本發(fā)明涉及干細胞神經(jīng)分化技術(shù)，尤其是涉及一種復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基，本發(fā)明還涉及采用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞成有較高存活水平的神經(jīng)元樣細胞的方法。

背景技術(shù)：

臨床上，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷會導(dǎo)致腦、脊部神經(jīng)細胞大量死亡，神經(jīng)功能永久缺失，且很難自我修復(fù)。鑒于目前快速提取神經(jīng)干細胞仍未有穩(wěn)定的解決方案，因此對其他來源的干細胞進行誘導(dǎo)以獲取數(shù)目穩(wěn)定、功能完備的神經(jīng)元樣細胞的策略被科學(xué)界寄予厚望。

較其他來源干細胞，臍帶間充質(zhì)干細胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcell,hucmsc)具有采集痛苦小、自我更新快、增殖能力強、無免疫排斥、無倫理爭議等特點。如何高效定向誘導(dǎo)hucmsc成神經(jīng)元樣細胞，對于神經(jīng)環(huán)路、突觸連接的重塑和恢復(fù)有巨大的臨床應(yīng)用價值。

細胞分化是一種動態(tài)、可逆的程序性重調(diào)，合適的誘導(dǎo)微環(huán)境可促進成神經(jīng)分化基因有序表達，啟動相關(guān)通路，導(dǎo)致msc跨系分化。現(xiàn)有神經(jīng)分化策略主要包括：抗氧化劑誘導(dǎo)、生長因子誘導(dǎo)、中藥誘導(dǎo)、細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)等方案。常用的分化方案雖能誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細胞產(chǎn)生，但仍有不足：（1）經(jīng)典的高濃度抗氧化劑，雖可短時間內(nèi)通過細胞骨架結(jié)構(gòu)肌動蛋白斷裂、收縮導(dǎo)致msc呈現(xiàn)錐樣末端膨大等特征，但亦伴隨著細胞存活數(shù)目少、效率有限、有致癌轉(zhuǎn)化風(fēng)險等諸多問題，這與誘導(dǎo)組分作用濃度、時間和固有細胞毒性關(guān)系緊密；學(xué)者hofstetter發(fā)現(xiàn)，mscs經(jīng)5mmβ-me誘導(dǎo)48小時后膜片鉗電生理檢測結(jié)果顯示出誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細胞沒有表達鈉、鉀電壓門控通道，不產(chǎn)生動作電位，屬不成熟的神經(jīng)元。（2）單一應(yīng)用細胞因子可通過靶源性改善神經(jīng)營養(yǎng)因子供給重建軸突，提高神經(jīng)元樣細胞存活，但誘導(dǎo)時間長、效率低。（3）學(xué)者姚曉黎認為，部分中藥誘導(dǎo)msc分化過程存在逆轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，誘導(dǎo)時間仍需摸索。（4）細胞共培養(yǎng)方案對實驗操作人員技術(shù)和環(huán)境要求高，后期細胞移植仍需流式篩選分離。因此，組分合理的誘導(dǎo)策略是決定轉(zhuǎn)歸效率的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有誘導(dǎo)組分或誘導(dǎo)策略存在的不足，提供一種組分合理、高效穩(wěn)定的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基，本發(fā)明還提供采用該培養(yǎng)基在較短時間內(nèi)將臍帶間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成存活水平較高的神經(jīng)元樣細胞的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括da、db、dc三種分化培養(yǎng)液，所述da、db、dc三種分化培養(yǎng)液的配制方法分別為：

da分化培養(yǎng)液是由每1000mldmem-lg培養(yǎng)基中添加40mlfbs和10μgbfgf組成，其中bfgf的終濃度達10ng/ml；

db分化培養(yǎng)液是由每1000ml的dmem-lg培養(yǎng)基中添加50mlcerebrolysin、4mgforskolin、5mginsulin、0.36mghydrocortisone、1.86gkcl、7gnacl、2.2gnahco3、190mgnah2po4、95mgmgcl2、222mgcacl2、1.8gd-glucose組成；其中各組分的終濃度達到5%cerebrolysin、10μmforskolin、5μg/mlinsulin、1μmhydrocortisone、2.5mmkcl、120mmnacl、26mmnahco3、1.25mmnah2po4、1mmmgcl2、2mmcacl2、10mmd-glucose；

dc分化培養(yǎng)液是由每1000ml的dmem-f12培養(yǎng)基中添加10μgbfgf、10μgegf、10ml100xn2、20ml50xb27、0.3gl-glutamine組成；其中各組分的終濃度達到：10ng/mlegf、10ng/mlbfgf、1xn2、1xb27、2mml-glutamine；

將da、db、dc三種分化培養(yǎng)液分別混勻并經(jīng)過濾除菌后分別保存待用。

采用本發(fā)明制備的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞成神經(jīng)元樣細胞的方法如下：

首先將臍帶間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)，當(dāng)匯聚度達到50%時，經(jīng)胰酶消化、離心收集細胞；并用dmem-lg培養(yǎng)基制備成細胞懸液后，調(diào)整細胞密度至2×10⁵ml^-1；然后接種、恒溫培養(yǎng)至臍帶間充質(zhì)干細胞至60%時，按三個階段進行分化誘導(dǎo)：首先采用da分化培養(yǎng)液對臍帶間充質(zhì)干細胞預(yù)誘導(dǎo)2天；然后采用db分化培養(yǎng)液分化誘導(dǎo)1天；最后采用dc分化培養(yǎng)液維持誘導(dǎo)1天；觀察誘導(dǎo)后的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)特征，檢測誘導(dǎo)后神經(jīng)分化相關(guān)基因mrna水平，檢測誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細胞神經(jīng)元遷移蛋白dcx、神經(jīng)元特異性烯醇化酶nse表達情況：dcx表達陽性者為神經(jīng)前體細胞,nse表達陽性者為神經(jīng)元樣細胞。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：將誘導(dǎo)過程分為三階段，每階段誘導(dǎo)時采用不同的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)時間短，誘導(dǎo)效率高，誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細胞存活穩(wěn)定，移植后無排斥。其核心成分為天然提取物、細胞生長提取物、腦脊液無機鹽緩沖體系,有效保證了其生物安全性。

在本發(fā)明復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，

cerebrolysin（腦活素）作為腦細胞激活劑，由動物腦蛋白水解后萃取，由于組成它的器官特異性游離氨基酸與正常腦組織恒定比例相似，且分子量低于10000，因此易透過血腦屏障，不具有抗原性。日本學(xué)者杉田之宏證明，每毫升大致相當(dāng)于每克腦蛋白中的氮物質(zhì)含量，能調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化代謝、控制腦特異性蛋白質(zhì)的降解；

forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激活劑）為天然二萜產(chǎn)物，可促進膜、細胞或組織制備液中腺苷酸環(huán)化酶camp含量上升，激活蛋白激酶a信號通路；

細胞因子bfgf\egf在誘導(dǎo)起始中發(fā)揮了有絲分裂原、神經(jīng)營養(yǎng)的作用；

胰島素（insulin）：在低糖環(huán)境下，胰島素或類胰島素能抑制bmp信號通路使干細胞分化為少突細胞，此過程或伴隨mtor信號通路的介導(dǎo)；

腦脊液緩沖體系（包含kcl、nacl、nahco3、nah2po4、mgcl2、cacl2、d-glucose組分）：ph范圍7.3~7.4之間，有效模擬神經(jīng)元樣細胞存活所需要的腦脊微環(huán)境，提高細胞存活率。

本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用包含“腦細胞激活劑+細胞因子+camp激活劑+激素+腦脊液緩沖體系”的神經(jīng)分化液db作為核心誘導(dǎo)組分，誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞4d后，nse陽性細胞表達率高于“化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合生長因子”的誘導(dǎo)方案（p<0.05），且dcx陽性細胞表達率低于經(jīng)典的誘導(dǎo)策略（p<0.05）。此外，體內(nèi)驗證表明采用復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞得到的神經(jīng)元樣細胞，對tbi小鼠神經(jīng)恢復(fù)有較好的效果，nse免疫熒光結(jié)果顯示：tbi小鼠腦片中人臍帶源分化的神經(jīng)元樣細胞存活穩(wěn)定，無移植排現(xiàn)象，安全性高。

附圖說明

圖1是人臍帶間充質(zhì)干細胞光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)照片（x100）。

圖2是人臍帶間充質(zhì)干細胞流式細胞鑒定結(jié)果。

圖3是采用本發(fā)明制備的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)hucmsc四天后，光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)照片（x200）。

圖4是采用本發(fā)明制備的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)hucmsc四天后，dcx、nse陽性細胞免疫熒光染色結(jié)果（x200）。

圖5是采用本發(fā)明制備的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)hucmsc四天后，ao/pi熒光染色結(jié)果（x200）。

圖6是采用本發(fā)明制備的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)hucmsc四天后，免疫組化檢測移植誘導(dǎo)細胞在腦損傷模型小鼠海馬中表達分布情況（x200）。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明做更加詳細的說明。其中采用的實驗方法，若無特別說明，均為常規(guī)方法；實驗所用的器具、儀器、試劑均可通過商業(yè)途徑獲得。

實施例1

本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是由da、db、dc三種分化培養(yǎng)液組成，da、db、dc三種分化培養(yǎng)液的配制方法如下：

da分化培養(yǎng)液：每1000ml的dmem-lg（hyclone,貨號：sh30021.01b）培養(yǎng)基中，按原料各自特性溶解添加40mlfbs（hyclone,貨號：sh30396.03）、10μgbfgf（peprotech,貨號：100-18b）；

db分化培養(yǎng)液：每1000mldmem-lg（hyclone,貨號：sh30021.01b）培養(yǎng)基中，按原料各自特性溶解添加50mlcerebrolysin（everneuropharmagmbh,貨號：h20100440）、4mgforskolin（amquar,貨號：ey0022）、5mginsulin（aladdin,貨號：i119752-15mg）、0.36mghydrocortisone（sigma,貨號：h0888）、1.86gkcl（sigma,貨號：p5405）、7gnacl（sigma,貨號：s5886）、2.2gnahco3（sigma,貨號：s5761）、190mgnah2po4（sigma,貨號：s5011）、95mgmgcl2（sigma,貨號：m4880）、222mgcacl2（sigma,貨號：c5670）、1.8gd-glucose（sigma,貨號：g7021）；

dc分化培養(yǎng)液：每1000ml的dmem-f12（hyclone,貨號：sh30023.01b）培養(yǎng)基中，按原料各自特性溶解添加10μgbfgf（peprotech,貨號：100-18b）、10μgegf（gibco,貨號：phg0311）、10ml100xn2（gibco,貨號：17502-048）、20ml50xb27（gibco,貨號：12657-029）、0.3gl-glutamine（sigma,貨號：g6392）。

實施例2

采用實施例1配制的復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞（huc-msc）向神經(jīng)元樣細胞分化，其具體步驟如下：

一、人臍帶間充質(zhì)干細胞（huc-msc）的分離、培養(yǎng)

采集人臍帶組織標本：臍帶組織必須來源于足月剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦志愿者，檢測傳染性相關(guān)指標均呈陰性。采集時,應(yīng)用75%酒精擦拭無菌50ml離心管外壁，去除血污后短時期內(nèi)預(yù)冷生理鹽水4度保存。

分離人臍帶組織標本：在生物安全柜內(nèi)，取新鮮臍帶標本兩段，每段5cm，用預(yù)冷生理鹽水沖洗3次、去除血污、洗消干凈。在含預(yù)冷的100u/ml青鏈霉素雙抗-pbs溶液的平皿中，用手術(shù)刀縱向沿臍靜脈和臍動脈中間劃開組織，使用無菌有齒鑷和止血鉗輕輕剔除臍帶表面薄膜、2條動脈和1條靜脈血管；沃頓膠(wj)組織用生理鹽水清洗干凈，剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，分散轉(zhuǎn)移到25cm2培養(yǎng)瓶中，加入3ml含有10%胎牛血清fbs、100u/ml青鏈霉素雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數(shù)5%的co2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。

原代細胞培養(yǎng)：在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)組織塊3d后，觀察組織塊的貼壁情況。當(dāng)組織塊貼壁良好時，則應(yīng)及時使用電子移液槍緩慢吸除舊培養(yǎng)液，每瓶重新添加5ml新鮮dmem-f12/fbs培養(yǎng)液覆蓋組織塊后，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；原代組織繼續(xù)培養(yǎng)3d后，使用電子移液槍緩慢吸除舊培養(yǎng)液，并及時添加5mldmem-f12/fbs新鮮培養(yǎng)液覆蓋組織塊后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；原代培養(yǎng)10d后，在倒置顯微鏡下可觀察到梭形的貼壁細胞從組織塊周圍爬出。在保持瓶口無菌環(huán)境的條件下，用電子移液槍更換培養(yǎng)基。此后，每隔2d后，更換5mldmem-f12/fbs新鮮細胞培養(yǎng)基1次；當(dāng)細胞密度為80～90%時，胰蛋白酶消化后傳代；

細胞傳代培養(yǎng)：用移液槍吸取少量新鮮培養(yǎng)基輕輕吹打組織塊，使其從瓶壁上脫落，繼而轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中。在舊培養(yǎng)瓶內(nèi)加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化5min；倒置顯微鏡下觀察到胞體回縮后，加入等體積的fbs液終止消化。轉(zhuǎn)移細胞懸液到15ml離心管中，1500rpm離心10min棄上清。然后，用1ml培養(yǎng)基將細胞沉淀重懸后，置于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并標記為p1細胞。傳代2次后，光學(xué)顯微鏡觀察對狀態(tài)良好的p3細胞進行形態(tài)學(xué)觀察：

沃頓膠組織培養(yǎng)7d后，有紡錘形細胞產(chǎn)生；貼壁后的huc-mscs呈現(xiàn)梭形或多角形，增殖匯合度達80%以上時，群落呈方向性、旋渦狀聚集，如圖1所示。

二、人臍帶間充質(zhì)干細胞（huc-msc）的細胞表面抗原檢測

取p3代huc-msc細胞用2.5g/l的胰酶消化離心后，預(yù)冷pbs潤洗重懸為1×10⁷ml^-1的單細胞懸液，分別加入5μlcd29-pe、cd44-fitc、cd90-fitc、hla-abc-fitc、cd34-apc、cd45-pe、hla-dr-pe單克隆抗體，4℃避光孵育30min，流式細胞儀檢測相應(yīng)細胞表面抗原。

結(jié)果顯示：cd29、cd44、cd90、hla-abc的表達率高于98%，且cd34、cd45、hla-dr表達率低于1%，即分離培養(yǎng)的細胞屬于人臍帶間充質(zhì)干細胞，如圖2所示。

三、人臍帶間充質(zhì)干細胞體外成神經(jīng)分化：

當(dāng)p3代huc-mscs匯聚度達50%時，2.5g/l胰酶消化、1500rpm離心10min收集細胞；用dmem-lg培養(yǎng)基制備細胞懸液，countess?自動細胞計數(shù)儀調(diào)整細胞密度為2×10⁵ml^-1，在放置細胞爬片的48孔板內(nèi)，每孔接種500μl，37℃、體積分數(shù)5%的co2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)huc-mscs細胞至60%時進行分化誘導(dǎo)。

體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞成神經(jīng)分化時，分組見表1：

表1中，抗氧化劑聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)方法為常規(guī)誘導(dǎo)方法，作為對比組。

抗氧化劑聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)組：預(yù)誘導(dǎo)2d后，短梭形的臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)變窄，細胞沒有脫壁現(xiàn)象；分化誘導(dǎo)1d后，胞體發(fā)生收縮現(xiàn)象、兩極伸展，可觀察到明顯的軸突結(jié)構(gòu)，部分細胞脫壁、死亡、漂?。痪S持分化1d后，胞體進一步發(fā)生收縮、變窄情況，且軸突結(jié)構(gòu)兩端出現(xiàn)分叉，有錐形神經(jīng)末端結(jié)構(gòu)形成。

本發(fā)明復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基組：采用分化培養(yǎng)液da預(yù)誘導(dǎo)2d后，臍帶間充質(zhì)干細胞由短梭狀變長，逐步形成長梭狀形態(tài)；采用分化培養(yǎng)液db分化誘導(dǎo)1d后，長梭狀的細胞胞體固縮，兩端進一步變窄，產(chǎn)生折光性良好的細長、網(wǎng)狀突觸結(jié)構(gòu)，很少有細胞漂浮、脫壁、死亡；采用分化培養(yǎng)液dc維持分化1d后，胞體折光性增強、突觸長度延展，臨近細胞間呈現(xiàn)網(wǎng)狀典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)，如圖3所示。

實施例3

對實施例2誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細胞進行鑒定

一、熒光定量pcr檢測誘導(dǎo)后神經(jīng)分化相關(guān)基因水平，具體方案如下：

1、提取誘導(dǎo)組細胞總rna，步驟如下：

1）分別收集狀態(tài)良好的誘導(dǎo)后的細胞，1000rpm離心，3-5min后去上清；將細胞沉淀中加入1mltrizol，迅速吹打后室溫靜置5min，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml無酶ep管中；

2）按200μl/管加入氯仿，上下顛倒ep管20s后，室溫靜置10min；

3）4℃、12000rpm離心15min后，將上清后移至新的1.5ml無酶ep管中，并等體積加入預(yù)冷的異丙醇，吹打均勻后置于4℃沉淀10min；

4）4℃、12000rpm離心15min后棄掉上清；然后用2ml75%乙醇洗滌沉淀；

5）4℃、10000rpm離心5min，用移液槍吸去大部分上清；

6）4℃、10000rpm離心5min，用移液槍輕輕吸盡上清；

7）室溫干燥后，當(dāng)rna基本透明時，按每管20μl加入rnase-freewater充分溶解，并用微量分光光度計測定所抽提rna的濃度。

2、qrt-pcr檢測基因的相對表達量，步驟如下：

1）按takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求合成cdna，各組反轉(zhuǎn)錄總rna約800ng；

2）去除基因組dna反應(yīng)：冰上配制好反應(yīng)混合液后，室溫靜止5min,反應(yīng)體系如下：

3）反轉(zhuǎn)錄合成cdna：冰上配制好反應(yīng)體系，按“37℃15min、85℃5s”的條件進行反應(yīng)后，4℃保存。反應(yīng)體系如下：

4）realtimepcr：使用appliedbiosystems7500fastreal-timepcr儀和takaraqrt-pcr反應(yīng)試劑盒，設(shè)gapdh為內(nèi)參，按“95℃5min，95℃30s，60℃34s，40個循環(huán)”的反應(yīng)條件檢測各組神經(jīng)分化相關(guān)基因dcx、nse、mash1、ngn1的mrna表達水平，反應(yīng)體系如下：

5）pcr完成后，采用比較ct法對實驗結(jié)果進行分析，目的基因的相對表達量等于2^-△△ct。本步驟引物序列見表2：

表2神經(jīng)分化相關(guān)基因dcx、nse、mash1、ngn1引物序列、退火溫度、片段長度

。

熒光定量pcr結(jié)果（見表3）：較正常組，本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)組和“抗氧化劑聯(lián)合細胞因子”誘導(dǎo)組神經(jīng)分化相關(guān)基因都有明顯升高（p<0.05）；與“抗氧化劑聯(lián)合細胞因子”誘導(dǎo)組相比，采用本發(fā)明復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基復(fù)合誘導(dǎo)的細胞中nse、mash1、ngn1的mrna表達量顯著上升，而dcx表達量降低（p<0.05）；

表3各誘導(dǎo)組hucmsc中dcx、nse、mash1、ngn1mrna表達量比較

注：“抗氧化劑聯(lián)合細胞因子”誘導(dǎo)組記作方案α，本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)組記作方案β；

*:與對照組相比，p＜0.01;#:與方案α相比，p＜0.05。

3、免疫熒光鑒定不同誘導(dǎo)方案神經(jīng)元遷移蛋白dcx、神經(jīng)元特異性烯醇化酶nse的表達情況：

1）用pbs漂洗不同分化方案誘導(dǎo)完畢后48孔板3遍，4%多聚甲醛于4℃過夜固定；

2）用0.2%tritonx-100室溫通透10min，pbs潤洗3次，每次10分鐘；

3）用5%bsa室溫封閉30min，分別加入鼠抗dcx單抗（稀釋比例1：50）、兔抗nse抗體（稀釋比例1：100稀釋），置于4℃孵育過夜（pbs替代一抗作陰性對照）；

4）次日，用pbs漂洗3次，每次10min，各組分別按200μl/孔加入fitc標記羊抗鼠或羊抗兔igg二抗，室溫避光孵育1h；

5）pbs潤洗3次，加dapi染色，封片，倒置熒光顯微鏡上鏡觀察，計數(shù)。

免疫熒光結(jié)果顯示（見表4）：采用“抗氧化劑聯(lián)合細胞因子”誘導(dǎo)臍帶間誘導(dǎo)4d后，dcx、nse陽性表達率分別為(73.7±2.522)%、(40.7±0.419)%，向神經(jīng)元前體細胞分化更顯著；采用本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)細胞中dcx、nse陽性表達率分別為：(42.5±0.825)%、(87.7±0.061)%，向神經(jīng)元樣細胞增加明顯，如圖4所示，具有統(tǒng)計學(xué)意義；

表4各組細胞中dcx、nse陽性細胞率比較（%）

注：“抗氧化劑聯(lián)合細胞因子”誘導(dǎo)組記作方案α，本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)組記作方案β；

*：與對照組相比，p＜0.01;#：與方案α相比，p＜0.05。

4、live-dead檢測本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)后細胞存活情況：

1）分化誘導(dǎo)完成后，更換48孔板中培養(yǎng)液；

2）ao/pi熒光染色：稀釋ao、pi原液至100μg/ml，將其與dmem/f12培養(yǎng)基按1:50體積比配制混合染色液；

3）棄孔板舊液，加入500μl混合染色液，室溫孵育5~10min，倒置熒光顯微鏡觀察細胞存活。

ao/pi熒光染色顯示：經(jīng)本發(fā)明復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)4d后，存活的細胞較多（綠色），死亡的細胞較少（紅色），且形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)出交錯的突觸結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元樣細胞特征明顯，如圖5所示。

二、免疫組化檢測移植人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)細胞后腦損傷小鼠海馬部位存活情況：

選用10只c57bl/6j小鼠飼養(yǎng)一周后制作腦損傷小鼠模型。造模前，更換墊料1次，并禁食禁水24h，所涉及的動物操作程序符合動物保護與倫理要求。所有實驗動物均購自市場商業(yè)化的實驗動物技術(shù)有限公司。

1、腦損傷動物模型制作：

采用自由落體腦皮質(zhì)損傷模型，步驟如下：

1）術(shù)前10%水合氯醛按0.04ml/10g對小鼠給予麻醉后，頭部備皮、消毒；

2）腦立體定位儀上俯臥位固定小鼠，校零各軸讀數(shù)，確保小鼠頭部水平；

3）用手術(shù)刀沿腦中線縱切5cm開口，鈍性分離皮下組織、暴露顱骨。在前囪后1.5mm、中線旁側(cè)1.5mm處環(huán)鉆開3mm直徑骨窗，保證硬腦膜完好；

4）立體定位儀上，距骨窗20cm高度釋放20g撞針（直徑2mm）制作2mm深度腦損傷模型。

2、側(cè)腦室移植誘導(dǎo)分化的細胞:

1）牙科鉆在前囟后2mm、旁開1.5mm處建立直徑1mm小孔；

2）腦立體定位儀上，5min內(nèi)用微量注射針在左側(cè)腦室（前囟后2mm、旁開1.5mm、深度2mm）移植5×10⁴個細胞，留針5min后，緩慢撥出，消毒縫合。

3、小鼠腦切片制備：

1）腦損傷細胞移植小鼠飼喂28d后，麻醉開胸剪開右心耳，用頭皮針在左心室內(nèi)升主動脈方向灌注分別20ml預(yù)冷0.01mpbs、4%多聚甲醛溶液，肝臟變白后取腦；

2）新鮮腦組織4%多聚甲醛溶液固定24h，梯度蔗糖脫水72h；

3）oct包埋，冰凍切片機制作20μm切片。

4、免疫組化檢測移植誘導(dǎo)細胞在腦損傷模型小鼠海馬中表達分布情況:

1）冰凍切片室復(fù)溫30min，pbs漂洗3遍，每次5min;

2）微波爐中0.01m枸櫞酸緩沖抗原修復(fù)20min，室溫冷卻后pbst清洗10min，重復(fù)3次；

3）1%triton-100室溫通透30min，pbst清洗10min，重復(fù)3次；置于3%h2o2室溫孵育30min后，pbst清洗10min，重復(fù)3次；

4）室溫下，10%山羊血清封閉90min，洗去封閉液；4℃過夜孵育mab1281一抗后，復(fù)溫30min，pbst清洗3次，每次10min；

5）滴加與一抗對應(yīng)的稀釋后的二抗，37℃孵育1-2h，pbst清洗10min，重復(fù)3次；

6）dab染色后，蒸餾水潤洗；蘇木素復(fù)染后，、pbs清洗后，脫水透明，封片觀察。

采用spss17.0進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)用表示，組間數(shù)據(jù)用檢測，多組數(shù)據(jù)采用方差分析，檢驗水準α=0.05。

免疫組化染色結(jié)果顯示：正常小鼠海馬組織內(nèi)中，沒有陽性染色出現(xiàn)。而在移植本發(fā)明中復(fù)合誘導(dǎo)的細胞組，腦損傷小鼠海馬組織內(nèi)存在數(shù)目較多的被mab1281抗體結(jié)合、著色統(tǒng)一、胞漿呈棕黃色的細胞顆粒，即顯示其為經(jīng)本發(fā)明的復(fù)合誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細胞可以有效遷移到損傷部位進行神經(jīng)修復(fù)，且移植小鼠30d內(nèi)無死亡，如圖6所示。