)方法，主要解決cik細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞誘導(dǎo)質(zhì)量以及細(xì)胞增殖數(shù)量的穩(wěn)定性問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑，該試劑包括試劑a：50ng/ml抗cd3單克隆抗體；試劑b：1000iu/mlifn-γ；試劑c：1000iu/mlil-2和20ng/mlil-15；試劑d：100iu/mlil-1；試劑e：淋巴細(xì)胞分離液40ml。一種利用上述試劑對(duì)cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括如下步驟：1)、取試劑a于t-175培養(yǎng)瓶包被，4℃過夜；2)、取機(jī)采外周血30ml，用d-pbs稀釋至50ml，試劑e利用密度梯度離心法收獲pbmc，1500rpm30分鐘；3)、將收集的pbmc用d-pbs清洗2遍，1350rpm5分鐘，將清洗后的pbmc按照1-2*10^6/ml重懸于100mlx-vivo15培養(yǎng)基中，加入試劑b，置于二氧化碳培養(yǎng)箱孵育；4)、24小時(shí)后加入試劑c100ul和試劑d；5)、第3天加入150ml培養(yǎng)基和試劑c150ul；6)、第6天加入450ml培養(yǎng)基和試劑c450ul，分別轉(zhuǎn)移至2個(gè)培養(yǎng)袋中；7)、第9天分別在兩個(gè)培養(yǎng)袋加入450ml培養(yǎng)基和試劑c450ul；8)、第12天分別在兩個(gè)培養(yǎng)袋加入400ml培養(yǎng)基和試劑c400ul，取樣做質(zhì)檢；9)、第14天收集細(xì)胞，并取樣做流式，即可。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)簡單，高效，穩(wěn)定的誘導(dǎo)cik細(xì)胞；在經(jīng)典制備方案中加入il-15更好的提高了cik細(xì)胞的增殖數(shù)量和γ-ifn的分泌，提高cik細(xì)胞的抗瘤作用；cik細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞誘導(dǎo)質(zhì)量高以及細(xì)胞增殖數(shù)量的穩(wěn)定性好。附圖說明圖1為檢測(cè)組一檢測(cè)結(jié)果圖；圖2為檢測(cè)組二檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為檢測(cè)組三檢測(cè)結(jié)果圖；具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。實(shí)施例1一種cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑，該試劑包括試劑a：50ng/ml抗cd3單克隆抗體；試劑b：1000iu/mlifn-γ；試劑c：1000iu/mlil-2和20ng/mlil-15；試劑d：100iu/mlil-1；試劑e：淋巴細(xì)胞分離液40ml；利用上述試劑對(duì)cik細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括如下步驟：1)、取試劑a于t-175培養(yǎng)瓶包被，4℃過夜；2)、取機(jī)采外周血30ml，用d-pbs稀釋至50ml，試劑e利用密度梯度離心法收獲pbmc，1500rpm30分鐘；3)、將收集的pbmc用d-pbs清洗2遍，1350rpm5分鐘，將清洗后的pbmc按照1-2*10^6/ml重懸于100mlx-vivo15培養(yǎng)基中，加入試劑b，置于二氧化碳培養(yǎng)箱孵育；4)、24小時(shí)后加入試劑c100ul和試劑d；5)、第3天加入150ml培養(yǎng)基和試劑c150ul；6)、第6天加入450ml培養(yǎng)基和試劑c450ul，分別轉(zhuǎn)移至2個(gè)培養(yǎng)袋中；7)、第9天分別在兩個(gè)培養(yǎng)袋加入450ml培養(yǎng)基和試劑c450ul；8)、第12天分別在兩個(gè)培養(yǎng)袋加入400ml培養(yǎng)基和試劑c400ul，取樣做質(zhì)檢；9)、第14天收集細(xì)胞，并取樣做流式，即可。采用本方法與現(xiàn)有試劑盒說明使用方法對(duì)比；檢測(cè)組一：從血液中分離pbmc,第0天加入γ-ifn1000u/ml，放置培養(yǎng)箱孵育，24小時(shí)候加il-1100u/ml，il-21000u/ml，oak3100ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，第3,6,9,12天補(bǔ)液，第14天做流式檢測(cè)；檢測(cè)組二和檢測(cè)組三為按照試劑盒說明使用；如下表所示：檢測(cè)組一：經(jīng)典方案檢測(cè)組二：試劑盒方案檢測(cè)組三：試劑盒方案第0天0.5*10e80.5*10e80.5*10e8第3天0.9*10e81.1*10e81*10e8第6天3.2*10e84*10e83.8*10e8第9天8*10e810*10e89.6*10e8第12天28*10e830*10e831*10e8第14天80*10e8102*10e8106*10e8cd3+cd56+32.76％(圖1)45.74％(圖2)48.66％(圖3)通過附圖1-3所示以及上述對(duì)比表所示的檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒相對(duì)于經(jīng)典培養(yǎng)方案，不僅在數(shù)量有很大的提升，cd3+,cd56+雙陽性的效應(yīng)細(xì)胞也有很大的提高。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)簡單，高效，穩(wěn)定的誘導(dǎo)cik細(xì)胞；在經(jīng)典制備方案中加入il-15更好的提高了cik細(xì)胞的增殖數(shù)量和γ-ifn的分泌，提高cik細(xì)胞的抗瘤作用；cik細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞誘導(dǎo)質(zhì)量高以及細(xì)胞增殖數(shù)量的穩(wěn)定性好。以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而并非對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。當(dāng)前第1頁12