本發(fā)明具體涉及一種桑黃液體菌種培養(yǎng)的優(yōu)化方法。
背景技術(shù)：
：桑黃（phellinusigniarius），中藥名，由于通常生長(zhǎng)在桑屬（morusl.）植物上且子實(shí)體為黃褐色的緣故而得名，有“森林黃金”之美稱(chēng)。桑黃是一種大型珍貴的多年生藥用真菌，以子實(shí)體入藥，在我國(guó)，應(yīng)用桑黃治病從明朝開(kāi)始到至今已經(jīng)有2000多年的歷史了。在古代，民間就流傳有“桑樹(shù)生黃，幸得之，百病可醫(yī)”的說(shuō)法及“如果得到附生于桑樹(shù)上的黃色疙瘩（桑黃），死人也可復(fù)活”的傳說(shuō)。中醫(yī)認(rèn)為桑黃性寒、味微苦、味辛，歸肝、膀胱經(jīng)。本品辛行甘和，人血分以化瘀，瘀血循經(jīng)而行出血止，有化瘀之功效，能利五臟、軟堅(jiān)、排毒、止血、活血和胃止瀉等。民間用于治痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹?jié)?、瘡窟積聚、癖軟、脫肛瀉血、帶下、經(jīng)閉、脾虛泄瀉等。同時(shí)民間把它作為一種治療肝病、癌癥的絕藥。但是由于桑黃對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境、溫度、濕度要求極高，加之生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，極難發(fā)現(xiàn)，因而天然的桑黃數(shù)量非常稀少，貨源奇缺，價(jià)格昂貴。同時(shí)由于外商需求量大，經(jīng)濟(jì)效益高，致使各產(chǎn)地對(duì)桑黃進(jìn)行掠奪性開(kāi)采，野生子實(shí)體孢子無(wú)法形成。在我國(guó)東北地區(qū)該資源已經(jīng)難以恢復(fù)，西北也即將枯竭。再加上我國(guó)天然的桑黃數(shù)量本來(lái)就非常稀少，子實(shí)體的人工栽培尚處于起步階段，所以要想形成穩(wěn)定的醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)品來(lái)源，就必須充分挖掘桑黃的自然資源，深入開(kāi)展桑黃菌種的分離培養(yǎng)，以利于分離出生長(zhǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)、多糖產(chǎn)量高及其藥理作用好的桑黃菌種。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能有效促進(jìn)桑黃的菌絲的生長(zhǎng)的桑黃液體菌種培養(yǎng)優(yōu)化方法。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：配制液體培養(yǎng)培養(yǎng)基，配方為碳源、氮源、微量元素、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水。所述碳源選自葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉中的一種。所述氮源選自蛋白胨、酵母膏、奶粉、尿素、氯化銨中的一種。所述微量元素選自維生素b1、維生素b2、維生素b6、維生素b12中的一種。液體培養(yǎng)基的配制步驟具體如下：（1）計(jì)算：按照選定的培養(yǎng)基配方，計(jì)算各種成分的用量。（2）稱(chēng)量：將所有藥品按照計(jì)算準(zhǔn)確稱(chēng)量。（3）煮汁：量取1000ml的水用電磁爐燒開(kāi)然后按照易溶到不易溶的順序依次將藥品加入鍋中，用玻璃棒攪拌直至溶解。（4）分裝：將配制好的培養(yǎng)基分裝到500ml的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝150ml，用漏斗分裝避免培養(yǎng)基粘在三角瓶口壁上，如粘上則用紗布擦干凈否則易滋生雜菌。用封口膜封口，并貼上標(biāo)簽。（5）滅菌：放在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，在壓力為0.1-0.2mpa，溫度為121℃下，滅菌40min，待其壓力降至零時(shí)，打開(kāi)壓力鍋蓋取出三角瓶放置冷卻備用。液體培養(yǎng)基的接種步驟具體如下：（1）將已滅過(guò)菌的三角瓶、接種工具、酒精棉球、酒精燈、接種環(huán)等放人超凈工作臺(tái)中，開(kāi)啟紫外線燈照射30min，用70%的酒精對(duì)菌種培養(yǎng)皿進(jìn)行消毒，操作人員的手帶無(wú)粉乳膠手套并用70%酒精消毒，點(diǎn)燃酒精燈。（2）在酒精燈火焰無(wú)菌區(qū)范圍內(nèi)，將接種針和打孔器在酒精燈火焰上灼燒消毒，用打孔器在桑黃菌種平板表面進(jìn)行打孔。打孔時(shí)沿菌落最外緣向中間逐次打，邊緣的菌絲生長(zhǎng)能力比較旺盛。（3）接種：用消毒過(guò)的接種針挑1個(gè)菌餅塊，沿著三角瓶封口薄膜一側(cè)揭開(kāi)一條縫，通過(guò)酒精燈火焰的無(wú)菌區(qū)，將菌餅塊掉入三角瓶?jī)?nèi)，每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)接2塊的菌餅塊。放菌餅塊的時(shí)候不要接觸到瓶壁，避免污染。接種后將三角瓶移至19℃的恒溫振蕩搖床中靜止培養(yǎng)24h，后在恒溫為19℃轉(zhuǎn)速120r/min恒溫振蕩搖床繼續(xù)培養(yǎng)。利用本發(fā)明的優(yōu)化條件培養(yǎng)的菌種，生長(zhǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)、多糖產(chǎn)量高及其藥理作用好的桑黃菌種。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本實(shí)施例中桑黃液體菌種培養(yǎng)步驟如下：1、配制液體培養(yǎng)培養(yǎng)基。配方為可溶性淀粉20g，奶粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂1g，維生素b110mg，水1000ml。將液體培養(yǎng)基裝入500ml三角瓶中（120ml/瓶)，用2mol/l檸檬酸和1mol/lnaoh將培養(yǎng)基的ph值從自然調(diào)到2.2至6.2，然后放到高壓滅菌鍋內(nèi)，滅菌40min，取出備用，以測(cè)定不同的ph值對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響。配制步驟具體如下：（1）計(jì)算：按照選定的培養(yǎng)基配方，計(jì)算各種成分的用量。（2）稱(chēng)量：將所有藥品按照計(jì)算準(zhǔn)確稱(chēng)量。（3）煮汁：量取1000ml的水用電磁爐燒開(kāi)然后按照易溶到不易溶的順序依次將藥品加入鍋中，用玻璃棒攪拌直至溶解。（4）分裝：將配制好的培養(yǎng)基分裝到500ml的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝150ml，用漏斗分裝避免培養(yǎng)基粘在三角瓶口壁上，如粘上則用紗布擦干凈否則易滋生雜菌。用封口膜封口，并貼上標(biāo)簽。（5）滅菌：放在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，在壓力為0.1-0.2mpa，溫度為121℃下，滅菌40min，待其壓力降至零時(shí)，打開(kāi)壓力鍋蓋取出三角瓶放置冷卻備用。2、接種。（1）將已滅過(guò)菌的三角瓶、接種工具、酒精棉球、酒精燈、接種環(huán)等放人超凈工作臺(tái)中，開(kāi)啟紫外線燈照射30min，用70%的酒精對(duì)菌種培養(yǎng)皿進(jìn)行消毒，操作人員的手帶無(wú)粉乳膠手套并用70%酒精消毒，點(diǎn)燃酒精燈。（2）在酒精燈火焰無(wú)菌區(qū)范圍內(nèi)，將接種針和打孔器在酒精燈火焰上灼燒消毒，用打孔器在桑黃菌種平板表面進(jìn)行打孔。打孔時(shí)沿菌落最外緣向中間逐次打，邊緣的菌絲生長(zhǎng)能力比較旺盛。（3）接種：用消毒過(guò)的接種針挑1個(gè)菌餅塊，沿著三角瓶封口薄膜一側(cè)揭開(kāi)一條縫，通過(guò)酒精燈火焰的無(wú)菌區(qū)，將菌餅塊掉入三角瓶?jī)?nèi)，每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)接2塊的菌餅塊。放菌餅塊的時(shí)候不要接觸到瓶壁，避免污染。3、搖床培養(yǎng)。將三角瓶移至19℃的恒溫振蕩搖床中靜止培養(yǎng)24h，后在恒溫為19℃轉(zhuǎn)速120r/min恒溫振蕩搖床繼續(xù)培養(yǎng)。菌絲球直徑的測(cè)定從接種后48h開(kāi)始，以后每隔24h測(cè)定一次。每次測(cè)量取液均需要在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，取液時(shí)先用1ml移液槍槍頭移取3次，共取出3ml培養(yǎng)液放入墊有吸水紙的培養(yǎng)皿中，按1ml培養(yǎng)液含菌球大小的數(shù)量比隨機(jī)取十個(gè)菌絲球排成一行用游標(biāo)卡尺測(cè)總長(zhǎng)度，并計(jì)算出平均每個(gè)菌絲球的直徑。菌絲球密度的測(cè)定中，測(cè)量時(shí)間及取液方法和菌絲球直徑的測(cè)定步驟相同，取出3ml的培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中墊上彩色吸水紙便于觀察計(jì)數(shù)數(shù)出3ml培養(yǎng)液中的菌絲球個(gè)數(shù)并求出1ml培養(yǎng)液中的菌絲球個(gè)數(shù)。菌絲球重量的測(cè)定中，測(cè)量時(shí)間及取液方法和菌絲球直徑的測(cè)定步驟相同，取出3ml培養(yǎng)液放入墊有彩色吸水紙的培養(yǎng)皿中，用吸水紙把水分吸收掉用接種針隨機(jī)的挑出不同大小10個(gè)的菌絲球放到電子天平上測(cè)出總質(zhì)量，并求出每個(gè)菌絲球的重量。培養(yǎng)基ph采用如下方式測(cè)定：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，以無(wú)菌操作的方式用滅過(guò)菌的玻璃棒蘸取培養(yǎng)液置于ph試紙上然后對(duì)照比色卡讀出ph值并記錄。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明培養(yǎng)基中不同碳源下菌絲的生長(zhǎng)差異。培養(yǎng)基配方為碳源20g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂1g，維生素b110mg，水1000ml。碳元素是真菌最重要的營(yíng)養(yǎng)，它不僅是碳水化合物還是蛋白質(zhì)的基本組成元素，同時(shí)又是重要的能源來(lái)源。培養(yǎng)基中不同碳源菌絲的生長(zhǎng)明顯的差異如表1所示。（取培養(yǎng)第3天的菌絲球）表1不同碳源對(duì)桑黃液體菌絲生長(zhǎng)的影響從表1可以看出，以可溶性淀粉為碳源最好，并顯著高于葡萄糖，麥芽糖等其他碳源，菌絲球培養(yǎng)第4d菌絲密度稠密，可溶性淀粉的直徑最大達(dá)到1.72mm是直徑最小的葡萄糖的2倍，絲生長(zhǎng)量的大小依次可溶性淀粉>乳糖>麥芽糖>葡萄糖>蔗糖。實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明培養(yǎng)基中不同氮源下菌絲的生長(zhǎng)差異。培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g，氮源10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂1g，維生素b110mg，水1000ml。氮元素是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸的重要原料，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要。從表2可以看出，不氮源條件下桑黃菌絲的生長(zhǎng)有著明顯的差別（取培養(yǎng)第3天的菌絲）。表2不同氮源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)狀況的影響從表2可以看出奶粉，氯化銨和蛋白胨等有機(jī)氮為試驗(yàn)組菌絲球的密度稠密，菌絲球的直徑大小一致性高，菌絲狀況明顯好于酵母膏和尿素為無(wú)機(jī)氮源的試驗(yàn)組。從生長(zhǎng)量來(lái)看以奶粉為氮源的菌絲生長(zhǎng)速度最快菌絲直徑達(dá)到1.90mm，菌絲球重量21.30mg/個(gè)，菌絲球密度達(dá)到23.67個(gè)/ml，次之為蛋白胨和氯化銨。實(shí)施例4本實(shí)施例說(shuō)明培養(yǎng)基中不同微量元素下菌絲的生長(zhǎng)差異。培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂1g，微量元素10mg，水1000ml。維生素作為微量生長(zhǎng)因子對(duì)桑黃的生長(zhǎng)有著明顯的影響，從表3可以看出桑黃對(duì)不同的生長(zhǎng)因子利用率是有差異的（取培養(yǎng)第3天的菌絲）。表3不同生長(zhǎng)因子對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)狀況的影響桑黃菌絲體不能合成必要的維生素，適當(dāng)?shù)募尤胍恍﹙b系列的生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)從表3可以看出維生素b12對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)高于維生素b1等生長(zhǎng)因子。實(shí)施例5本實(shí)施例說(shuō)明培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)液初始ph值下菌絲的生長(zhǎng)差異。培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂1g，維生素b110mg，水1000ml。不同初始ph值對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)是有影響的它們之間的差異程度從表4可以看出（取培養(yǎng)第5天的菌絲）。表4不同初始ph值對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)狀況的影響編號(hào)ph值菌絲直徑（mm）菌絲球重量（mg/個(gè)）菌絲球密度（個(gè)/ml)培養(yǎng)液顏色12.2000乳白色22.60.681.103.67乳白色33.01.3614.9318.67乳白色43.20.8812.6712.67灰白色53.41.17227.00107.67粉紅色64.52.3133.184.20深紅色74.01.43126.80105.67粉紅色85.52.4247.5315.33深紅色96.01.5368.2022.00咖色106.21.271.830.67咖色從表4可以看出，初始ph值在3.4-6.0的范圍內(nèi)對(duì)桑黃的生長(zhǎng)沒(méi)有太大的影響，生長(zhǎng)速率高于其他ph值。在培養(yǎng)液ph值為3.4-4.5范圍內(nèi)時(shí)菌絲球的直徑與密度要其他的ph值范圍是要大一些，說(shuō)明桑黃子實(shí)體的形成與生長(zhǎng)多以弱酸性為宜，因此將培養(yǎng)液的ph值控制在3.4-4.5之間有利于菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)前第1頁(yè)12