本發(fā)明屬于細(xì)胞模型的構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種高尿酸血癥肝細(xì)胞(LO2)模型及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù):
尿酸是內(nèi)源性嘌呤和飲食中嘌呤的代謝產(chǎn)物。在人體嘌呤代謝過(guò)程中,ATP等經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng),生成次黃嘌呤和黃嘌呤,在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸。當(dāng)嘌呤代謝紊亂時(shí),人體內(nèi)尿酸含量會(huì)升高,一般認(rèn)為血尿酸鹽水平≥417 μmol/L時(shí),會(huì)誘發(fā)高尿酸血癥。近年來(lái),高尿酸血癥發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡呈低齡化,同時(shí)高尿酸血癥與高血壓、高血脂、糖尿病等密切相關(guān),所以高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制及抗痛風(fēng)藥物的研究正成為醫(yī)藥界熱點(diǎn)。
目前臨床上常用的治療痛風(fēng)的藥物根據(jù)其作用機(jī)制可分為抑制尿酸生成的藥物和促進(jìn)尿酸排泄的藥物。抑制尿酸生成的藥物(如別嘌呤醇)大多是通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性來(lái)抑制次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸,從而減少尿酸的生成。促進(jìn)尿酸排泄的藥物常見的有丙磺舒和苯溴馬隆。這些藥物雖然能有效降低人體內(nèi)尿酸含量,但是對(duì)人的毒副作用也較大,對(duì)肝腎有一定的損傷,在一定程度上限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。因此,臨床上迫切需要新型的高效低毒且適用性更廣的降尿酸藥物,而構(gòu)建高尿酸血癥模型是研究高尿酸血癥的前提。目前國(guó)內(nèi)外均采用高尿酸血癥動(dòng)物模型來(lái)篩選降尿酸藥物及研究其作用機(jī)制。
專利申請(qǐng)公開號(hào)為CN1698906的專利公開了“大鼠急性或持續(xù)性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法”,公開日期為2005-11-23,申請(qǐng)人為南京中醫(yī)藥大學(xué)。該方法是將SD、Wistar健康大鼠用灌胃、皮下注射和腹腔注射的方式,同時(shí)給予100-2000 mg/kg嘌呤類(次黃嘌呤、黃嘌呤)和5-1000 mg/kg尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀),每隔5-24 h,用同樣方式和藥物用量對(duì)大鼠用藥,持續(xù)一周至兩周,可獲得穩(wěn)定的急性或持續(xù)性大鼠高尿酸血癥模型。
專利申請(qǐng)公開號(hào)為CN1698907的專利公開了“小鼠急性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法”,公開日期為2005-11-23,申請(qǐng)人為南京中醫(yī)藥大學(xué)。該專利是將昆明種、ICR健康小鼠用灌胃、皮下注射或腹腔注射的方式,對(duì)小鼠給予次黃嘌呤或黃嘌呤100-1500 mg/kg和尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀10-1500 mg/kg,實(shí)驗(yàn)證明使用尿酸酶抑制劑配合嘌呤類,1小時(shí)即可獲得穩(wěn)定的小鼠高尿酸血癥模型。
專利申請(qǐng)公開號(hào)為CN103977007A的專利公開了“急性高尿酸血癥樹鼩模型的構(gòu)建方法”,公開日期為2014-08-13,申請(qǐng)人為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所。該專利是將1-3歲的成年健康樹鼩腹腔注射氧嗪酸鉀混懸液,用量按樹鼩體重為40 mg/kg-100 mg/kg,可得到急性高尿酸血癥樹鼩模型。
專利申請(qǐng)公開號(hào)為CN104388467A的專利公開了“一種構(gòu)建自發(fā)性高尿酸血癥模型的方法及其用途”,公開日期為2015-03-04,申請(qǐng)人為李長(zhǎng)貴。該專利是利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶敲除基因敲除目的小鼠的尿酸氧化酶基因即得到自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型,小鼠存活時(shí)間長(zhǎng),利于對(duì)該類小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。
專利申請(qǐng)公開號(hào)為103860562A的專利公開了“一種建立高尿酸血癥動(dòng)物模型的藥物組合物及其應(yīng)用”,公開日期為2014-06-18,申請(qǐng)人為曾文等。該專利采用乙胺丁醇和尿酸造模,造模動(dòng)物為恒河猴,造模時(shí)間短,模型穩(wěn)定,成功率高,可獲得穩(wěn)定、可靠的急性高尿酸血癥模型。
綜上所述,目前關(guān)于高尿酸血癥的研究多以動(dòng)物模型為基礎(chǔ),通過(guò)注射嘌呤類、尿酸酶抑制劑等方法構(gòu)建高尿酸血癥模型。但是現(xiàn)存的動(dòng)物模型也有許多不完善的地方,如操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),給痛風(fēng)研究帶來(lái)了極大的不便,并且常用的造模動(dòng)物如小鼠、大鼠等雖與人類同屬哺乳動(dòng)物,但分類地位相差較遠(yuǎn),屬于低等嚙齒類動(dòng)物,解剖和生理與人相差較遠(yuǎn),其動(dòng)物模型得到的數(shù)據(jù)參考性也有一定的局限性。
肝臟是嘌呤代謝生成尿酸的主要場(chǎng)所,選擇肝細(xì)胞(LO2)為造模細(xì)胞,構(gòu)建高尿酸血癥細(xì)胞模型,可用于降尿酸藥物的快速篩選,相對(duì)于動(dòng)物模型操作較簡(jiǎn)單,耗時(shí)較短,效率高。
在本申請(qǐng)?zhí)岢鲋?,尚未見有利用肝?xì)胞建立高尿酸血癥模型的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
鑒于現(xiàn)在對(duì)快速篩選降尿酸藥物的高尿酸血癥模型開發(fā)的需求,本發(fā)明以肝細(xì)胞為造模細(xì)胞,提供了一種高尿酸血癥肝細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法。
一種高尿酸血癥肝細(xì)胞模型的構(gòu)建方法,包括如下步驟:
(1)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞(LO2),經(jīng)消化后,制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞懸液稀釋,混勻,加入孔板中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)鋪板12-24 h后,取出孔板,棄去細(xì)胞上清液,清洗,加入誘導(dǎo)物腺苷,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12-24 h;
(3)從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出孔板,加入黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12-24 h,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型;采用反向高效液相測(cè)定尿酸的含量。
進(jìn)一步地,步驟(1)中所述消化采用胰蛋白酶進(jìn)行消化;采用吸管吹打瓶壁細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液。
進(jìn)一步地,步驟(1)中,細(xì)胞懸液稀釋后,細(xì)胞的濃度為104-106個(gè)/mL,優(yōu)選為106個(gè)/mL。
進(jìn)一步地,步驟(2)中所述清洗指采用聚丁二酸丁二醇酯(PBS)清洗2-3次。
進(jìn)一步地,步驟(2)中所述腺苷的用量為0.5-2 mmol/L,優(yōu)選為1.5 mmol/L;腺苷以腺苷溶液的形式加入,腺苷溶液是以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成,現(xiàn)配現(xiàn)用,使用時(shí)混勻。
進(jìn)一步地,步驟(3)中,加入黃嘌呤氧化酶為每孔加入0.2-0.4 IU黃嘌呤氧化酶,優(yōu)選為每孔加入0.3 IU黃嘌呤氧化酶。
由上述任一項(xiàng)所述制備方法制得的高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
(1)本發(fā)明首次利用肝細(xì)胞(LO2)建立了高尿酸血癥細(xì)胞模型,操作簡(jiǎn)單,有效、簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好、耗時(shí)較短。
(2)通過(guò)建立高尿酸血癥細(xì)胞模型,可用于篩選和研制降尿酸藥物,對(duì)評(píng)價(jià)相關(guān)抗高尿酸藥物對(duì)該病的藥效及作用機(jī)理具有十分重要的意義。
附圖說(shuō)明
圖1為尿酸代謝途徑示意圖;
圖2為尿酸標(biāo)曲;
圖3為實(shí)施例1中空白對(duì)照組和模型組細(xì)胞液高效液相圖;
圖4為不同實(shí)施例的模型組細(xì)胞上清液中尿酸濃度示意圖;
圖5為實(shí)施6中空白對(duì)照組、模型組及陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞上清液中尿酸的濃度示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施方式及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
下述實(shí)施方式中所使用的實(shí)驗(yàn)方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。
下述方式中所使用的材料試劑等,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為商業(yè)途徑得到。
1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:肝細(xì)胞LO2,來(lái)自廣中醫(yī)藥大學(xué)
2.造模藥物:腺苷,購(gòu)自廣州碩恒生物科技有限公司
3.實(shí)驗(yàn)儀器:高效液相色譜,購(gòu)自日本島津公司
肝細(xì)胞LO2用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并加入10 wt%的胎牛血清,1 wt%雙抗,放入37 °C、5%(V/V) CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
圖1為尿酸代謝途徑,從圖1可知腺苷可在腺苷脫氨酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用下生成次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤,接著在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤和尿酸。
圖2為尿酸標(biāo)曲,尿酸生成量可根據(jù)圖2尿酸標(biāo)曲進(jìn)行定量。
實(shí)施例1
一種高尿酸血癥肝細(xì)胞模型的構(gòu)建:本實(shí)驗(yàn)設(shè)為空白對(duì)照組和模型組。
模型組:(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后,吸管吹打制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,通過(guò)稀釋將細(xì)胞濃度調(diào)整為104個(gè)/mL,混勻,接種于24孔板中,置于37 °C、5%(V/V)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)12 h后,取出24孔板,棄去細(xì)胞上清液,PBS清洗2次,加入現(xiàn)配的以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成的腺苷溶液,腺苷的用量為0.5 mmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12 h;
(3)取出24孔板,每孔加入0.2 IU黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12 h后,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
空白對(duì)照組:加入培養(yǎng)基,不加腺苷溶液,其余與模型組一樣。
取出細(xì)胞上清液,高效液相分析其尿酸含量,高效液相圖和尿酸含量圖分別如圖3和圖4所示。
從圖3可知空白對(duì)照組未生成尿酸,模型組有尿酸生成,進(jìn)一步驗(yàn)證了圖1中腺苷可經(jīng)過(guò)一系列酶的作用最終生成尿酸。
實(shí)施例2
一種高尿酸血癥細(xì)胞模型的構(gòu)建:
(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,吸管吹打制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞密度稀釋為105個(gè)/mL,混勻,接種于24孔板中,置于37 °C、5%(V/V)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)12 h后,取出24孔板,棄去細(xì)胞上清液,PBS清洗3次后,加入現(xiàn)配的以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成的腺苷溶液,腺苷的用量為1 mmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育18 h;
(3)取出24孔板,每孔加入0.2 IU黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12 h后,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
取出細(xì)胞上清液,高效液相分析其尿酸含量,結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施例3
一種高尿酸血癥細(xì)胞模型的構(gòu)建:
(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,吸管吹打制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞密度稀釋為105個(gè)/mL,混勻,接種于24孔板中,置于37 °C、5%(V/V)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)12 h后,棄去細(xì)胞上清液,PBS清洗2次后,加入現(xiàn)配的以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成的腺苷溶液,腺苷的用量為1 mmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h;
(3)取出24板孔,每孔加入0.3 IU黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育18 h后,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
取出細(xì)胞上清液,高效液相分析其尿酸含量,結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施例4
一種高尿酸血癥細(xì)胞模型的構(gòu)建:
(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,吸管吹打制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞密度稀釋為106個(gè)/mL,混勻,接種于24孔板中,置于37 °C、5%(V/V)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)18 h后,棄去細(xì)胞上清液,PBS清洗3次后,加入現(xiàn)配的以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成的腺苷溶液,腺苷的用量為1.5 mmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h;
(3)取出24板孔,每孔加入0.3 IU黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
取出細(xì)胞上清液,高效液相分析其尿酸含量,結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施例5
一種高尿酸血癥細(xì)胞模型的構(gòu)建:
(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,吸管吹打制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞密度稀釋為106個(gè)/mL,混勻,接種于24孔板中,置于37 °C、5%(V/V)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)24 h后,取出24板孔,棄去細(xì)胞上清液,PBS清洗3次后,加入現(xiàn)配的以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成的腺苷溶液,腺苷的用量為2 mmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h;
(3)取出24板孔,每孔加入0.4 IU黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
取出細(xì)胞上清液,高效液相分析其尿酸含量,結(jié)果如圖4所示。
由圖4可知,模型組均產(chǎn)生尿酸。由實(shí)施例1和實(shí)施例2可知,隨著細(xì)胞鋪板密度和誘導(dǎo)物腺苷孵育時(shí)間的延長(zhǎng),尿酸生成量顯著增加;由實(shí)施例2和實(shí)施例3可知,誘導(dǎo)物腺苷孵育時(shí)間和黃嘌呤氧化酶添加后孵育時(shí)間延長(zhǎng),生成尿酸含量增加;由實(shí)施例3、實(shí)施例4和實(shí)施例5可知,雖然隨著誘導(dǎo)物腺苷濃度的增加,模型組產(chǎn)生的尿酸含量也增加,但當(dāng)腺苷濃度增加到1.5 mmol/L時(shí),再繼續(xù)加大誘導(dǎo)物腺苷的濃度,尿酸含量無(wú)顯著增加,是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間和細(xì)胞密度下,腺苷的轉(zhuǎn)化量一定,故最終生成的尿酸含量無(wú)顯著增加。
結(jié)合圖3、圖4可知,高尿酸血癥肝細(xì)胞模型造模成功。
實(shí)施例6
實(shí)驗(yàn)設(shè)為空白對(duì)照組、模型組及陽(yáng)性對(duì)照組。
模型組:(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后,吸管吹打制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞密度稀釋為106個(gè)/mL,混勻,接種于24孔板中,每孔1 mL,置于37 °C、5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(2)18 h后,取出24孔板,棄去孔板中的細(xì)胞上清液,加PBS清洗3次,所有孔均加入現(xiàn)配的以不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶劑配制而成的腺苷溶液,腺苷的用量為1.5 mmol/L,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;
(3)取出板孔,每孔加入0.3 IU黃嘌呤氧化酶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h,即得到高尿酸血癥肝細(xì)胞模型。
空白對(duì)照組:加入培養(yǎng)基,不加腺苷,其余條件和模型組一樣。
陽(yáng)性對(duì)照組:分別加入用量為10μmol/L的丙磺舒和非布索坦,其余條件和模型組一樣。
取出細(xì)胞上清液,高效液相測(cè)定細(xì)胞上清液中尿酸含量,尿酸含量圖如圖5所示。
由圖5可知,加入陽(yáng)性藥物丙磺舒和非布索坦后,生成的尿酸含量相對(duì)于模型組顯著降低。說(shuō)明該高尿酸血癥肝細(xì)胞模型具有降尿酸評(píng)價(jià)的功效,可進(jìn)一步用于篩選降尿酸藥物。