專利名稱：脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工程加工和產(chǎn)生變體酶的方法。本發(fā)明還涉及新型變體酶和這些新型變體酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
月旨質(zhì):膽固醇酉先基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)為人所知一段時(shí)間(參見,例如Buckley-Biochemistry1983，22，5490-5493)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與植物和/或哺乳動(dòng)物的卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶((LCAT)類似，甘油磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(GCAT)可催化磷脂酰膽堿和膽固醇之間的脂肪酸轉(zhuǎn)移。Upton 和 Buckley (TIBS 20, May 1995，pl78_179)以及 Brumlik 和 Buckley (J. ofBacteriology Apr. 1996，p2060_2064)教導(dǎo)了能夠在含水媒介中進(jìn)行至醇受體的?；D(zhuǎn)移的來(lái)自嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的脂肪酶/酰基轉(zhuǎn)移酶。對(duì)于這個(gè)酶，已經(jīng)鑒定了嗜水氣單胞菌?；D(zhuǎn)移酶的推定底物結(jié)合域和活性位點(diǎn)(參見，例如 Thornton et all988 Biochem. et Biophys. Acta. %9，I53-I59 和 Hilton &Buckley 1991 J. Biol. Chem. 266，997-1000)。Buckley 等(J. Bacteriol 1996，178 (7) 2060-4)教導(dǎo)，Serl6、Asp 116 和 His291
是保持酶活性所必須保留的重要氨基酸。Robertson 等(J. Biol. Chem. 1994，269，2146-50)教導(dǎo)了嗜水氣單胞菌的?；D(zhuǎn)移酶的ー些具體突變，即Y226F、Y230F、Y30F、F13S、S18G和S18V，均沒有包含在本發(fā)明中。WO 2005/066347涉及變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法。這些變體酶均沒有包含在本發(fā)明中。具有改善(增強(qiáng))活性的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的開發(fā)一直存在困難，尤其對(duì)于在一些應(yīng)用中具有高特異活性的變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)更是如此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的用于修飾的感興趣特定位點(diǎn)的預(yù)期。發(fā)明人首次建立了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶模型并且利用所述酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定了用于修飾的具體區(qū)域。此外，發(fā)明人還制備并測(cè)試了根據(jù)其以上發(fā)現(xiàn)而修飾的酶，并確定了用于多個(gè)應(yīng)用中的有利的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的各方面體現(xiàn)在權(quán)利要求書和以下說明內(nèi)容中。本發(fā)明ー個(gè)方面提供了用于制備變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)與編碼親本脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少ー個(gè)修飾(合適地為至少兩個(gè)修飾)的核苷酸序列，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中定位于以下的氨基酸a)所述酶的峽谷區(qū)(即優(yōu)選氨基酸殘基31、27、85、86、119和120);和/或b)插入位點(diǎn)I和/或c)插入位點(diǎn)2，其中所述峽谷區(qū)、插入位點(diǎn)I和/或插入位點(diǎn)2被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6或16所示的酶的峽谷區(qū)、插入位點(diǎn)I或插入位點(diǎn)2的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選位置位于峽谷和/或插入位點(diǎn)I和/或插入位點(diǎn)2中的修飾與位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于峽谷和/或插入位點(diǎn)I和/或插入位點(diǎn)2之外的氨基酸的至少ー個(gè)修飾組合。本發(fā)明另一方面提供了用于制備變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)與編碼親本脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少ー個(gè)修飾(合適地為至少兩個(gè)修飾)的核苷酸序列，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于以下位置的氨基酸:27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236 (優(yōu)選第27、31、85、86、119和/或120位，更優(yōu)選第27和/或31位)，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明的另一方面提供了制備變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)與編碼親本脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一個(gè)修飾的核苷酸序列，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于第27和/或31位的氨基酸并與至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾組合，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合適地，所述至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾可位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置本發(fā)明另ー個(gè)方面提供了產(chǎn)生變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括修飾脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列骨架，從而在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中以下氨基酸的位置形成至少ー個(gè)修飾(合適地為兩個(gè)修飾)a)所述酶的峽谷區(qū)和/或b)插入位點(diǎn)I和/或c)插入位點(diǎn)2，其中所述酶的峽谷區(qū)、插入位點(diǎn)I和/或插入位點(diǎn)2被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，分別對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6或16所示的酶的峽谷區(qū)、插入位點(diǎn)I或插入位點(diǎn)2的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選位置位于峽谷和/或插入位點(diǎn)I和/或插入位點(diǎn)2中的修飾與位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于峽谷區(qū)和/或插入位點(diǎn)I和/或插入位點(diǎn) 2之外的氨基酸的至少ー個(gè)修飾組合。本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括修飾脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶氨基酸序列骨架從而形成至少ー個(gè)修飾(合適地為至少兩個(gè)修飾)，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位(優(yōu)選第27、31、85、86、119和/或120位，更優(yōu)選第27和/或31位)的氨基酸，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ IDNo. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括修飾脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列骨架，從而形成至少ー個(gè)修飾(合適地為至少兩個(gè)修飾)，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于第27、31位的氨基酸并組合至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ IDNo. 6所示酶的相同位置的位置。合適地，所述至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾可位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130 位，其中所述位置編號(hào)被定義
為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明還涉及ー種方法，其包括改變緊鄰于親本酶(例如親本脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶)的催化三聯(lián)體(優(yōu)選催化三聯(lián)體的Asp殘基)的N-末端的底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段的長(zhǎng)度，從而產(chǎn)生相對(duì)于所述親本酶具有改變的底物特異性的改變的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，其中所述親本酶具有與本文SEQ ID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌(A. salmonicida)的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶至少70%相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述改變包括在所述底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段中進(jìn)行氨基酸插入或缺失，例如由不同脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段取代所述親本酶的所述底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段，從而產(chǎn)生所述改變的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，所述改變増加了可被所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的?；湹拈L(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選所述方法包括測(cè)試所述改變的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的改變的底物特異性。合適地，所述測(cè)試可以包括評(píng)價(jià)所述改變的或變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在含水環(huán)境下將?；鶑牡孜镛D(zhuǎn)移至受體分子的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)試包括評(píng)價(jià)所述變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶和所述親本酶轉(zhuǎn)移不同長(zhǎng)度的酰基鏈的能力。本發(fā)明還提供了改變的或變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含與本文SEQ ID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶具有至少70%同一性的氨基酸序列，其中相對(duì)于本文SEQ ID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，緊鄰于所述改變的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的催化三聯(lián)體的Asp殘基的N-末端的底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段具有改變的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，所述改變的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含與本文SEQ ID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有至少90%同一性的氨基酸序列。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法獲得的(變體)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽。在再一方面，本發(fā)明提供了包含編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的核酸(優(yōu)選分離的或重組的核酸)或載體，并且所述核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中ー個(gè)或多個(gè)以下位置的位置包含至少ー個(gè)修飾:27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236 (優(yōu)選第27、31、85、86、119和/或120位，更優(yōu)選第27和/或31位)，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明的再一方面提供了包含編碼脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的核酸(優(yōu)選分離的或重組的核酸)或載體，并且所述核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中ー個(gè)或多個(gè)以下位置的位置包含至少ー個(gè)修飾27和/或31，并組合至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合適地，所述至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾可位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130 位，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。優(yōu)選地，所述核苷酸序列編碼本發(fā)明的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶并且在修飾前為本文SEQID No. 25、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14 或SEQ ID No. 15 所示的核苷酸序列；或者為與 SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15 所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%同一性)的核苷酸序列；或者通過遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ IDNo. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列；或者在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明在ー個(gè)方面提供了分離或重組的核酸，其編碼具有脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性并且包含與SEQ ID No. 6或16的成熟區(qū)具有至少94%(優(yōu)選至少98%)氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在位于以下位置的位置包含至少ー個(gè)修飾(優(yōu)選至少兩個(gè)修飾)第 27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或 236 位(優(yōu)選第 27、31、85、86、119和/或120位，更優(yōu)選第27和/或31位)，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明在ー個(gè)方面提供了分離或重組的核酸，其編碼具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性并包含與SEQ ID No. 6或16的成熟區(qū)具有至少94%(優(yōu)選至少98%)氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于所編碼核酸序列中第27和/或31位氨基酸的位置包含至少ー個(gè)修飾(優(yōu)選至少兩個(gè)修飾)，并且組合至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合適地，所述至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾可位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。一方面提供了包含編碼具有脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核苷酸序列的核酸 (優(yōu)選分離的或重組的核酸)或載體，其中所述核苷酸序列在中等或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID No. 10或SEQ ID No. 25或者SEQ ID No. 10或SEQ ID No. 25的互補(bǔ)序列的基本全長(zhǎng)上雜交，其中所編碼的多肽包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基第31位的Q、H、N、T、F、Y或 C ;第 86 位的 R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L ;第 27 位的 R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F;H、R、D、E 85 ;第 119位的T或 I ;第 120 位的 K 或E ;第 122 位的 S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C ;第201位的R ;第245位的S ;第235位的A或V ;第232位的G或S ;第236位的G或E，其中所述位置是與SEQ ID No. 6相當(dāng)?shù)陌被嵛恢?。本發(fā)明在再一方面提供了由本發(fā)明的核酸或核苷酸序列編碼的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽。本發(fā)明一方面提供了在芽孢桿菌表達(dá)宿主，尤其是在地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)表達(dá)宿主中表達(dá)時(shí)，由本發(fā)明的核酸或核苷酸序列編碼的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽。
本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括向宿主細(xì)胞(優(yōu)選芽孢桿菌表達(dá)宿主，尤其是地衣芽孢桿菌表達(dá)宿主)中引入所述核酸或載體，其中所述核酸或載體包含編碼所述多肽的所述核苷酸序列，所述核苷酸序列與能夠引導(dǎo)由所述核酸編碼的多肽表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連接；在所述調(diào)控序列引導(dǎo)所述核酸或載體編碼的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。本發(fā)明一方面提供了一種前肽或多肽，其具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性并且包含與SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列具有至少90% (優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%)同一性的氨基酸序列并且在ー個(gè)或多個(gè)以下位置包含一個(gè)或多個(gè)修飾27、31、
85、86、122、119、120、201、245、232、235 和/或 236(優(yōu)選第 27、31、85、86、119 和/或 120位，更優(yōu)選第27和/或31位)。本發(fā)明另一方面提供了一種前肽或多肽，其具有脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性并且包含SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列，但在ー個(gè)或多個(gè)以下位置具有一個(gè)或多個(gè)修飾27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(優(yōu)選第 27、31、85、86、119 和/或 120位，更優(yōu)選第27和/或31位)。本發(fā)明一方面提供了一種前肽或多肽，其具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性并且包含與SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列具有至少90% (優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%)同一性的氨基酸序列并且在第27和/或31位包含ー個(gè)或多個(gè)修飾且與至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾組合，其中所述位置編號(hào)被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。合適地，所述至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾可位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207、130，其中所述位置編號(hào)被定義為
在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明另一方面提供了ー種的前肽或多肽，其具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性并且包含SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列，但在第27和/或31位的ー個(gè)或多個(gè)位置具有ー個(gè)或多個(gè)修飾且與至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾組合。合適地，所述至少ー個(gè)進(jìn)一歩的修飾可位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、233、33、207和/或 130，其中所述位置編號(hào)被定
義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示酶的相同位置的位置。本發(fā)明的多肽可以是前肽(pro-p印tide)，其經(jīng)歷進(jìn)一歩的翻譯后修飾成為成熟肽，即具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。僅作為示例，SEQ ID No. 16與SEQ ID No. 6相同，但SEQ ID No. 16經(jīng)歷翻譯后和/或轉(zhuǎn)錄后修飾以除去一些氨基酸，更具體地為38個(gè)氨基酸。因此，本文SEQ ID No. 6所示的多肽在ー些情況下(即在ー些宿主細(xì)胞中)可以被認(rèn)為是前肽，其通過翻譯后和/或轉(zhuǎn)錄后修飾而被進(jìn)ー步加工成成熟肽。對(duì)于翻譯后和/或轉(zhuǎn)錄后修飾，精確的修飾，例如切割位點(diǎn)，可根據(jù)宿主種類而略有變化。在ー些宿主物種中，可能沒有翻譯后和/或轉(zhuǎn)錄后修飾，這樣，前肽可等同于成熟肽(即具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽)。不期望受理論約束，與通過SEQ ID No. 6與SEQ ID No. 16比較的參照所示的切割位點(diǎn)相比，所述切割位點(diǎn)可以在任一方向移動(dòng)數(shù)個(gè)殘基(例如1、2或3個(gè)殘基)。換而言之，例如不是在第235位-ATR至第273位(RRSAS)切割，而可以在例如殘基232、233、234、235、236、237或238處開始切割。此外或可選擇地，可以在殘基270、271、272、273、274、275或276處終止切割。此外或可選擇地，切割可導(dǎo)致去除大約38個(gè)氨基酸，在一些實(shí)施方式中切割可導(dǎo)致去除30-45個(gè)之間的殘基，例如34-42個(gè)殘基，例如36-40個(gè)殘基，優(yōu)選38個(gè)殘基。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了制備食品的方法，其包括向所述食品的ー個(gè)或多個(gè)成分中添加本發(fā)明的多肽。本發(fā)明另ー方面提供了制備烘焙產(chǎn)品的方法，所述方法包括向生面團(tuán)中添加本發(fā)明的多肽，并烘焙生面團(tuán)以制備烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明的或可通過本發(fā)明的方法獲得(優(yōu)選已經(jīng)獲得)的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品以產(chǎn)生溶血磷脂的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了制備溶血磷脂的方法，所述方法包括用本發(fā)明的多肽處理磷脂以產(chǎn)生溶血磷脂。在再ー實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制備溶血糖脂的方法，所述方法包括用本發(fā)明的多肽處理糖脂以產(chǎn)生溶血糖脂。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了植物油或食用油的酶促脫膠方法，所述方法包括用本發(fā)明的多肽處理所述食用油或植物油，從而水解其中存在的大部分極性脂質(zhì)。本發(fā)明另ー方面提供了本發(fā)明的的或可通過本發(fā)明的方法獲得(優(yōu)選已經(jīng)獲得)的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在降低食用油中的磷脂含量的方法中的應(yīng)用，所述方法包括用所述變體脂肪分解酶處理所述油，從而水解大部分的所述磷脂，并將含水解磷脂的水相與油相分開。本發(fā)明另一方面提供了由本發(fā)明的方法獲得的食品或烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明另一方面提供了包含本發(fā)明的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的清潔組合物或去污組合物。本發(fā)明再一方面提供了包含本發(fā)明的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的面包和/或生面團(tuán)改良組合物。涉及可用于本發(fā)明的核苷酸序列的其他方面包括包含本發(fā)明的序列的構(gòu)建體；包含用于本發(fā)明的序列的載體；包含用于本發(fā)明的序列的質(zhì)粒；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化組織；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化器官；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包含本用于發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還涵蓋利用以上來(lái)表達(dá)用于本發(fā)明的核苷酸序列的方法，例如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移方法。本發(fā)明進(jìn)ー步涵蓋分離所述核苷酸序列的方法，例如從宿主細(xì)胞分離苷酸序列的方法。涉及可用于本發(fā)明的氨基酸序列的其它方面包括編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列、的構(gòu)建體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的載體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還涵蓋利用以上來(lái)純化用于本發(fā)明的氨基酸序列的方法，例如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移，然后純化所述序列的方法。發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容除非另有說明，否則所有氨基酸位置編號(hào)均涉及當(dāng)基于初級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)(優(yōu)選初級(jí)結(jié)構(gòu))比對(duì)時(shí)，本文SEQ ID No. 6所示的酶的相應(yīng)位置。然而，在一些實(shí)施方式中，本文使用的氨基酸位置編號(hào)可以涉及當(dāng)基于本文SEQ ID No. 16所示酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)的相應(yīng)位置。在分析脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的3-D結(jié)構(gòu)(三級(jí)結(jié)構(gòu))時(shí)，可確定酶中適合產(chǎn)生具有改良性質(zhì)的工程化脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的修飾位點(diǎn)。 本發(fā)明提供了鑒定脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中適合修飾的區(qū)域的工具。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述修飾導(dǎo)致改良的性質(zhì)，其可包括a)改變脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的底物特異性，例如并且僅作為示例i)改變酶使用某些化合物作為受體的能力，例如提高酶利用碳水化合物(例如麥芽糖)作為受體分子的能力，由此改善酶產(chǎn)生碳水化合物酷的能力；或ii)改變酶利用飽和或不飽和的脂肪酸作為底物的能力；或iii)改變酶的特異性，從而使其優(yōu)先利用來(lái)自脂質(zhì)的Snl或Sn2位的脂肪酸；或iv)改變酶的底物鏈長(zhǎng)特異性；b)改變酶的動(dòng)力學(xué)；和/或c)降低酶進(jìn)行水解反應(yīng)的能力同時(shí)保持或增強(qiáng)酶進(jìn)行?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的能力。所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)掲示了不尋常且有趣的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可使脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶得到更有效的工程化加工。特別地，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)掲示了穴(cave)和峽谷(canyon)結(jié)構(gòu)。穴區(qū)中的改變可以(例如)改變?nèi)缑傅牡孜镦滈L(zhǎng)特異性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)峽谷中的改變(特別是ー些優(yōu)選的關(guān)鍵修飾)對(duì)于例如增強(qiáng)或改變酶的底物特異性具有重要性。特別地,發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在峽谷中具有多個(gè)修飾,其等級(jí)高(rank highly)且產(chǎn)生具有改良性質(zhì)的感興趣變體，這些修飾可見于第31、27、85、86、119和120位。在ー些實(shí)施方式中，高度優(yōu)選第31和/或27位。因此，在本發(fā)明的廣義概念中，涉及在穴和/或峽谷區(qū)(優(yōu)選峽谷區(qū))內(nèi)修飾脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，由此產(chǎn)生具有改變的活性/性質(zhì)的經(jīng)修飾的酶。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選具有在峽谷區(qū)內(nèi)的至少ー個(gè)修飾和峽谷區(qū)內(nèi)或外的其他位置的至少ー個(gè)修飾的組合。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選所述改變不在穴區(qū)內(nèi)。在一個(gè)廣義的方面，本發(fā)明可提供修飾脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(或者通過修飾核苷酸序列或者通過修飾氨基酸序列)，由此在以下殘基產(chǎn)生ー個(gè)或多個(gè)修飾的方法27、31、85、
86、122、119、120、201、245、232、235、236，以及具有所述修飾的核酸和脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。在另ー個(gè)廣義的方面，本發(fā)明可提供用于修飾脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(或者通過修飾核苷酸序列或者通過修飾氨基酸序列)，由此在以下殘基產(chǎn)生ー個(gè)或多個(gè)修飾的方法27、
31、85、86、122、119、120、201、245，在ー些情況下，所述ー個(gè)或多個(gè)修飾可以與ー個(gè)或多個(gè)以下殘基中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)ー步的修飾組合23、81、82、289、227、229、233、33、207或130。本發(fā)明還提供了具有這些修飾的核酸和脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。與親本酶相比，所述變體酶必須包含至少ー個(gè)氨基酸修飾。在一些實(shí)施方式中，與親本酶相比，所述變體酶可包含至少2個(gè)，優(yōu)選至少3個(gè)，優(yōu)選至少4個(gè)氨基酸修飾。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，編碼本文SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的DNA序列經(jīng)過修飾。合適地，本發(fā)明的方法可包括將變體酶配制成酶組合物和/或食品組合物，例如面包改良組合物的額外步驟。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了包含本發(fā)明所述的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的面包改良組合物。優(yōu)選地，產(chǎn)生變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法進(jìn)ー步包括ー個(gè)或多個(gè)以下步驟I)結(jié)構(gòu)同源性制圖，或
2)序列同源性比對(duì)。如果脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸殘基同源于(即在初級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)中具有相應(yīng)的位置)或者類似于SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中的特異殘基或該殘基部分(即具有組合、反應(yīng)和/或化學(xué)相互作用的相同或類似功能性作用)，則脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸殘基可等同于(equivalent to)本文SEQ ID No. 16或6所示的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的殘基。在一些實(shí)施方式中，為了建立與初級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，將脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與本文SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的初級(jí)序列，尤其是在序列已知的所有或多數(shù)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中已知不變的殘基組進(jìn)行直接比較。在比對(duì)保守殘基，允許必要的插入和刪除以保持對(duì)齊(即避免通過任意刪除和插入而消除保守殘基)后，限定出了與SEQ ID No. 6或16的初級(jí)序列中的特定氨基酸等同的殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保守殘基的比對(duì)保留100%的此類殘基。然而，保守殘基的大于75%或低至50%的比對(duì)也足以限定出等同的殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保持催化性絲氨酸和組氨酸殘基的保守性。使用保守殘基來(lái)限定其他脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中，例如在來(lái)自其他氣單胞菌(Aeromonas)種以及任意其他生物的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶中與SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶相應(yīng)的等同氨基酸殘基。為了將親本脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 16 (參照序列)比對(duì)，可以イ吏用序列比ヌ寸，例如 ヌ寸比ヌ寸(http://www. ebi. ac. uk/emboss/a IiRn/index, html)。由此，可以確定并修飾在可選的親本脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽中與參照SEQ ID No. 16或SEQ IDNo. 6所限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的等同氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，當(dāng)使用emboss逐對(duì)比對(duì)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置通常足矣。可以利用“針(needle)”鑒定相應(yīng)殘基，以進(jìn)行覆蓋兩個(gè)序列的全長(zhǎng)的比對(duì)。然而，也可利用“水(water)”發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列間相似性最佳的區(qū)域。可選擇地，尤其例如，在親本脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶與SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 16的初級(jí)結(jié)構(gòu)同源性低的情況下，可通過與SEQ ID No. 16或SEQ ID No. 6，優(yōu)選與SEQ ID No. 16的結(jié)構(gòu)模型的結(jié)構(gòu)比對(duì)，確定可選親本脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶中與參照SEQ ID No. 6或SEQ IDNo. 16所限定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的相應(yīng)氨基酸。因此，可通過在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上確定與已經(jīng)通過X-射線結(jié)晶學(xué)確定三級(jí)結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的同源性，來(lái)定義等同的殘基。在這種情況下，“等同殘基”被定義為在比對(duì)后，與本文SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的特定氨基酸殘基的兩個(gè)或更多個(gè)主鏈原子的原子坐標(biāo)(N對(duì)N、CA對(duì)CA、C對(duì)C、和O對(duì)0)在0. 13nm以內(nèi)，且優(yōu)選在0. Inm以內(nèi)的那些殘基。在定向并定位最佳模型后實(shí)現(xiàn)比對(duì)，從而產(chǎn)生所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)與本文SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的最大重疊。如本領(lǐng)域已知的，最佳模型是在可得的最高分辨率下產(chǎn)生用于實(shí)驗(yàn)衍射數(shù)據(jù)的最低R因子的晶體學(xué)模型。將在功能和/或結(jié)構(gòu)上類似于本文SEQ ID No. 6或16所示脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的具體殘基的等同殘基定義為，脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的的那些氨基酸，其優(yōu)先采用使得其改變、修飾或者調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，從而以限于并歸結(jié)于本文SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的具體殘基的方式導(dǎo)致底物屬性，例如底物結(jié)合和/或催化作用的變化。此外，它們是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的那些殘基(在已通過X-射線結(jié)晶學(xué)獲得三級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下)其占據(jù)類似位置的程度使得盡管給定殘基的主鏈原子不滿足基于占據(jù)同源位置的等同標(biāo)準(zhǔn)，但所述殘基的至少兩個(gè)側(cè)鏈原子的原子坐標(biāo)位于本文SEQ ID No. 6或16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的相應(yīng)側(cè)鏈原子的0. 13nm以內(nèi)。確定了本文SEQ ID No. 16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(其是包含N80D突變的殺鮭氣 單胞菌脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶)的三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)，并將其示于下表中并應(yīng)用于在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上確定等同的殘基。結(jié)晶利用懸滴擴(kuò)散法獲得酶的晶體，具體地，將液滴(5iU蛋白溶液(mg/ml in)與 5 u I 儲(chǔ)備溶液(reservoir solution) : I. 4M 憐酸銨、0. IOM 憐酸鉀、44mM 氯化鈉、94mM氯化銨、2mM硫酸鎂、2mM氯化鈣，混合)放置在塑料蓋玻片上并翻轉(zhuǎn)到6x4Linbro平板的含Iml儲(chǔ)備溶液的孔上，并使其在持續(xù)數(shù)天至2周長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡。通過將預(yù)先生長(zhǎng)的晶體浸入含IOmM(NH4)2PtCl4的儲(chǔ)備溶液中，獲得(NH4)2PtCl4的晶體。X-射線數(shù)據(jù)收集在斯坦福同步加速器輻射實(shí)驗(yàn)室(SSRL，Menlo Park, USA)，在Beamline 11. I上對(duì)應(yīng)于鉬MAD實(shí)驗(yàn)的拐點(diǎn)(入I)、低能遠(yuǎn)端(low energy remote,入2)和峰(X3)的波長(zhǎng)，收集(NH4)2PtCl4M生物的多波長(zhǎng)反常衍射數(shù)據(jù)。之后，以1.5 A的分辨率收集數(shù)據(jù)集ひ0)。利用Quantum 315CXD在100K收集所述數(shù)據(jù)集。利用Mosflm(Leslie, A. G. ff. (1999)Acta Crystallogr. , D55, 1696-1702)整合數(shù)據(jù)，并利用來(lái)自CCP4 套裝(Collaborate computer project, Number 4 (1994) The CCP4 suite:programsfor protein crystallography. Acta Chrystallogr. , D50, 760-763)的 SCALA 程序繪圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)概括在表A中。X-射線數(shù)據(jù)收集在斯坦福同步加速器輻射實(shí)驗(yàn)室(SSRL，Menlo Park, USA)，在Beamline 11. I上對(duì)應(yīng)于鉬SAD實(shí)驗(yàn)的峰(入I)的波長(zhǎng)，收集(NH4)2PtCl4衍生物的多波長(zhǎng)反常衍射數(shù)據(jù)。之后，以し5 A的分辨率收集數(shù)據(jù)集(入0)。利用Quantum 315CXD在100K收集所述數(shù)據(jù)集。利用MoSflm[如上文]整合數(shù)據(jù)，并利用來(lái)自CCP4套裝[如上文]的SCALA程序繪圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)概括在下表(模型部分-mod)中。結(jié)構(gòu)解析和修正利用使用CCP4套裝的2.8 A鉬SAD數(shù)據(jù)ひ3或A1)和 S0LVE/RES0LVE 程序(Terwi 11 iger, T. C. and Berendzen, J. (1999) ActaCrystallogr.，D55, 849-861)確定初始結(jié)構(gòu)。利用 O1。和 COOT (Jones, T. A.，et al. (1991)Acta Crystallogr. , A47, 110-119)進(jìn)行模型構(gòu)建。然后利用使用 REFMAC(Collaboratecomputer project, Number 4(1994)The CCP4 suite: programs for proteincrystallography. Acta Chrystallogr. , D50, 760-763)的1,5 A數(shù)據(jù)集(入 0)對(duì)追蹤模型(traced model)進(jìn)行修正。修正的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)概括在下表中。最終的模型包括不對(duì)稱單元中的蛋白ニ聚體和1198個(gè)水分子。在所有分子中均沒有觀察到第一蛋氨酸殘基的電子密度。PR0CHECK11 (Laskowski, G. N. et al. (1993) J. Appl. Chrystallogr. , 26, 91-07)表明，所有單體中 94% 的殘基都位于 Ramachandran 圖(Ramachandran, G. N. et al. (1968) Advan.Protein Chem. , 23, 283-437)的核心區(qū)，在不允許區(qū)或勉強(qiáng)許可區(qū)中沒有殘基。所有圖像圖均由PyMOL(Warren L. DeLano “The PyMOL Molecular GraphicsSystem. ” DeLano Scientific, Belmont, CA, USA, http: //www. pymol. org)繪制。表A :本文SEQ ID No. 16所示的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(在本文中也稱為具有N80D突變且經(jīng)翻譯后修飾(切割)的來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶)的晶體參數(shù)、數(shù)據(jù)收集和修正統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的概述
權(quán)利要求
1.制備變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)與編碼親本脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性且包含至少ー個(gè)修飾的核苷酸序列，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于第27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235和/或236位的氨基酸，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，至少ー個(gè)修飾在位于所述峽谷區(qū)中的氨基酸殘基中，并且選自ー個(gè)或多個(gè)以下位置27、31、85、86、119和/或120。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述峽谷區(qū)中的至少ー個(gè)修飾與所述峽谷區(qū)之外的進(jìn)ー步的修飾組合。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可進(jìn)一歩包括位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置的至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾23、81、82、289、229、227、233、33、207和 /或130，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述至少ー個(gè)修飾選自以下組成的組L31Q、H、N、T、F、Y 或 C (優(yōu)選 L31Q) ;M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F (優(yōu)選 M27V)；V85H、R、D_E;I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C_LHtit I86S 或 A) ;A119T 或 I ;Y120K 或 E ;W122S、L 或 A (優(yōu)選 W122L) ；E201R ；Q245S ；F235A 或 V ；W232G 或 S ;和/或 A236G 或 E。
6.ー種方法，其包括改變底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段的長(zhǎng)度，從而產(chǎn)生相對(duì)于親本酶具有改變的底物特異性的變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，其中，所述底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段緊鄰于所述親本酶的催化三聯(lián)體(優(yōu)選所述催化三聯(lián)體的Asp殘基)的N-末端，所述親本酶與本文SEQ ID No. 6或16所示的來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有至少70%的同一性。
7.—種(變體)脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽，其由前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法獲得。
8.編碼脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的核酸，其核苷酸序列包含位置對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中ー個(gè)或多個(gè)以下位置的至少ー個(gè)修飾第27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、232、235、236位，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
9.如權(quán)利要求8所述的核酸，其中，所述核酸編碼具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性并且包含與SEQ ID No. 6或16的成熟區(qū)具有至少94%氨基酸序列同一性的序列的多肽，并且其中所述多肽在位于以下位置的位置包含至少ー個(gè)修飾第27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236位，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
10.編碼具有脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸，其中，所述核苷酸序列在中等或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與 SEQ ID No. 10 或 SEQ ID No. 25，或者 SEQ ID No. 10 或 SEQ ID No. 25 的互補(bǔ)序列在基本全長(zhǎng)上雜交，其中所編碼的多肽包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基第31位的 Q、H、N、T、F、Y 或 C ;第 86 位的 R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L ;第 27 位的 R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或F ;H、R、D、E 85 ;第 119 位的 T 或 I ;第 120 位的 K 或E ;第 122 位的S、L、A、F、W、Y、R、H、M或C ;第201位的R ;第245位的S ;第235位的A或V ;第232位的G或S ;第236位的G或E，其中所述位置是與SEQ ID No. 6相當(dāng)?shù)陌被嵛恢谩?br> 11.如權(quán)利要求8或9所述的核酸，其中，所述至少一個(gè)修飾在位于所述峽谷區(qū)中的氨基酸殘基中，并且選自ー個(gè)或多個(gè)以下位置27、31、85、86、119和120。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸，其中，所述峽谷區(qū)中的至少ー個(gè)修飾與所述峽谷區(qū)之外的進(jìn)ー步的修飾組合。
13.如權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核酸在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中ー個(gè)或多個(gè)以下位置的位置包括至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾23、81、82、289、229、227、.233、33、207和/或130，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
14.如權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述至少ー個(gè)修飾選自以下組成的組L31Q、H、N、T、F、Y 或 C (優(yōu)選 L31Q) ;M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F (優(yōu)選M27V) ;V85H、R、D 或 E ;I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L (優(yōu)選 I86S 或 A) ;A119T 或 I ；Y120K或 E ;W122S、L 或 A (優(yōu)選 W122L) ；E201R ；Q245S ；F235A 或 V ；W232G 或 S ;和/或 A236G 或 E。
15.如權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列編碼所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶并且在修飾之前為本文SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；或者為與本文SEQ IDNo. 25,SEQ ID No. 10,SEQ IDNo. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14或SEQ IDNo. 15所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%同一性)的核苷酸序列；或者通過遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No. 25,SEQID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15 相關(guān)聯(lián)的核苷酸序列；或者在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文SEQ ID No. 25、SEQ IDNo. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15 所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
16.變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶多肽，其由權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)所述的核酸或核苷酸序列編碼。
17.當(dāng)在芽孢桿菌(Bacillus)表達(dá)宿主中，尤其在地衣芽孢桿菌(B.Iicheniformis)表達(dá)宿主中表達(dá)時(shí)，由權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)所述的核酸或核苷酸序列編碼的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽。
18.產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括向宿主細(xì)胞(優(yōu)選芽孢桿菌表達(dá)宿主，尤其優(yōu)選地衣芽孢桿菌表達(dá)宿主)中引入權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼所述多肽的所述核酸與能夠引導(dǎo)由所述核酸編碼的多肽的表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連接；在所述調(diào)控序列引導(dǎo)所述核酸或載體編碼的多肽的表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
19.多肽，其具有脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶活性并且包含與SEQID No. 6或16所示的氨基酸序列具有至少90%(優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%)同一性的氨基酸序列，并且在一個(gè)或多個(gè)以下位置包含一個(gè)或多個(gè)修飾:27、31、85、86、122、119、120、122、201、235、232、236、245、.232,235 和/或 236。
20.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中，所述至少一個(gè)修飾在位于所述峽谷區(qū)中的氨基酸殘基中，并且選自以下組成的組27、31、85、86、119和120。
21.如權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多肽，其中，所述峽谷區(qū)的至少ー個(gè)修飾與所述峽谷區(qū)之外的進(jìn)ー步的修飾組合。
22.如權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可進(jìn)一歩包括至少ー個(gè)進(jìn)ー步的修飾，所述修飾位于ー個(gè)或多個(gè)以下位置23、81、82、289、229、227、233、.33,207和/或130，其中所述位置編號(hào)定義為當(dāng)基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本文SEQ ID No. 6所示的酶相同位置的位置。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述至少ー個(gè)修飾選自以下組成的組L31Q、H、N、T、F、Y 或 C (優(yōu)選 L31Q) ;M27R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S 或 F (優(yōu)選M27V) ;V85H、R、D 或 E ;I86R、Y、S、V、I、A、T、M、F、C 或 L(優(yōu)選 I86S 或 A) ；A119T 或 I ；Y120K或 E ;W122S、L 或 A (優(yōu)選 W122L) ；E201R ；Q245S ；F235A 或 V ；W232G 或 S ;和/或 A236G 或E0
24.如權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的多肽，其具有脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移 酶活性，并且除所述一個(gè)或多個(gè)修飾之外，包含SEQ ID No. 6或16所示的氨基酸序列。
25.變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽，其包含與本文SEQID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶至少70%相同的氨基酸序列，其中相對(duì)于本文SEQ ID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌的所述脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，緊鄰于所述改變的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的催化三聯(lián)體的Asp殘基的N-末端的底物鏈長(zhǎng)特異性決定片段具有改變的長(zhǎng)度。
26.如權(quán)利要求25所述的變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，其中，所述改變的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶包含與本文SEQ ID No. 6或16所示來(lái)自殺鮭氣單胞菌的脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶具有至少90%同一性的氨基酸序列。
27.制備食品的方法，所述方法包括向所述食品的ー個(gè)或多個(gè)成分中添加權(quán)利要求7、16-17或19-26中任一項(xiàng)所述的多肽。
28.制備烘焙產(chǎn)品的方法，所述方法包括向生面團(tuán)中添加權(quán)利要求7、16-17或19-26中任一項(xiàng)所述的多肽，和烘焙所述生面團(tuán)以制備所述烘焙產(chǎn)品。
29.權(quán)利要求7、16-17或19-26中任一項(xiàng)所述的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品以產(chǎn)生溶血磷脂的方法中的應(yīng)用。
30.植物油或食用油的酶促脫膠方法，其包括用權(quán)利要求7、16-17或19-26中任ー項(xiàng)所述的多肽處理所述植物油或食用油，從而水解其中存在的大部分極性脂質(zhì)。
31.由權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的方法獲得的食品或烘焙產(chǎn)品。
32.參考附圖
和實(shí)施例的如本文整體描述的方法。
33.參考附圖和實(shí)施例的如本文整體描述的核酸。
34.參考附圖和實(shí)施例的如本文整體描述的變體脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶多肽。
35.參考附圖和實(shí)施例的如本文整體描述的變體脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶多肽的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明一方面提供了制備脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶變體的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)與編碼親本脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列具有至少90%同一性并且包含至少一個(gè)修飾(合適地為至少兩個(gè)修飾)的核苷酸序列，所述修飾的位置對(duì)應(yīng)于在所編碼的氨基酸序列中位于以下的氨基酸a)所述酶的峽谷區(qū)(即優(yōu)選氨基酸殘基31、27、85、86、119和120)；和/或b)插入位點(diǎn)1(即氨基酸殘基22-36)和/或c)插入位點(diǎn)2(即氨基酸殘基74-88)，其中所述峽谷區(qū)、插入位點(diǎn)1和/或插入位點(diǎn)2被定義為在基于初級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明SEQ ID No.16或6所示的酶的峽谷區(qū)、插入位點(diǎn)1或插入位點(diǎn)2(或以上教導(dǎo)的相應(yīng)氨基酸殘基)的區(qū)域。優(yōu)選的修飾為以下一個(gè)或多個(gè)L3IQ,H,N,T,F,Y或C(優(yōu)選L31Q)；M27R,G，H,K,Y，D,N,V，C,Q,L,E,S或F(優(yōu)選M27V)；V85H,R5D或E；I86R,Y，S,V，I,As,T,M,F,C或L(優(yōu)選I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S,L或A(優(yōu)選W122L)；E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
文檔編號(hào)C12N15/75GK102656264SQ200980162945
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者C·R·索達(dá)爾, 喬恩·D·米克凱爾森, 伯吉特·Φ·維特席本, 夏洛特·約翰森·韋澤爾, 夏洛特·霍斯曼斯·波爾森, 延斯·弗里斯貝克·瑟倫森, 洛寧·B·米勒, 瑪格麗特·A·切爾溫, 理查德·R·博特, 約恩·博爾奇·瑟, 莫藤·K·拉爾森, 萊恩·B·詹森, 詹妮·布倫斯特德, 賴克·H·洛倫岑 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司