本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為紅細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
目前，人紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，紅細(xì)胞是血液運送氧氣的最主要的媒介。當(dāng)人失血時，需要快速的補充紅細(xì)胞，而目前紅細(xì)胞來源主要是人體血液，而輸注的人血主要來源于志愿獻(xiàn)血者或是職業(yè)賣血者，不但血源奇缺，且價格昂貴，此外，血液中還可能攜帶病毒等，給需要輸送血液的人的生命造成額外的威脅。因此，目前的紅細(xì)胞來源非常單一，且產(chǎn)量極其有限，不能滿足需要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為紅細(xì)胞的方法，，誘導(dǎo)使用的干細(xì)胞來源于胚胎干細(xì)胞，易于體外擴增，取材方便，提供了一種經(jīng)濟安全，行之有效的新的紅細(xì)胞來源。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為紅細(xì)胞的方法，該方法具體步驟如下：
s1、取胚胎干細(xì)胞接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)層上；
s2、胚胎干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)；
s3、胚胎干細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)形成胚胎體；
s4、胚胎干細(xì)胞定向分化形成造血干細(xì)胞；
s5、將消化后的干細(xì)胞加入至脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)20d后得到定向分化的紅細(xì)胞；
進(jìn)一步地，所述s1中培養(yǎng)液成分為，85％dmem培養(yǎng)基中加入15％knockoutserumreplacement、4ng/mlbfgf、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/lβ-巰基乙醇、1mmol/l非必需氨基酸、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml青霉素。
進(jìn)一步地，所述s2中的具體步驟為，將s1中的培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5-6。
進(jìn)一步地，所述s3中的具體步驟為，將s2中的胚胎干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5-6d后取上清液,離心去細(xì)胞碎片,上清液過0.22μm濾膜,過濾后接種于含15％fcs，0.9％甲基纖維素的imdm液中，并加入30-50ng/mlscf，置于六孔培養(yǎng)板上懸浮3-4d形成胚胎體。
進(jìn)一步地，所述s4中的具體步驟為，用pbs液吹打所述胚胎體，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成單個小細(xì)胞團(tuán)，以lx105ml-1的細(xì)胞密度接種于骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層，并加入50ng/mlscf，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5-6d換液一次，培養(yǎng)20-22d形成造血干細(xì)胞。
進(jìn)一步地，所述脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基為stemspan無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-12u/mlepo和40-50ng/mligf-1。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明通過在胚胎干細(xì)胞向造血干細(xì)胞定向轉(zhuǎn)化過程中加入干細(xì)胞因子
(scf)，采用分階誘導(dǎo)的方式促使細(xì)胞分化，誘導(dǎo)使用的干細(xì)胞來源于胚胎干細(xì)胞，易于體外擴增，取材方便，提供了一種經(jīng)濟安全，行之有效的新的紅細(xì)胞來源。
當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點。
具體實施方式
本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明為一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為紅細(xì)胞的方法，該方法具體步驟如下：
實施例1
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)層上，其中培養(yǎng)液成分為：85％dmem培養(yǎng)基中加入15％knockoutserumreplacement、4ng/mlbfgf、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/lβ-巰基乙醇、1mmol/l非必需氨基酸、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml青霉素；
s2、培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5-6；
s3、將s2中的胚胎干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5-6d后取上清液,離心去細(xì)胞碎片,上清液過0.22μm濾膜,過濾后接種于含15％fcs，0.9％甲基纖維素的imdm液中，并加入30-50ng/mlscf，置于六孔培養(yǎng)板上懸浮3-4d形成胚胎體；
s4、用pbs液吹打所述胚胎體，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成單個小細(xì)胞團(tuán)，以lx105ml-1的細(xì)胞密度接種于骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層，并加入50ng/mlscf，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5-6d換液一次，培養(yǎng)20-22d形成造血干細(xì)胞；
s5、將s4中培養(yǎng)形成的造血干細(xì)胞加入胰蛋白酶-edta消化，之后加入胎牛血清停止消化；
將消化后的干細(xì)胞加入至脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每6-8d換液一次，20d后得到定向分化的紅細(xì)胞；
其中，所述脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基為
stemspan無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-12u/mlepo和40-50ng/mligf-1。
實施例2
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)層上，其中培養(yǎng)液成分為：85％dmem培養(yǎng)基中加入15％knockoutserumreplacement、4ng/mlbfgf、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/lβ-巰基乙醇、1mmol/l非必需氨基酸、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml青霉素；
s2、培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5-6；
s3、將s2中的胚胎干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5-6d后取上清液,離心去細(xì)胞碎片,上清液過0.22μm濾膜,過濾后接種于含15％fcs，0.9％甲基纖維素的imdm液中，并加入30-50ng/mlscf，置于六孔培養(yǎng)板上懸浮3-4d形成胚胎體；
s4、用pbs液吹打所述胚胎體，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成單個小細(xì)胞團(tuán)，以lx105ml-1的細(xì)胞密度接種于骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層，并加入50ng/mlscf，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5-6d換液一次，培養(yǎng)20-22d形成造血干細(xì)胞；
s5、將s4中培養(yǎng)形成的造血干細(xì)胞加入胰蛋白酶-edta消化，之后加入胎牛血清停止消化；
將消化后的干細(xì)胞加入至脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每6-8d換液一次，20d后得到定向分化的紅細(xì)胞；
其中，所述脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基為
stemspan無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-12u/mlepo和40-50ng/mligf-1。
實施例3
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)層上，其中培養(yǎng)液成分為：85％dmem培養(yǎng)基中加入15％knockoutserumreplacement、4ng/mlbfgf、1-1.5mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/lβ-巰基乙醇、1mmol/l非必需氨基酸、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml青霉素；
s2、培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5-6；
s3、將s2中的胚胎干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5-6d后取上清液,離心去細(xì)胞碎片,上清液過0.22μm濾膜,過濾后接種于含15％fcs，0.9％甲基纖維素的imdm液中，并加入30-50ng/mlscf，置于六孔培養(yǎng)板上懸浮3-4d形成胚胎體；
s4、用pbs液吹打所述胚胎體，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，并吹打成單個小細(xì)胞團(tuán)，以lx105ml-1的細(xì)胞密度接種于骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層，并加入50ng/mlscf，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5-6d換液一次，培養(yǎng)20-22d形成造血干細(xì)胞；
s5、將s4中培養(yǎng)形成的造血干細(xì)胞加入胰蛋白酶-edta消化，之后加入胎牛血清停止消化；
將消化后的干細(xì)胞加入至脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每6-8d換液一次，20d后得到定向分化的紅細(xì)胞；
其中，所述脫核誘導(dǎo)培養(yǎng)基為
stemspan無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10-12u/mlepo和40-50ng/mligf-1。
以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。