本發(fā)明屬于動物細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化的CBH培養(yǎng)基及其分化方法。

背景技術(shù)：

脂肪過度沉積是現(xiàn)代肉雞產(chǎn)業(yè)面臨的主要難題之一，而脂肪含量的增加來源于脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大。多能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向以及前脂肪細(xì)胞的增殖均可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加，前脂肪細(xì)胞的分化則可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞體積的增大。前脂肪細(xì)胞分化這一生物學(xué)過程已在哺乳動物前脂肪細(xì)胞系3T3-L1和3T3-F442A中被廣泛研究。許多轉(zhuǎn)錄因子參與哺乳動物前脂肪細(xì)胞分化，其中最重要的轉(zhuǎn)錄因子是過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ。PPARγ是配體依賴型受體，研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ的配體(或稱激動劑)羅格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、吲哚美辛(indomethacin)參與調(diào)控哺乳動物前脂肪細(xì)胞的分化和脂類代謝。由于鳥類和哺乳動物在脂肪生成的調(diào)控上存在差異，因此，研究雞前脂肪細(xì)胞分化的生理特點(diǎn)和分子事件不僅能夠幫助我們了解不同物種間脂肪細(xì)胞發(fā)育的異同，還可為深入研究肉雞脂肪沉積奠定分子基礎(chǔ)。

前脂肪細(xì)胞分化產(chǎn)生具有功能的成熟脂肪細(xì)胞，成熟脂肪細(xì)胞具有以下特性：脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)水平增加、脂肪合成酶活性增加、脂滴沉積增加。在哺乳動物中，激素混合物(hormone cocktail)被廣泛用來誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化，其成分包括胰島素(insulin，INS)、地塞米松(dexamethasone，DEX)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)，但激素混合物不能誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化。油酸能夠誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化，但研究表明，油酸誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞在功能上具有有缺陷性。雖然單獨(dú)的激素混合物不能誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化，但我們?nèi)孕柙O(shè)法在激素混合物中添加某種物質(zhì)來嘗試將雞前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有功能的成熟脂肪細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在激素混合物中添加PPARβ/δ激動劑GW501516不能促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞中aP2的表達(dá)水平，但在激素混合物中同時(shí)添加PPARβ/δ激動劑GW501516和PPARγ激動劑曲格列酮能夠促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞中aP2的表達(dá)水平及3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)的活性，但不能促進(jìn)脂滴沉積，因此，使用該方法誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞在功能上仍有缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化的CBH培養(yǎng)基及其分化方法。

一種誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化的CBH培養(yǎng)基，現(xiàn)有生長培養(yǎng)基配方為：體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12，其特征在于，在現(xiàn)有生長培養(yǎng)基中加入如下成分：20μg/mL牛胰島素，1μM地塞米松，0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤及5μM羅格列酮。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

采用如上所述的CBH培養(yǎng)基得出的一種誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化方法如下：

(1)分離培養(yǎng)雞原代前脂肪細(xì)胞；

(2)當(dāng)雞前脂肪細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中達(dá)到50％匯合時(shí)，將細(xì)胞分為對照組和誘導(dǎo)組；對照組仍然使用生長培養(yǎng)基，而誘導(dǎo)組將生長培養(yǎng)基更換為CBH培養(yǎng)基；

(3)誘導(dǎo)組和對照組每天更換一次新鮮的培養(yǎng)基，總共誘導(dǎo)6天。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明證明CBH培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化，包括促進(jìn)前脂肪細(xì)胞中脂滴的沉積(P<0.01)、GPDH的活性(P<0.01)以及aP2(P<0.01)、G0S2(P<0.01)、PPARγ(P<0.01)mRNA的表達(dá)水平，本發(fā)明中誘導(dǎo)組細(xì)胞中脂滴沉積、GPDH活性、aP2、G0S2、PPARγmRNA表達(dá)水平均極顯著高于對照組。本發(fā)明所提供的方法具有操作簡單、費(fèi)用低的特點(diǎn)，是一種有效的誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化的方法，為雞前脂肪細(xì)胞的分化的研究奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為對照組與誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)的比較。

圖2為對照組與誘導(dǎo)組細(xì)胞中脂滴沉積的比較。

圖3為對照組與誘導(dǎo)組細(xì)胞中GPDH活性的比較。

圖4為對照組與誘導(dǎo)組細(xì)胞中aP2、G0S2、PPARγmRNA表達(dá)水平的比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

雞原代前脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取10日齡商品AA肉仔雞，無菌采取腹部脂肪組織，放入裝有PBS(含青霉素100units/mL和鏈霉素100μg/mL)的平皿中，反復(fù)沖洗，盡可能去除筋膜和血管，然后用眼科剪剪碎組織，之后在2mg/mL的Ⅰ型膠原酶中，于37℃消化65min(每5min震蕩一次)。消化完畢后，加入生長培養(yǎng)基(體積數(shù)10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12)終止消化，移液器吹打，分別經(jīng)100目和600目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾。濾液分裝入15mL離心管，2000r/m離心10min，除去培養(yǎng)液，用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，室溫孵育10min，2000r/m離心10min，細(xì)胞沉淀用生長培養(yǎng)基重懸，2000r/m離心10min，再用生長培養(yǎng)基重懸后的細(xì)胞懸液就是基質(zhì)-血管(S-V)細(xì)胞，即前脂肪細(xì)胞。將分離的前脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按1×10⁴個/mL的密度將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)施例2

雞原代前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

當(dāng)雞前脂肪細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中達(dá)到50％匯合時(shí)，將細(xì)胞分為2組(對照組和誘導(dǎo)組)，對照組仍然使用生長培養(yǎng)基，而誘導(dǎo)組將生長培養(yǎng)基更換為CBH培養(yǎng)基。對照組和誘導(dǎo)組每天更換一次新鮮的生長培養(yǎng)基和CBH培養(yǎng)基，總共誘導(dǎo)6天?，F(xiàn)有生長培養(yǎng)基配方為：體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12

誘導(dǎo)培養(yǎng)基含激素混合物：20μg/mL牛胰島素，1μM地塞米松，0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤及5μM羅格列酮。

實(shí)施例3

脂滴沉積效果的比較

棄去實(shí)施例2中所述培養(yǎng)基，經(jīng)PBS洗3次，10％的福爾馬林固定30min，PBS洗3次，蒸餾水洗3次，32℃干燥，1％油紅O染液染色40min，PBS洗3次，100％異丙醇溶解細(xì)胞中的油紅O 15min，酶標(biāo)儀510nm記錄光吸收值，用細(xì)胞數(shù)量校正結(jié)果。

誘導(dǎo)6天后，利用倒置顯微鏡觀察對照組與誘導(dǎo)組的細(xì)胞形態(tài)，如圖1所示，可見誘導(dǎo)組細(xì)胞中沉積大量脂滴，而對照組細(xì)胞中幾乎沒有脂滴。如圖2所示，油紅O提取比色結(jié)果表明，誘導(dǎo)組細(xì)胞中脂滴的沉積顯著多于對照組細(xì)胞(P<0.01)。

實(shí)施例4

3-磷酸甘油脫氫酶(GPDH)活性檢測

棄去實(shí)施例2中所述培養(yǎng)基，經(jīng)PBS洗3次，按照GPDH Activity Assay Kit說明書檢測細(xì)胞中GPDH的活性，用蛋白含量校正結(jié)果。

誘導(dǎo)6天后，如圖3所示，GPDH活性分析結(jié)果表明，誘導(dǎo)組細(xì)胞中GPDH的活性顯著高于對照組細(xì)胞(P<0.01)。

實(shí)施例5

脂肪生成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的比較

1、引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)雞β-actin、aP2、G0S2、PPARγ基因CDS區(qū)設(shè)計(jì)Real-time qRT-PCR引物：

β-actin-F:5’-TCTTGGGTATGGAGTCCTG-3’

β-actin-R:5’-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3’；

aP2-F:5’-ATGTGCGACCAGTTTGT-3’

aP2-R:5’-TCACCATTGATGCTGATAG-3’

G0S2-F:5’-CTCAGCCAGAAGCCCAAC-3’

G0S2-R:5’-CCAACACCAAATCCTCCC-3’

PPARγ-F:5’-GTGCAATCAAAATGGAGCC-3’

PPARγ-R:5’-CTTACAACCTTCACATGCAT-3’

2、RNA提取及Real-time qRT-PCR

棄去實(shí)施例2中所述培養(yǎng)基，經(jīng)PBS洗3次，按照Trizol reagent說明書提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)定量RNA濃度，按照ImProm-II Reverse Transcriptase說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照FastStart Universal SYBR Green Master kit說明書進(jìn)行Real-time qRT-PCR。PCR反應(yīng)體系為10μL，其中cDNA模板1μL，PCR反應(yīng)條件為：95℃變性10min，95℃退火15s，60℃延伸1min，共40個循環(huán)。

以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2^–ΔCT法計(jì)算脂肪生成相關(guān)基因aP2、G0S2、PPARγ的相對表達(dá)水平。

如圖4所示，Real-time qRT-PCR結(jié)果表明，誘導(dǎo)組細(xì)胞中aP2、G0S2、PPARγmRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組細(xì)胞(P<0.01)。

以上結(jié)果表明，CBH培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)雞前脂肪細(xì)胞分化。