本發(fā)明應用于細胞及細胞治療領域，具體涉及一種細胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種cd4陽性th17t細胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
免疫治療為腫瘤治療提供了一種有吸引力的療法，其優(yōu)勢是在增強或重建患者的抗腫瘤免疫的同時副作用較小。目前已有兩種主要策略被用于刺激抗腫瘤免疫。包括腫瘤治療性疫苗和過繼性細胞治療（adoptivecelltherapyact）.其中過繼性細胞治療主要是指向荷瘤宿主體內(nèi)回輸自體或異體免疫細胞，如以腫瘤反應性t細胞為主要成分的ctl（cytotoxictlymphocyte）細胞,腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltratinglymphocyte,til）等。腫瘤反應性ctl細胞回輸已被成功應用于黑色素瘤，eb病毒誘導淋巴瘤等腫瘤的臨床治療?，F(xiàn)有技術(shù)的act通常采用cd8t細胞來作為靶細胞轉(zhuǎn)入act。
然而目前將過繼性細胞治療廣泛應用于大多數(shù)非病毒相關實體瘤中還存在不少問題亟待解決，包括：1）如何獲得充分數(shù)量的腫瘤反應性t細胞是決定過繼性細胞治療效果的最關鍵因素。2）目前回輸?shù)拿庖呒毎绕涫强寺』痗d8t細胞在體外培養(yǎng)的過程中會不斷失去殺瘤活性，14天以后殺瘤活性就所剩無幾了，極大的影響了過繼性細胞治療的臨床療效。
因為，實有必要提供一種新的細胞培養(yǎng)方法替代現(xiàn)有技術(shù)中的t細胞以解決上述問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種t細胞培養(yǎng)方法，尤其涉及一種cd4陽性th17t細胞培養(yǎng)方法，以替代現(xiàn)有技術(shù)和臨床應用中cd8t細胞，以解決現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)量不足，殺瘤活性不足的問題。
本發(fā)明提供了一種t細胞培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟：
分離、純化：提供外周血，并從外周血中分離并純化得到cd4+t細胞；
刺激、生成：采用cd3、cd28或icos中的任意一種或多種包被的磁珠刺激所述cd4+t細胞產(chǎn)生th17t細胞；
擴增、培養(yǎng)：將th17t細胞接種到培養(yǎng)基中，加入細胞因子刺激擴增th17t細胞擴增，并持續(xù)添加tgf-β，所述細胞因子采用rhil-1β，rhil-6，rhil23，anti-hil-4，anti-hifn-γ中的任意一種或多種。
優(yōu)選的，所述t細胞的分離、純化過程包括：
從外周血中分離得到單個核細胞，將細胞重懸在pbs中，并調(diào)整細胞濃度；
取一定量細胞至聚苯乙烯中，加入正常的人血白蛋白；
加入分離試劑混勻后室溫孵育；
通過pbs調(diào)節(jié)總體積，通過反復吹打混勻提取溶液并重復多次進行提純；
離心收集上清液得到cd4+t細胞。
優(yōu)選的，加入分離試劑后孵育的過程包括：
加入easyseptmhumancd4+tcellisolationcoktail50μl/ml細胞混勻后室溫孵育10分鐘；
震蕩混勻easyseptmstreptavidinrapidspherestm5000175μl/ml細胞混勻后室溫孵育2.5分鐘；
優(yōu)選的，所述t細胞分裂、純化過程還包括上機檢測cd4+t細胞純度，若陽性細胞比例大于95%則合格，否則棄去不用，重新進行分離純化步驟。
優(yōu)選的，所述單個核細胞，重懸在pbs中，調(diào)整細胞濃度為100×106/ml，人血白蛋白的加入量為0.5mg。
優(yōu)選的，加入分離試劑室溫孵育后的提純過程包括如下步驟：
加入pbs使其總體積達到2.5ml；
反復吹打混勻后將試管連同磁柱一起拿起，將溶液倒入一個新的離心管中，將試管從磁柱中取出，加入2.5mlpbs溶液；
放入紫色的easyseptm磁柱中重復上述過程。
優(yōu)選的，所述t細胞的刺激、生成過程包括：取培養(yǎng)瓶一個加入用cd3、cd28或icos中的任意一種或多種包被的磁珠，將純化后cd4+t細胞按1×106/ml密度接種到培養(yǎng)瓶中。
優(yōu)選的，所述t細胞的擴增、培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基采用x-vivo，其中含有10ng/mlrhil-1β，10ng/mlrhil-6，20ng/mlrhil-23，10μg/mlanti-hil-4和anti-hifn-γ。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種th17t細胞的培養(yǎng)方法，旨在通過th17t細胞代替臨床現(xiàn)有的cd8t細胞，th17t細胞相比cd8t細胞而言，在不進行二次刺激的情況下，在體外能夠活躍的增值長達21天，產(chǎn)生5000倍數(shù)量的t細胞以供使用。從而確保了數(shù)量充足。另外，th17細胞的干細胞特性使其能夠具有較強的抗衰老特性，在體外經(jīng)歷兩周的增值之后還保留較強的清楚體內(nèi)腫瘤的能力，極大地提高了臨床效果。
附圖說明
圖1是本發(fā)明提供的方法的流程圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例及附圖對的技術(shù)方案進行詳細的描述，以使其更加清楚。以下實施例僅為了描述本發(fā)明所列舉的較為詳細的實施例，并不作為對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明提供的t細胞培養(yǎng)方法，參見圖1，該方法包括如下步驟：
步驟s1：分離、純化：提供人類的外周血，并從外周血中分離并純化得到cd4+t細胞，具體過程包括：
步驟s11：從外周血中分離得到單個核細胞，將細胞重懸在pbs（phosphatebufferedsaline，磷酸鹽緩沖液）中，并調(diào)整細胞濃度至100×106/ml；取一定數(shù)量的細胞至5ml聚苯乙烯中，加入正常的人血白蛋白0.5mg；
步驟s12：加入分離試劑混勻在15-25℃的室溫環(huán)境下孵育，具體在本實施方式中包括：步驟s121：加入easyseptmhumancd4+tcellisolationcoktail50μl/ml細胞混勻后室溫孵育10分鐘；步驟s122：震蕩混勻easyseptmstreptavidinrapidspherestm5000175μl/ml細胞混勻后室溫孵育2.5分鐘；
步驟s13：通過pbs調(diào)節(jié)總體積，通過反復吹打混勻提取溶液并重復多次進行提純，具體步驟如下：
加入pbs使其總體積達到2.5ml；反復吹打混勻后將試管連同磁柱一起拿起，將溶液倒入一個新的離心管中，將試管從磁柱中取出，加入2.5mlpbs溶液；放入紫色的easyseptm磁柱中重復上述過程。
步驟s14：將收集細胞的離心管離心收集上清液得到cd4+t細胞；
步驟s15：染色熒光抗體，上機檢測cd4+t細胞純度，若陽性細胞比例大于95%則合格，否則棄去不用，重新進行分離純化步驟。
步驟s2：刺激、生成：取培養(yǎng)瓶一個加入用cd3、cd28或icos中的任意一種或多種包被的磁珠，將純化后cd4+t細胞按1×106/ml密度接種到培養(yǎng)瓶中刺激生成th17t細胞。
步驟s3：擴增、培養(yǎng)：將th17t細胞接種到培養(yǎng)基中，加入細胞因子刺激擴增th17t細胞擴增，并持續(xù)添加tgf-β。
其中，步驟s2和步驟s3中采用的培養(yǎng)基均為x-vivo，細胞因子采用采用rhil-1β，rhil-6，rhil23，anti-hil-4，anti-hifn-γ中的任意一種或多種，具體在本實施方式中，加入營養(yǎng)基中的細胞因子包括10ng/mlrhil-1β，10ng/mlrhil-6，20ng/mlrhil-23，10μg/mlanti-hil-4，以及anti-hifn-γ。
對比例
本實施方式采用cd8t細胞作為對照組實驗。
對照組cd8t細胞使用與實驗組相同的用cd3、cd28或icos中的任意一種或多種包被的磁珠激活，ifn-γ培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。
根據(jù)對照組和實驗組的對比，th17t細胞相比cd8t細胞而言，在不進行二次刺激的情況下，在體外能夠活躍的增值長達21天，產(chǎn)生5000倍數(shù)量的t細胞以供使用。從而確保了數(shù)量充足。另外，th17t細胞的干細胞特性使其能夠具有較強的抗衰老特性，在體外經(jīng)歷兩周的增值之后還保留較強的清楚體內(nèi)腫瘤的能力，這一特性是cd8t細胞所無法達到的。
本發(fā)明提供一種th17t細胞的培養(yǎng)方法，旨在通過th17t細胞代替臨床現(xiàn)有的cd8t細胞，基于上述的th17t細胞的優(yōu)越性，可以極大地提高臨床效果。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。