本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術領域，尤其涉及一種用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的培養(yǎng)基及其應用。
背景技術：
丙酮酸(Pyruvic acid)，淺黃色至黃色透明液體，是生物體基本代謝中間產(chǎn)物之一，廣泛應用于食品添加劑、農(nóng)藥、醫(yī)藥等領域?？勺鳛榍绑w，酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、D/L-丙氨酸和L-二羥基苯丙氨酸等，同時在減肥、增強耐力、降低膽固醇等人類健康領域有應用潛力。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的研究開始于二十世紀90年代，日本、美國等國家在菌株選育、工程菌株構建、分離純化等方面開展了一系列的工作，我國的相關研究主要由江南大學和中國科學院微生物研究所、中國科學院過程工程研究所等單位開展，也取得了不錯的進展。
目前國內(nèi)外的研究集中在菌種篩選和構建，研究最多的是光滑球擬酵母(Torulopsis glabuata)和大腸桿菌(Escherichia coli)基因工程菌。無論是光滑球擬酵母還是大腸桿菌，在丙酮酸積累過程中均存在氧化還原力不平衡的問題。人們嘗試表達外源的NADH氧化酶來解決NADH過度積累的問題。從發(fā)酵結果來看，在一定程度上緩解了還原力積累的問題，提高了菌株的生長速率和生物量，同時提高了丙酮酸的濃度。
“華中農(nóng)業(yè)大學學報，2010，29(4)，527-532.”周景文等考察了采用氧化態(tài)更高的葡萄糖酸鈉部分代替葡萄糖對多重營養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母發(fā)酵的影響。與100g/L葡萄糖作為唯一碳源的對照組相比，在含有90g/L的葡萄糖培養(yǎng)基中添加10g/L的葡萄糖酸鈉，其細胞量、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生產(chǎn)強度分別提高了7.96％、13.04％和32.81％，胞內(nèi)的NAD+濃度提高了29.73％，NADH/NAD+比值下降了26.89％。但是此研究同時指出，葡萄糖酸鈉不能完全代替葡萄糖，否則細胞質(zhì)量濃度和丙酮酸產(chǎn)量都會明顯下降，且對于多重營養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母與大腸桿菌的代謝過程不盡相同，所以培養(yǎng)基也并不能直接適用于大腸桿菌。
中國科學院過程工程研究所通過調(diào)控脂肪酸代謝途徑，增強糖酵解途徑，降低TCA循環(huán)強度等手段，構建得到高產(chǎn)丙酮酸的大腸桿菌YP01和YP02。雖然在發(fā)酵過程中，可以得到較高的丙酮酸產(chǎn)量，但是仍存在發(fā)酵后期葡萄糖利用速率嚴重下降的問題。已有研究證明改變碳源可以改善多重營養(yǎng)缺陷型光滑球擬酵母的發(fā)酵過程，對于大腸桿菌而言，更適合丙酮酸發(fā)酵的碳源將是一種重要的研究方向。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術的不足及實際的需求，本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的培養(yǎng)基及其應用，所述培養(yǎng)基能夠降低雜酸產(chǎn)量，提高丙酮酸的產(chǎn)率及產(chǎn)量。
為達此目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
一方面，本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括碳源、氮源、磷源和無機鹽，所述碳源包括葡萄糖酸鈉，所述葡萄糖酸鈉占碳源的質(zhì)量比為80-100％。
本發(fā)明中，采用氧化態(tài)的葡萄糖酸鈉代替葡萄糖，降低胞內(nèi)NADH/NAD+比例，平衡胞內(nèi)還原力，降低雜酸產(chǎn)量，提高丙酮酸的產(chǎn)率及產(chǎn)量。
優(yōu)選地，所述碳源為葡萄糖酸鈉。
優(yōu)選地，所述氮源為酵母膏、蛋白胨、玉米漿、糖蜜、氨水、銨鹽或尿素中的任意一種或至少兩種的混合。
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的pH為6-8，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，優(yōu)選為6.5-7.5。
第二方面，本發(fā)明提供一種以如第一方面所述的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，包括如下步驟：以如第一方面所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌。
優(yōu)選地，所述大腸桿菌為E.coli YP01和/或E.coli YP02。
所述E.coli YP01的菌種保藏號為CGMCC No.10691，保藏時間2016.4.07，分類名：大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
所述E.coli YP02的菌種保藏號為CGMCC No.12463，保藏時間2016.5.18，分類名：大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
優(yōu)選地，所述大腸桿菌的接種量為0.1-10％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)溫度為35-39℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃或39℃，優(yōu)選為37℃。
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)時間為15-60h，例如可以是15h、16h、18h、20h、25h、28h、30h、35h、40h、45h、50h、55h或60h。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明針對產(chǎn)丙酮酸的大腸桿菌工程菌的代謝特點，采用氧化態(tài)的葡萄糖酸鈉代替葡萄糖，降低胞內(nèi)NADH/NAD+比例，平衡胞內(nèi)還原力，降低雜酸產(chǎn)量，提高丙酮酸的產(chǎn)率及產(chǎn)量；
(2)本發(fā)明中，大腸桿菌基因工程菌菌株YP01，在好氧條件下，利用無機鹽培養(yǎng)基發(fā)酵24小時，可將45g/L葡萄糖酸鈉轉化生成34g/L丙酮酸，轉化率達到0.76g/g葡萄糖酸鈉，相比與葡萄糖作為碳源，丙酮酸濃度有了明顯提高，α-酮戊二酸、富馬酸、檸檬酸等雜酸顯著降低。
附圖說明
圖1是本發(fā)明以葡萄糖和葡萄糖酸鈉為碳源的發(fā)酵過程對比圖。
具體實施方式
為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術手段及其效果，以下結合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。
實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實驗儀器：
安捷倫(1200型)高效液相色譜；
伯樂公司的Aminex HPX-87H有機酸分析柱分析；
所述E.coli YP01的菌種保藏號為CGMCC No.10691，保藏時間2016.4.07，分類名：大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
所述E.coli YP02的菌種保藏號為CGMCC No.12463，保藏時間2016.5.18，分類名：大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
實施例1大腸桿菌基因工程菌YP01以葡萄糖酸鈉為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸
種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含以下成分(除葡萄糖酸鈉外)：
大量元素(mmol/L)：(NH4)2HPO4 19.92，NH4H2PO4 7.56，KCl 2.00，MgSO4·7H2O 1.50；
微量元素(μmol/L)：FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，ZnCl2 2.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO3 1.21，MnCl2·4H2O 2.50；
以大腸桿菌基因工程菌株YP01生產(chǎn)丙酮酸，包括以下步驟：
(1)種子培養(yǎng)：在250mL三角瓶中加入種子培養(yǎng)基100mL，加入葡萄糖酸鈉0.5wt％，115℃滅菌30min，冷卻后將菌株YP01按照1％(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的條件下培養(yǎng)12小時得到種子液。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)：5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2L，121℃滅菌20min，添加已高溫滅菌的葡萄糖酸鈉母液，使發(fā)酵罐中葡萄糖酸鈉濃度為4.5wt％。將步驟1中種子按照5％(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的條件下培養(yǎng)24小時得到發(fā)酵液。
分析方法：使用高效液相色譜對發(fā)酵液中的成分進行定量分析，發(fā)酵液中的葡萄糖酸鈉和有機酸濃度測定采用Aminex HPX-87H有機酸分析柱分析。結果如圖1所示，對照組為以葡萄糖為碳源在同等條件下的發(fā)酵結果。
由圖1可以看出：大腸桿菌基因工程菌菌株YP01，在好氧條件下，利用無機鹽培養(yǎng)基發(fā)酵24小時，可將45g/L葡萄糖酸鈉轉化生成34g/L丙酮酸，轉化率達到0.76g/g葡萄糖酸鈉，相比與葡萄糖作為碳源，丙酮酸濃度有了明顯提高，同時，α-酮戊二酸、富馬酸、檸檬酸等雜酸顯著降低。
實施例2大腸桿菌基因工程菌YP01以葡萄糖酸鈉為主要碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸
種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含以下成分(除葡萄糖和葡萄糖酸鈉外)：
大量元素(mmol/L)：(NH4)2HPO4 19.92，NH4H2PO4 7.56，KCl 2.00，MgSO4·7H2O 1.50；
微量元素(μmol/l):FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，
ZnCl2 2.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO3 1.21，MnCl2·4H2O 2.50；
以大腸桿菌基因工程菌株YP01生產(chǎn)丙酮酸，包括以下步驟：
(1)種子培養(yǎng)：在250mL三角瓶中加入種子培養(yǎng)基100mL，加入葡萄糖酸鈉0.5wt％，115℃滅菌30min。冷卻后將菌株YP01按照1％(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的條件下培養(yǎng)12小時得到種子液。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)：5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2L，121℃滅菌20min，添加已高溫滅菌的葡萄糖和葡萄糖酸鈉的混合母液，其中葡萄糖和葡萄糖酸鈉的質(zhì)量比為1:4，使發(fā)酵罐中葡萄糖和葡萄糖酸鈉的總濃度為4.5wt％。將步驟1中種子按照5％(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的條件下培養(yǎng)24小時得到發(fā)酵液。
分析方法同實施例1。大腸桿菌基因工程菌菌株YP01在以葡萄糖和葡萄糖酸鈉為碳源時，利用無機鹽培養(yǎng)基發(fā)酵24小時，可生成32g/L丙酮酸。
實施例3大腸桿菌基因工程菌YP02以葡萄糖酸鈉為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸
種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含以下成分(除葡萄糖酸鈉外)：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L。
以大腸桿菌基因工程菌株YP02生產(chǎn)丙酮酸，包括以下步驟：
(1)種子培養(yǎng)：在250mL三角瓶中加入種子培養(yǎng)基100mL，加入葡萄糖酸鈉0.5wt％，115℃滅菌30min。冷卻后將菌株YP02按照1％(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在pH＝7.0、37℃和200rpm的條件下培養(yǎng)12小時得到種子液。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)：5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2L，121℃滅菌20min，添加已高溫滅菌的葡萄糖酸鈉母液，使發(fā)酵罐中葡萄糖酸鈉濃度為4.5wt％。將步驟1中種子按照5％(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH＝7.0、37℃和400rpm的條件下培養(yǎng)24小時得到發(fā)酵液。
分析方法同實施例1。大腸桿菌基因工程菌菌株YP01在以葡萄糖和葡萄糖酸鈉為碳源時，利用豐富培養(yǎng)基發(fā)酵24小時，生成38g/L丙酮酸。
申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。