本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一株利用木聚糖為唯一碳源直接生產(chǎn)丁醇的菌株。

背景技術：

作為燃料，丁醇具有能量密度大，對水的穩(wěn)定性高、可直接用于內(nèi)燃機、運輸方便等優(yōu)點，在能源危機日益嚴峻的今天，丁醇作為燃料有著廣闊的發(fā)展前景。丁醇又是重要的有機化工原料，廣泛應用于油漆、表面涂料、皮革處理、塑料等領域。

丁醇的生產(chǎn)方法主要有乙醛縮合法，丙烯羰基合成法和發(fā)酵法等。乙醛縮合法工藝流程長，收率低，成本較高，目前在國外已被淘汰；丙烯羰基合成法生產(chǎn)丁醇的原料為石化下游產(chǎn)品丙烯；隨著石油價格飛漲和資源加速枯竭，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇受到了廣泛的重視，逐漸成為生物能源的研究熱點之一。

傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇主要以糧食或其它淀粉質(zhì)農(nóng)副產(chǎn)品為原料，經(jīng)水解得到發(fā)酵液，然后在發(fā)酵菌的作用下得到丙酮、丁醇、乙醇的混合物。目前用來生產(chǎn)丁醇的菌株大都為溶劑梭菌，如拜式梭菌，丙酮丁醇梭菌等，一般利用葡萄糖等單糖為碳源，且培養(yǎng)溫度不超過37℃。由于其不能利用木質(zhì)纖維素為碳源，其生產(chǎn)成本大大提高，不利于工業(yè)生產(chǎn)。谷物秸稈中的主要成分為纖維素和半纖維素，其中半纖維素的主要組分為木聚糖，能以木聚糖為唯一碳源生產(chǎn)丁醇可以大大降低生產(chǎn)成本，并且還可以變廢為寶。此外，嗜熱菌較嗜溫菌而言，有諸多優(yōu)勢：可以大大降低發(fā)酵過程中染菌情況的發(fā)生，可以更好地維持厭氧環(huán)境，可以降低發(fā)酵過程中冷卻設備帶來的成本等等。故尋找能夠利用木質(zhì)纖維素為碳源生產(chǎn)溶劑的嗜熱菌株受到越來越多的關注。目前為止，已報道的能夠直接利用木質(zhì)纖維素直接生產(chǎn)丁醇的菌株只有thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum，但野生菌的丁醇產(chǎn)量基本都在0.1g/l以下。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株利用木聚糖為唯一碳源直接生產(chǎn)丁醇的菌株。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述菌株的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一株利用木聚糖為唯一碳源直接生產(chǎn)丁醇的菌株，其分類命名為熱解糖高溫厭氧桿菌(thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)，菌株號為m5，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2017年2月27日，保藏號為：cctccno：m2017072，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學。

本發(fā)明所述的菌株m5，其16srdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本發(fā)明所述的thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5篩選方法為：在以木聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，對從內(nèi)蒙古草原草堆中采取回的土樣進行篩選。

具體地，以含木聚糖的平板作為培養(yǎng)基，在厭氧的高溫條件下進行培養(yǎng)，55-65℃培養(yǎng)3-5天，進行劃線純化5-7次，最終能在平板上生長的菌株進行驗證，并將其發(fā)酵，考察其發(fā)酵產(chǎn)物和性能，發(fā)現(xiàn)其可以利用很多碳源進行生長，并且可以直接利用木聚糖產(chǎn)生丁醇。

本發(fā)明所述的thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5可以通過木聚糖酶降解木聚糖得到木糖，并在木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的作用下得到3-p-甘油醛，從而進入三羧酸循環(huán)，得到丙酮酸，在經(jīng)過一系列酶的催化最終可以得到乙酸，乙醇，丁酸，丁醇等產(chǎn)物。并且這些酶都具有較強的溫度耐受性，對工業(yè)生產(chǎn)具有很高的價值。

一種含有本發(fā)明所述的能利用木聚糖為唯一碳源生產(chǎn)丁醇的菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm516srdna序列的克隆載體。

所述的重組克隆載體，優(yōu)選出發(fā)載體為pmd19t。

含所述的菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm516srdna序列的基因工程菌escherichcolidh5α(pmd19t-16s)。

所述的基因工程菌escherichcolidh5α構(gòu)建方法：利用引物27f：

5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-taccttgttacgactt-3’擴增菌株m5的16srdna，通過t/a克隆的方式連接至克隆載體pmd19t，構(gòu)建重組克隆載體pmd19t-16s，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌escherichcolidh5α獲得重組微生物escherichcolidh5α(pmd19t-16s)，將所獲得的重組微生物外源片段進行測序，ncbi數(shù)據(jù)庫比對該16srdna序列，在分子水平上將菌株m5鑒定至thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum菌屬。

本發(fā)明所述菌株m5通過基因組測序，發(fā)現(xiàn)其中含有兩個木聚糖內(nèi)切酶和兩個木糖苷酶，四個醇脫氫酶以及一系列丁醇代謝途徑所需的酶，均可以進行重組克隆，進行異源表達。木聚糖由β-1，4糖苷鍵形成主鏈結(jié)構(gòu)和不同的側(cè)鏈取代基，常見的取代基包括4-o-甲基葡萄糖醛酸(4-o-met-hylglucuronic)、α-阿拉伯糖(α-arabinofuranose)及o-乙?；?o-acetylgroup)等。木聚糖的完全降解需要多種水解酶的協(xié)同作用，其中起關鍵作用的酶為β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶和β-木糖苷酶。β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈，切斷木聚糖骨架從而生成不同長度的木寡糖和少量的木糖，降低聚合度，而β-木糖苷酶通過從非還原末端水解出d-木糖的方式降解低聚木糖和木二糖，解除木聚糖內(nèi)切酶作用后終端產(chǎn)物的抑制作用，從而增加木聚糖內(nèi)切酶對木聚糖的分解，所以這兩種酶是木聚糖降解過程中最關鍵的兩種酶。經(jīng)過基因組測序，thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5菌株中含有兩個β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶基因，兩個β-木糖苷酶基因，并且菌株m5具備從木糖到丁醇的全部基因，且其本身無丙酮的產(chǎn)生，是迄今為止報道的唯一能直接利用木聚糖生產(chǎn)丁醇且無丙酮生成的野生菌株。除此之外，菌株m5可以在55-65℃下生長，其分泌出的從木聚糖到生產(chǎn)丁醇的酶均具有較高的溫度穩(wěn)定性。

上述菌株在降解木聚糖生成丁醇中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

具體的應用方法為，將菌株m5以接種量1～10％v/v接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，55-65℃，攪拌或震蕩培養(yǎng)，每隔24h調(diào)節(jié)ph至4.5-9.0(優(yōu)選ph6.0)，發(fā)酵60-168h(優(yōu)選72h)。

其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為nacl1g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，酵母粉3g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，fecl2·4h2o1.5g/l，kcl0.3g/l，調(diào)節(jié)ph至6.5，碳源20-45g/l。

其中，所述的碳源為葡萄糖、木糖、淀粉或木聚糖。最優(yōu)選的是，所述的碳源僅為木聚糖。

有益效果：本發(fā)明以內(nèi)蒙古草原草堆中的土壤為分離材料，通過一系列的篩選分離純化得到一株可以利用木聚糖為唯一碳源生長的菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5，在高溫厭氧的情況下發(fā)酵可以生產(chǎn)得到丁醇。此外，該菌株m5還可以利用葡萄糖，木糖，淀粉等為碳源進行生長，且其所包含的酶均具備較高溫度穩(wěn)定性，對工業(yè)生產(chǎn)有一定的參考價值。菌株m5在3-5天內(nèi)可以基本降解30g/l的木聚糖，并利用其為唯一碳源生長，將木聚糖降解為木糖后，再通過木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶得到丙酮酸，而后通過一系列代謝途徑得到乙酸，乙醇，丁酸，丁醇。本發(fā)明中以木聚糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的所有途徑的酶均可耐受55-65℃高溫，并且菌株m5是該菌屬目前為止唯一報道的可以直接利用木聚糖生產(chǎn)丁醇的菌株，為工業(yè)生產(chǎn)丁醇提供了一系列耐高溫酶，具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為不同c源下各種產(chǎn)物的產(chǎn)量。

圖2為不同fe²⁺濃度下各種產(chǎn)物的產(chǎn)量。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：

以木聚糖為唯一碳源的嗜熱菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5的分離篩選：

稱取1g內(nèi)蒙古草堆中采取的土樣，用生理鹽水稀釋，吸取200μl至以木聚糖為唯一碳源的平板上，于60℃厭氧培養(yǎng)5d。生長出的菌落劃線純化5代，從而篩選出能夠直接利用木聚糖且嗜熱的菌株。

上述平板的培養(yǎng)基配方為nacl1g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，酵母粉3g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，fecl2·4h2o1.5g/l，kcl0.3g/l，調(diào)節(jié)ph至6.5，木聚糖30g/l，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15-20g/l，通氮氣10-20min，121℃滅菌15min。

實施例2：

以木聚糖為唯一碳源的嗜熱菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5的鑒定及其生長特性：

m5的鑒定：

對dl-10進行16srdna鑒定：利用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-taccttgttacgactt-3’擴增菌株m5的16srdna，通過t/a克隆的方式連接至克隆載體pmd19t，構(gòu)建重組克隆載體pmd19t-16s，將其轉(zhuǎn)化到克隆宿主菌escherichcolidh5α獲得重組微生物escherichcolidh5α(pmd19t-16s)，將所獲得的重組微生物外源片段進行測序，ncbi數(shù)據(jù)庫比對該16srdna序列，在分子水平上將菌株m5鑒定至thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum菌屬，其16srdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

m5生長及代謝特性：

菌株m5可以在55-65℃下很好地生長，在ph6.0-6.5下生長良好，但在ph5.0以下，生長明顯受到抑制。m5在24-48h時處于對數(shù)生長期，期間會產(chǎn)生較多的乙酸和丁酸，使ph明顯下降，從而生長受到影響，啟動產(chǎn)醇機制，開始生成乙醇和丁醇。其中m5中的乙醇脫氫酶為鐵離子依賴型，故培養(yǎng)基中需添加鐵離子，且在丁醇生產(chǎn)過程中存在還原力不足的情況。

實施例3：

以木聚糖為唯一碳源的嗜熱菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5利用不同碳源生長及發(fā)酵特性：

菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5可以利用葡萄糖、木糖、淀粉、木聚糖等單糖或多糖為碳源生長(圖1)。菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5從平板上挑取菌株m5單菌落接種到5ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，60℃，120r·min^-1培養(yǎng)48h，然后以接種量5％v/v接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，60℃，120r·min^-1震蕩培養(yǎng)，每隔24h調(diào)節(jié)ph至6.0-6.2，72h后用gc測其各種產(chǎn)物的濃度。發(fā)酵120h后的發(fā)酵產(chǎn)物濃度如下：乙醇2.52g/l，丁醇0.78g/l，乙酸3.34g/l，丁酸3.05g/l。

上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為nacl1g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，酵母粉3g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，fecl2·4h2o1.5g/l，kcl0.3g/l，調(diào)節(jié)ph至6.5，碳源30g/l，通氮氣10-20min，121℃滅菌15min。由圖1所示，分別以葡萄糖，木糖，淀粉，木聚糖為底物培養(yǎng)thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5，以木聚糖為底物生產(chǎn)丁醇的量最高，達到0.78g/l。葡萄糖為底物時產(chǎn)酸量較高。木糖為木聚糖的單體，但以木糖為底物時的丁醇產(chǎn)量與以木聚糖為底物時的丁醇產(chǎn)量并沒有太大的變化，說明該菌株具有較強降解木聚糖的能力。

實施例4：

嗜熱菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5在不同溫度下的生長及發(fā)酵特性：

菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5從平板上挑取菌株m5單菌落接種到5ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，120r·min^-1培養(yǎng)48h，然后以接種量5％v/v接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，120r·min^-1震蕩培養(yǎng)，每隔24h調(diào)節(jié)ph至6.0-6.2，72h后用gc測其各種產(chǎn)物的濃度。上述過程中培養(yǎng)溫度不同，分別為37℃和60℃。

thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5在37℃下培養(yǎng)時，菌株基本不生長，產(chǎn)物量基本為0，而在60℃下反而生長較好，并有0.78g/l丁醇生成。

上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為nacl1g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，酵母粉3g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，fecl2·4h2o1.5g/l，kcl0.3g/l，調(diào)節(jié)ph至6.5，木聚糖30g/l，通氮氣10-20min，121℃滅菌15min。

實施例5

嗜熱菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5在不同濃度fe²⁺下的生長及發(fā)酵特性：

菌株thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5從平板上挑取菌株m5單菌落接種到5ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，120r·min^-1培養(yǎng)48h，然后以接種量5％v/v接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，60℃，120r·min^-1震蕩培養(yǎng)，每隔24h調(diào)節(jié)ph至6.0-6.2，72h后用gc測其各種產(chǎn)物的濃度。thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumm5在fe²⁺濃度為0.01g/l時，丁醇產(chǎn)量為1.32g/l，達到丁醇產(chǎn)量最高(圖2)。

上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為nacl1g/l，k2hpo40.75g/l，kh2po40.75g/l，酵母粉3g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，kcl0.3g/l，調(diào)節(jié)ph至6.5，木聚糖30g/l，通氮氣10-20min，121℃滅菌15min。上述培養(yǎng)基中fe²⁺濃度分別為0，0.005g/l，0.01g/l，0.05g/l，0.1g/l。

sequencelisting

<110>南京工業(yè)大學

<120>一株利用木聚糖為唯一碳源直接生產(chǎn)丁醇的菌株及其應用

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