本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種血管化組織工程脂肪瓣的體內(nèi)構(gòu)建方法；

背景技術(shù)：

由于創(chuàng)傷、疾病、感染、腫瘤切除等原因?qū)е碌能浗M織缺損是臨床上經(jīng)常需要解決的問題，目前應(yīng)用于軟組織重建的材料如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、硅膠及其他填充材料具有高成本、免疫原性、致敏性及傳遞傳染性疾病的缺點(diǎn)。

自1893年以患者自體游離的小塊脂肪組織充填治療面部軟組織凹陷開始，自體脂肪組織以其具有來源豐富、取材方便、創(chuàng)傷小、無免疫排斥反應(yīng)、相對安全且并發(fā)癥相對較少等特點(diǎn)，至今仍是軟組織修復(fù)重建及體表器官畸形矯正或再造的常用方法之一。然而，自體脂肪移植術(shù)后因血供不足導(dǎo)致植入的脂肪組織被大量吸收和脂肪細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重地影響遠(yuǎn)期效果及受術(shù)者的滿意度，移植后的脂肪吸收、壞死、纖維化、囊腫形成和鈣化是脂肪移植的主要并發(fā)癥和主要缺點(diǎn)，移植的脂肪組織由于組織吸收體積收縮并導(dǎo)致原始移植體積20％～90％的丟失[cherubinom,marrakg.adipose-derivedstemcellsforsofttissuereconstruction.regenmed,2009,4(1):109-17.tobitam,orbayh,mizunoh.adipose-derivedstemcells:currentfindingsandfutureperspectives.discovmed,2011,11(57):160-70.]。因此，早期能否及時(shí)建立有效血液循環(huán)是自體脂肪移植存活的關(guān)鍵因素，而其中影響自體脂肪移植最重要和最關(guān)鍵的因素是新生血管的質(zhì)量、數(shù)量和新生脂肪組織的長期存活率。軟組織重建理想的解決方法是促進(jìn)血管化脂肪組織完整的重建并填充丟失的體積,在軟組織重建方面，自體脂肪移植已廣泛應(yīng)用，但是其局限性依舊存在，其中最明顯的就是組織吸收，導(dǎo)致移植的脂肪量減少。解決這一問題的關(guān)鍵，是形成新生血管，從而給移植組織提供營養(yǎng)支持。[brayfieldc,marrak,rubinjp.adiposestemcellsforsofttissueregeneration.handchirmikrochirplastchir.2010,42(2):124-8.salgadoaj,reisrl,sousanj,gimblejm.adiposetissuederivedstemcellssecretome:solublefactorsandtheirrolesinregenerativemedicine.currstemcellresther,2010,5(2):103-10.]。自從2001年zuk等首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)吸脂術(shù)獲得的脂肪組織中存在脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstromal/stemcells，ascs)以來，大量研究證實(shí)ascs通過旁分泌和自分泌作用激活甚至直接分化為成纖維細(xì)胞，以參與皮膚軟織損傷修復(fù)和結(jié)構(gòu)重建。ascs作為組織修復(fù)與再生理想的種子細(xì)胞，目前已證實(shí)其在抗衰老、軟組織損傷修復(fù)、促進(jìn)移植脂肪成活等治療中具有顯著療效。脂肪干細(xì)胞分化形成的脂肪細(xì)胞可用于軟組織缺損、隆乳、脂肪性營養(yǎng)不良以及軟組織填充美容。[tanss,ngzy,zhanw,rozenw.roleofadipose-derivedstemcellsinfatgraftingandreconstructivesurgery.jcutanaesthetsurg,2016，9(3):152-156.zielinser,luana,brettea,longakermt,wandc.therapeuticapplicationsofhumanadipose-derivedstromalcellsforsofttissuereconstruction.discovmed,2015,19(105):245-53.leesh,jinsy,songjs,seokk,chokh.paracrineeffectsofadipose-derivedstemcellsonkeratinocytesanddermalfibroblasts.anndermatol,2012,24:136-143.kimws,parkbs,sungjh,yangjm,parksb,kwaksj,parkjs.woundhealingeffectofadipose-derivedstemcells:acriticalroleofsecretoryfactorsonhumandermalfibroblasts.jdermatolsci,2007,48(1):15-24.tanss,lohw.theutilityofadipose-derivedstemcellsandstromalvascularfractionforoncologicsofttissuereconstruction:isitsafe？amatterfordebate.surgeon,2016nov1.pii:s1479-666x(16)30093-2.]

自2005年以來，我們的研究團(tuán)隊(duì)以人類不同解剖部位的皮下脂肪為組織來源，建立了自己的一整套實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺及方法，進(jìn)一步優(yōu)化脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方案，并對其進(jìn)行多潛能分化表型鑒定，通過在細(xì)胞體外培養(yǎng)或體內(nèi)移植過程中添加人參皂苷rg1或自體富血小板血漿/富血小板纖維蛋白等成分，觀察及評價(jià)細(xì)胞表型及其它生物學(xué)行為的變化情況，同時(shí)評價(jià)這些成分對脂肪干細(xì)胞生長增殖、多向分化、旁分泌功能及特定組織構(gòu)建的影響，取得了可喜的研究成果，為脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)研究及其在臨床上促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生及美容抗衰老等治療提供可靠的理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種血管化組織工程脂肪瓣的體內(nèi)構(gòu)建方法。并對其生物學(xué)特征分析。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種血管化組織工程脂肪瓣的體內(nèi)構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1.脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與流式細(xì)胞術(shù)檢測：

切取健康成年新西蘭大白兔腹股溝皮下脂肪組織約5ml，剔除血管及筋膜后，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，將脂肪組織充分剪碎至體積約1.0mm³，用質(zhì)量濃度為0.1％的ⅰ型膠原酶恒溫消化50～60min，用5ml的完全培養(yǎng)基中和后，用轉(zhuǎn)速為1300rpm/min的離心機(jī)離心5min，去除雜質(zhì)及上清液，沉淀混懸后用200目尼龍網(wǎng)過濾，再用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞混懸，按1×10⁵接種于25cm²的培養(yǎng)瓶中，置于體積濃度為5％co2中飽和濕度，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)，24h后首次更換完全培養(yǎng)基，以后每3～4d換完全培養(yǎng)基1次并動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的生長特性，7～10d細(xì)胞生長融合達(dá)80％～90％后，此時(shí)細(xì)胞稱為原代脂肪間干細(xì)胞記為ascs-p0，經(jīng)質(zhì)量濃度為0.25％胰酶消化后，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第三代細(xì)胞記為ascs-p3；用流式細(xì)胞術(shù)檢測ascs-p3細(xì)胞表面cd29(+)、cd44(+)、cd49d(+)、cd90(+)、cd105(+)、hla-abc(+)及cd34(-)、cd45(-)、cd106(-)后備用；所述完全培養(yǎng)基由高糖培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為10％胎牛血清+質(zhì)量濃度為1％青霉素+質(zhì)量濃度為1％鏈霉素組成。

2.免疫磁珠分選cd54(+)脂肪干細(xì)胞與體外標(biāo)記：

采用免疫磁珠分選出第三代cd54(+)脂肪干細(xì)胞并經(jīng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞，具體分選步驟如下：

(1)離心收集待分離細(xì)胞，用少量孵育液充分混懸0.5ml/1×10⁸細(xì)胞，加入最終濃度為10～20μg/ml的一抗，在4℃條件下孵育30分鐘；所述孵育液由質(zhì)量濃度為0.5％牛血清白蛋白、質(zhì)量濃度為0.08％乙二胺四乙酸ph為7.2的磷酸緩沖鹽溶液組成，并真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體。

(2)用20倍體積孵育液洗細(xì)胞一次，再加孵育液于0.3ml/1×10⁸細(xì)胞中充分混懸細(xì)胞后，加入相應(yīng)二抗包被的超微磁珠，混勻后在溫度為8～15℃條件下孵育10～15分鐘。

(3)將分離柱安裝入磁場中，加入0.5ml孵育液，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱。

(4)將步驟(2)孵育完畢的細(xì)胞懸液加到分離柱中，自然流盡。

(5)以0.5ml的孵育液加入分離柱中，自然流盡，流柱2次。

(6)從磁場中取下分離柱，插在試管口上，加入1～2ml的孵育液，用針芯用力推盡液體，沖出陽性細(xì)胞的細(xì)胞，同時(shí)陰性細(xì)胞也收集作為對照組備用，用完全培養(yǎng)基洗一次；然后采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記第三代脂肪干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞標(biāo)記情況。

3.hif-1α基因修飾脂肪干細(xì)胞及其體外擴(kuò)增：

以腺病毒作為攜帶hif-1α基因的載體，將hif-1α基因分別轉(zhuǎn)染第三代cd54(+)和cd54(-)脂肪干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后將第三代脂肪干細(xì)胞再次傳代培養(yǎng)擴(kuò)增至第五代達(dá)到所需的移植細(xì)胞量時(shí)備用，分別記為hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞和hif-1α/cd54(-)脂肪干細(xì)胞。4)hif-1α基因修飾cd54(+)脂肪干細(xì)胞與膠原海綿支架混合后移植與檢測按以下步驟操作：

(1)細(xì)胞-支架移植物的制備：

將無菌的膠原蛋白支架材料裁制成10mm×10mm×5mm大小，培養(yǎng)的第五代脂肪干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞密度為1×10⁷/ml，將1ml經(jīng)標(biāo)記后的細(xì)胞懸液與支架混合，靜置4h后，加入完全培養(yǎng)液，于體積濃度為5％co2中飽和濕度，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日上午移植到同一動(dòng)物體內(nèi)。

(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：

實(shí)驗(yàn)分4組：健康成年兔10只，體重2.0～2.5kg，月齡為3～4個(gè)月，雌雄不拘，每只動(dòng)物的脂肪干細(xì)胞移植均采用自身對照。

a組：膠原支架復(fù)合hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞，植入兔左前側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

b組：膠原支架復(fù)合cd54(+)脂肪干細(xì)胞，植入兔右前側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

c組：膠原支架復(fù)合hif-1α/cd54(-)脂肪干細(xì)胞，植入兔右后側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

d組：膠原支架復(fù)合cd54(-)脂肪干細(xì)胞，植入兔左后側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

術(shù)后切口分層縫合，肌肉注射青霉素3d，常規(guī)分籠單獨(dú)喂養(yǎng)，定期觀察動(dòng)物。

(3)術(shù)后取材：

移植物植入術(shù)后12周，再次手術(shù)取出移植物，肉眼觀察移植物的形態(tài)及膠原支架殘留情況，觀察是否有新生組織生成；小心將新生組織剝離下來，立即用電子天平稱出新生物的濕重，然后將組織塊分成兩部分，一份用于冰凍切片做油紅o染色；另一份用質(zhì)量濃度為4％多聚甲醛固定、酒精脫水，石蠟包埋，蠟塊分別作標(biāo)記，用于做he染色及免疫熒光染色。

將所述的體外免疫磁珠分選后的cd54(+)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)染hif-1α基因，和膠原蛋白支架復(fù)合hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)，構(gòu)建出較大體積的血管化組織工程脂肪瓣，為臨床上各種軟組織缺損的修復(fù)再生與畸形矯正提供可靠的理論依據(jù)。

(4)檢測項(xiàng)目：

組織學(xué)檢查：石蠟標(biāo)本切片常規(guī)he染色，觀察新生組織性質(zhì)并進(jìn)行新生微血管計(jì)數(shù)，在200倍光鏡下對he染色切片分別計(jì)算微血管數(shù)，隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野計(jì)算微血管密度取平均值(mvd)，即微血管條數(shù)/200倍視野，比較各組微血管密度。

特殊檢查：冰凍切片油紅o染色，熒光顯微鏡下觀察切片新生組織的細(xì)胞成分，比較各組成熟脂肪細(xì)胞密度、細(xì)胞內(nèi)脂滴含量。

成脂分化相關(guān)基因及蛋白檢測：分別采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測并比較各組與成脂分化相關(guān)的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

(5)體內(nèi)移植結(jié)果：

a組移植物新生組織濕重、成熟脂肪細(xì)胞密度、細(xì)胞內(nèi)脂滴含量、新生微血管密度、成脂相關(guān)基因及蛋白表達(dá)量均較其它三組高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義，這些結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞復(fù)合膠原支架植入動(dòng)物體內(nèi)后成脂分化效率及血管再生能力得到顯著的提高，有利于構(gòu)建較大體積的血管化組織工程脂肪瓣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明原代和第3代脂肪干細(xì)胞形態(tài)圖。

圖中，a為原代脂肪干細(xì)胞，b為第3代脂肪干細(xì)胞

圖2是本發(fā)明第3代脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)記cd分子流式細(xì)胞檢測結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞和hif-1α/cd54(-)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果圖。

圖中，a為hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞，b為hif-1α/cd54(-)脂肪干細(xì)胞。

圖4是本發(fā)明細(xì)胞支架復(fù)合物植入動(dòng)物體內(nèi)及12周后取材圖。

圖5是本發(fā)明各組新生組織大體圖及濕重比較圖。

圖6是本發(fā)明各組新生組織he染色、油紅o染色普通顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察結(jié)果圖。

圖7是本發(fā)明各組新生組織微血管密度、成熟脂肪細(xì)胞密度、細(xì)胞內(nèi)脂滴含量結(jié)果圖。

圖中，a為微血管密度，b為成熟脂肪細(xì)胞密度，c為細(xì)胞內(nèi)脂滴含量。

圖8是本發(fā)明各組新生組織成脂相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果圖。

圖9是本發(fā)明各組新生組織成脂相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

一種血管化組織工程脂肪瓣的體內(nèi)構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1.脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與流式細(xì)胞術(shù)檢測：

切取健康成年新西蘭大白兔腹股溝皮下脂肪組織約5ml，剔除血管及筋膜后，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，將脂肪組織充分剪碎至體積約1.0mm³，用質(zhì)量濃度為0.1％的ⅰ型膠原酶恒溫消化50～60min，用5ml的完全培養(yǎng)基中和后，用轉(zhuǎn)速為1300rpm/min的離心機(jī)離心5min，去除雜質(zhì)及上清液，沉淀混懸后用200目尼龍網(wǎng)過濾，再用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞混懸，按1×10⁵接種于25cm²的培養(yǎng)瓶中，置于體積濃度為5％co2中飽和濕度，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)，24h后首次更換完全培養(yǎng)基，以后每3～4d換完全培養(yǎng)基1次并動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的生長特性，7～10d細(xì)胞生長融合達(dá)80％～90％后，此時(shí)細(xì)胞稱為原代脂肪間干細(xì)胞記為ascs-p0，見圖1a，經(jīng)質(zhì)量濃度為0.25％胰酶消化后，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第三代細(xì)胞記為ascs-p3，見圖1b；用流式細(xì)胞術(shù)檢測ascs-p3細(xì)胞表面cd29(+)、cd44(+)、cd49d(+)、cd90(+)、cd105(+)、hla-abc(+)及cd34(-)、cd45(-)、cd106(-)后備用，見圖2；所述完全培養(yǎng)基由高糖培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為10％胎牛血清+質(zhì)量濃度為1％青霉素+質(zhì)量濃度為1％鏈霉素組成。

2.免疫磁珠分選cd54(+)脂肪干細(xì)胞與體外標(biāo)記：

采用免疫磁珠分選出第三代cd54(+)脂肪干細(xì)胞并經(jīng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞，具體分選步驟如下：

(1)離心收集待分離細(xì)胞，用少量孵育液充分混懸0.5ml/1×10⁸細(xì)胞，加入最終濃度為10～20μg/ml的一抗，在4℃條件下孵育30分鐘；所述孵育液由質(zhì)量濃度為0.5％牛血清白蛋白、質(zhì)量濃度為0.08％乙二胺四乙酸ph為7.2的磷酸緩沖鹽溶液組成，并真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體。

(2)用20倍體積孵育液洗細(xì)胞一次，再加孵育液于0.3ml/1×10⁸細(xì)胞中充分混懸細(xì)胞后，加入相應(yīng)二抗包被的超微磁珠，混勻后在溫度為8～15℃條件下孵育10～15分鐘。

(3)將分離柱安裝入磁場中，加入0.5ml孵育液，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱。

(4)將步驟(2)孵育完畢的細(xì)胞懸液加到分充柱中，自然流盡。

(5)以0.5ml的孵育液加入分離柱中，自然流盡，流柱2次。

(6)從磁場中取下分離柱，插在試管口上，加入1～2ml的孵育液，用針芯用力推盡液體，沖出陽性細(xì)胞的細(xì)胞，同時(shí)陰性細(xì)胞也收集作為對照組備用，用完全培養(yǎng)基洗一次；然后采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記第三代脂肪干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞標(biāo)記情況。

3.hif-1α基因修飾脂肪干細(xì)胞及其體外擴(kuò)增：

以腺病毒作為攜帶hif-1α基因的載體，將hif-1α基因分別轉(zhuǎn)染第三代cd54(+)和cd54(-)脂肪干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后將第三代脂肪干細(xì)胞再次傳代培養(yǎng)擴(kuò)增至第五代達(dá)到所需的移植細(xì)胞量時(shí)備用，分別記為hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞見圖3a和hif-1α/cd54(-)脂肪干細(xì)胞，見圖3b。

4)hif-1α基因修飾cd54(+)脂肪干細(xì)胞與膠原海綿支架混合后移植與檢測按以下步驟操作。

(1)細(xì)胞-支架移植物的制備：

將無菌的膠原蛋白支架材料裁制成10mm×10mm×5mm大小，培養(yǎng)的第五代脂肪干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞密度為1×10⁷/ml，將1ml經(jīng)標(biāo)記后的細(xì)胞懸液與支架混合，靜置4h后，加入完全培養(yǎng)液，于體積濃度為5％co2中飽和濕度，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日上午移植到同一動(dòng)物體內(nèi)。

(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：

實(shí)驗(yàn)分4組：健康成年兔10只，體重2.0～2.5kg，月齡為3～4個(gè)月，雌雄不拘，每只動(dòng)物的脂肪干細(xì)胞移植均采用自身對照。

a組：膠原支架復(fù)合hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞，植入兔左前側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

b組：膠原支架復(fù)合cd54(+)脂肪干細(xì)胞，植入兔右前側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

c組：膠原支架復(fù)合hif-1α/cd54(-)脂肪干細(xì)胞，植入兔右后側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

d組：膠原支架復(fù)合cd54(-)脂肪干細(xì)胞，植入兔左后側(cè)背部皮下肌筋膜內(nèi)。

術(shù)后切口分層縫合，肌肉注射青霉素3d，常規(guī)分籠單獨(dú)喂養(yǎng)，定期觀察動(dòng)物，見圖4。

(3)術(shù)后取材：

移植物植入術(shù)后12周，再次手術(shù)取出移植物，肉眼觀察移植物的形態(tài)及膠原支架殘留情況，觀察是否有新生組織生成；小心將新生組織剝離下來，立即用電子天平稱出新生物的濕重，然后將組織塊分成兩部分，一份用于冰凍切片做油紅o染色；另一份用質(zhì)量濃度為4％多聚甲醛固定、酒精脫水，石蠟包埋，蠟塊分別作標(biāo)記，用于做he染色及免疫熒光染色。

將所述的體外免疫磁珠分選后的cd54(+)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)染hif-1α基因，和膠原蛋白支架復(fù)合hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)，構(gòu)建出較大體積的血管化組織工程脂肪瓣，為臨床上各種軟組織缺損的修復(fù)再生與畸形矯正提供可靠的理論依據(jù)。

(4)檢測項(xiàng)目：

組織學(xué)檢查：石蠟標(biāo)本切片常規(guī)he染色，觀察新生組織性質(zhì)并進(jìn)行新生微血管計(jì)數(shù)，在200倍光鏡下對he染色切片分別計(jì)算微血管數(shù)，隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野計(jì)算微血管密度取平均值(mvd)，即微血管條數(shù)/200倍視野，比較各組微血管密度。

特殊檢查：冰凍切片油紅o染色，熒光顯微鏡下觀察切片新生組織的細(xì)胞成分，比較各組成熟脂肪細(xì)胞密度、細(xì)胞內(nèi)脂滴含量。

成脂分化相關(guān)基因及蛋白檢測：分別采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測并比較各組與成脂分化相關(guān)的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

(5)體內(nèi)移植結(jié)果：

a組移植物新生組織濕重、成熟脂肪細(xì)胞密度、細(xì)胞內(nèi)脂滴含量、新生微血管密度、成脂相關(guān)基因及蛋白表達(dá)量均較其它三組高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義，這些結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明hif-1α/cd54(+)脂肪干細(xì)胞復(fù)合膠原支架植入動(dòng)物體內(nèi)后成脂分化效率及血管再生能力得到顯著的提高，有利于構(gòu)建較大體積的血管化組織工程脂肪瓣，見圖5、圖6、圖7、圖8、圖9。