本發(fā)明屬衛(wèi)生害蟲(chóng)的生物防治技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種對(duì)蚊子幼蟲(chóng)具有高效殺蟲(chóng)活性的蘇云金芽胞桿菌菌株，涉及對(duì)該菌株基因組學(xué)的分析方法，涉及一種殺蚊子幼蟲(chóng)的蘇云金芽胞桿菌的制備方法及在蚊子生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis,bt)于1901年在日本被發(fā)現(xiàn)，1911年由柏林納從地中海粉螟的患病幼蟲(chóng)中分離出來(lái)，并依其發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)德國(guó)蘇云金省而命名。其是一種革蘭式陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛分布于各種生境，是迄今為止使用最安全、最廣泛的一種殺蟲(chóng)細(xì)菌。其發(fā)揮殺蟲(chóng)作用的是形成于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的伴孢晶體(parasporalcrystalprotein)，又稱(chēng)為殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein,icp)，已報(bào)道icps對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等各種昆蟲(chóng)，線(xiàn)蟲(chóng)，原生動(dòng)物和癌細(xì)胞有生物活性(schnepfe.,crickmoren.,riej.v.,etal.,bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins,microbiolmolbiolrev.,1998,62(3):775-806)。由于bt殺蟲(chóng)的特異性、高效性以及對(duì)環(huán)境安全和人畜無(wú)害，已經(jīng)廣泛用于病原媒介昆蟲(chóng)的生物防治以及轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的培育，并產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)效益。

在世界范圍內(nèi)，蚊子作為病原媒介載體在人和動(dòng)物之間傳播致病病毒和寄生蟲(chóng)，例如瘧疾、黃熱病、登革熱、絲蟲(chóng)病、圣路易斯腦炎和西尼羅河病毒(tollem.a.,mosquito-bornediseases.curr.probl.pediatr.adolesc,healthcare,2009,39,pp.97-140)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)估計(jì)，全世界約有一半的人口正面臨著瘧疾的風(fēng)險(xiǎn)，已發(fā)現(xiàn)的2.5億例瘧疾報(bào)告已經(jīng)導(dǎo)致約100萬(wàn)人的死亡，這其中有91％發(fā)生在非洲，85％是發(fā)生在5歲以下的兒童身上。近年來(lái)，登革熱和黃熱病也成為了重大的國(guó)際公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年有數(shù)千萬(wàn)例的感染報(bào)告，造成數(shù)十萬(wàn)人的死亡。

目前，針對(duì)西尼羅河病毒、登革熱、瘧疾和絲蟲(chóng)病的預(yù)防藥物和疫苗，或者太昂貴，或者由于其高危險(xiǎn)性而不能對(duì)人類(lèi)使用。為了降低這些疾病的發(fā)病率，人們致力于控制蚊子的種群數(shù)量，其中噴灑化學(xué)殺蟲(chóng)劑如馬拉硫酸和滴滴涕(ddt)，在短期內(nèi)取得了非常好的效果。但是這些化學(xué)殺蟲(chóng)劑的殘留物對(duì)于蚊子之外的生物，包括人類(lèi)和家畜都產(chǎn)生了極其負(fù)面的影響，而且對(duì)自然環(huán)境中的生物鏈和土壤也產(chǎn)生了極大的破壞。而殺蚊生物農(nóng)藥，特別是蘇云金芽孢桿菌，由于其高效的殺蚊活性，以及對(duì)其他生物和環(huán)境的安全性，而備受關(guān)注(bravoa.,etal.,modeofactionofbacillusthuringiensiscryandcyttoxinsandtheirpotentialforinsectcontrol,toxicon,2007,49(4):423-435)。

蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(b.thuringiensissubsp.israelensis,bti)自1976年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其對(duì)蚊子和黑蠅幼蟲(chóng)的特異性和高毒性已經(jīng)被廣泛研究，發(fā)現(xiàn)bti主要包含有四種殺蟲(chóng)晶體蛋白cry4aa、cry4ba、cry11aa和cyt1aa(claudiastein,garethw.jones,tanyachalmers,colinberry.transcriptionalanalysisofthetoxin-codingplasmidpbtoxisfrombacillusthuringiensissubsp.israelensis,applied&environmentalmicrobiology,2006,72(3):1771-1776)。此后，科學(xué)家相繼發(fā)現(xiàn)了多個(gè)bt亞種具有殺蚊活性，如canadensisi亞種、morrisoni亞種、jegathesan亞種、thompsoni亞種、kyushuensis亞種、medellin亞種和darmstadiensis亞種等。同時(shí)，也有多種殺蚊晶體蛋白被陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，如cry4a、cry4b、cry11a、cry19a、cry19b、cry30、cry40、cyt以及binarytoxin等。bti作為最早被發(fā)現(xiàn)的殺蚊菌株，已經(jīng)被作為商業(yè)化的生物殺蚊劑廣泛應(yīng)用于對(duì)蚊子種群的控制。野生bt菌株s2160-1從廣西大王嶺原始森林的土壤中分離得到，其對(duì)白紋伊蚊幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性明顯高于bti，而且菌株所含有的殺蟲(chóng)基因種類(lèi)和數(shù)量均不同于bti，因此s2160-1對(duì)于研究、開(kāi)發(fā)新的高效bt生物殺蚊制劑具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)蚊子幼蟲(chóng)具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌新菌株bts2160-1，該菌株是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種生物殺蚊制劑候選菌株，也可以應(yīng)用于構(gòu)建殺蚊工程菌。

本發(fā)明的菌株是一株野生型菌株，是從廣西大王嶺原始森林的土壤中分離得到的一種蘇云金芽胞桿菌新菌株，該菌株已于2016年11月14日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc,北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵編100101)()，分類(lèi)命名為蘇云金芽孢桿菌s2160-1(bacillusthuringiensiss2160-1,bts2160-1)，保藏編號(hào)為cgmccno.13274。

本發(fā)明菌株bts2160-1通過(guò)醋酸鈉+抗生素+溫度方法篩選得到。將收集的土壤樣品在室溫下進(jìn)行風(fēng)干預(yù)處理，研碎混勻，然后稱(chēng)取1g土壤樣品至10ml的bpa培養(yǎng)液中，再加入青霉素鈉鹽和硫酸慶大霉素至400μg/ml，然后30℃，220rpm搖床培養(yǎng)4h。靜置30min，取10ml土壤懸浮液，置于75℃水浴處理20min，每隔幾分鐘振蕩一次。取1ml上清液，進(jìn)行10倍梯度稀釋操作，共設(shè)置4個(gè)稀釋梯度(10^-1,10^-2,10^-3,10^-4)，各濃度分別取200μl涂布到na瓊脂培養(yǎng)平板，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)處理，將平板倒置培養(yǎng)于30℃培養(yǎng)箱。3天后，根據(jù)菌苔顏色、厚度、表面光澤度和邊緣是否整齊等形態(tài)，挑取不同的單菌落進(jìn)行石碳酸復(fù)紅染色，在油鏡下觀察菌體形態(tài)、晶體的形狀、大小和數(shù)量(見(jiàn)圖1)。發(fā)現(xiàn)一株含有球形晶體形態(tài)的bt菌株，遂命名為bts2160-1。

本發(fā)明菌株bts2160-1的伴孢晶體蛋白利用掃描電鏡鑒定。g-tris培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)72h，提取芽孢和伴孢晶體混合物，取10μl混合物樣品涂在蓋玻片上，經(jīng)過(guò)2.5％的戊二醛4℃過(guò)避光、過(guò)夜固定，然后用不同濃度乙醇逐級(jí)脫水、干燥，1％的四氧化鋨(oso4)固定，真空鍍膜噴金，掃描電子顯微鏡下觀察晶體的形狀。該菌株晶體蛋白形狀為球形，與桿狀營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞相連或者單獨(dú)散落存在(見(jiàn)圖2)。

本發(fā)明菌株bts2160-1的大質(zhì)粒dna脈沖場(chǎng)電泳分析顯示，菌株所含的大質(zhì)粒數(shù)量較少，主要含有一個(gè)大于350kb的大質(zhì)粒(見(jiàn)圖3)。菌株bts2160-1的伴孢晶體蛋白利用sds-page電泳標(biāo)明，在其芽孢后期主要產(chǎn)生140kda、130kda、80kda、50kda和30kda左右大小的蛋白(見(jiàn)圖4)，所產(chǎn)生的殺蚊蛋白目前鑒定出來(lái)主要有cry4cb3、cry50ba和cry54ba2等。相較之下，菌株bti在其芽孢后期所產(chǎn)生的的蛋白大小主要為130kda、80kda、50kda和30kda，所包含的殺蚊蛋白主要有cry4aa，cry4ba，cry11aa和cyt1aa。bti所含有的殺蚊蛋白基因與菌株bts2160-1相較，存在很大的種類(lèi)和數(shù)量差別。

本發(fā)明菌株bts2160-1的基因組測(cè)序利用illuminahiseq2000平臺(tái)完成，測(cè)序后原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾和質(zhì)控、soapdenovo短序列組裝共獲得82個(gè)scaffold(contig)。以ncbi上公布的26個(gè)完成基因組測(cè)序的bt菌株基因組作為參考序列，拼裝獲得菌株bts2160-1的染色體基因組和質(zhì)?；蚪M，利用cgviewserver完成基因組可視化草圖的繪制(見(jiàn)圖5和圖6)。

本發(fā)明菌株bts2160-1的蛋白以小菜蛾作為靶標(biāo)昆蟲(chóng)，采用浸葉法進(jìn)行生物活性測(cè)定，每次測(cè)定設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭小菜蛾3齡幼蟲(chóng)，觀察72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bts2160-1的伴孢晶體蛋白對(duì)小菜蛾沒(méi)有生物活性。以致倦庫(kù)蚊作為靶標(biāo)昆蟲(chóng)，每次測(cè)定設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭致倦庫(kù)蚊3齡幼蟲(chóng)，觀察48h，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示對(duì)致倦庫(kù)蚊3齡幼蟲(chóng)的lc50為5.668ng/ml。以白紋伊蚊作為靶標(biāo)昆蟲(chóng)，每次測(cè)定設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭白紋伊蚊3齡幼蟲(chóng)，觀察48h，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示對(duì)白紋伊蚊3齡幼蟲(chóng)的lc50為21.113ng/ml。

本發(fā)明菌株bts2160-1對(duì)致倦庫(kù)蚊3齡幼蟲(chóng)的活性低于who推薦的控蚊bt菌株bti的活性(1.718ng/ml)，但是對(duì)白紋伊蚊3齡幼蟲(chóng)的活性是bti菌株(45.585ng/ml)的2.2倍，優(yōu)勢(shì)明顯，可以作為bti之外控蚊微生物菌劑的有力補(bǔ)充，甚至能夠作為bti的替代物來(lái)控制白紋伊蚊的種群，有利于降低由于長(zhǎng)期使用bti晶體蛋白控制蚊子種群而導(dǎo)致抗性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說(shuō)明：

圖1：菌株bts2160-1石碳酸復(fù)紅染色光學(xué)顯微鏡觀察(100╳油鏡)

圖2：菌株bts2160-1伴孢晶體蛋白掃描電鏡觀察

圖3：菌株bts2160-1大質(zhì)粒dna脈沖場(chǎng)電泳分析

圖4：菌株bts2160-1伴孢晶體蛋白sds-page分析

注：1：芽孢形成前期bti菌株的蛋白；2：芽孢形成后期bti菌株的蛋白；3：bti菌株的晶體蛋白經(jīng)過(guò)1ug/ml胰蛋白酶處理；4：芽孢形成前期bts2160-1菌株的蛋白；2：芽孢形成后期bts2160-1菌株的蛋白；3：bts2160-1菌株的晶體蛋白經(jīng)過(guò)1ug/ml胰蛋白酶處理

圖5：菌株bts2160-1基因組測(cè)序及信息學(xué)分析流程

圖6：菌株bts2160-1基因組草圖

具體實(shí)施方式：

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例內(nèi)容，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段。

實(shí)施例1

土壤樣品的采集與bt菌株的分離培養(yǎng)

土壤采樣時(shí)間選擇夏秋季節(jié)(5月～10月)，選擇廣西大王嶺自然保護(hù)區(qū)向陽(yáng)坡，為了增加獲取新菌株的概率，采樣點(diǎn)盡量選擇植被保護(hù)完整、生態(tài)環(huán)境沒(méi)有人為干預(yù)少、土壤腐殖質(zhì)豐富的地方最佳。bt菌株篩選采取醋酸鈉+抗生素+溫度篩選法，稱(chēng)取1g土壤樣品至10ml的bpa培養(yǎng)液中，再加入青霉素鈉鹽和硫酸慶大霉素至400μg/ml，然后30℃，220rpm搖床培養(yǎng)4h。靜置30min，取10ml土壤懸浮液，置于75℃水浴處理20min，每隔幾分鐘振蕩一次。取1ml上清液，進(jìn)行10倍梯度稀釋操作，共設(shè)置4個(gè)稀釋梯度(10^-1,10^-2,10^-3,10^-4)，各濃度分別取200μl涂布到na瓊脂培養(yǎng)平板，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)處理，將平板倒置培養(yǎng)于30℃培養(yǎng)箱。3天后，根據(jù)菌苔顏色、厚度、表面光澤度和邊緣是否整齊等形態(tài)，挑取不同的單菌落進(jìn)行石碳酸復(fù)紅染色，在油鏡下觀察菌體形態(tài)、晶體的形狀、大小和數(shù)量。若觀察到分離株具有無(wú)色芽孢，則認(rèn)定為芽孢桿菌；若還產(chǎn)生有伴孢晶體，則認(rèn)定為bt菌株。

實(shí)施例2

掃描電鏡觀察bts2160-1菌株晶體蛋白

bt菌株在g-tris培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至芽孢完全形成，4℃，12,000g離心10min收集500μl菌體，然后用1m冰冷的nacl洗滌菌體3次，最后菌體懸浮于500μl冰冷超純水中。取10μl芽孢和伴孢晶體混合物小心平鋪在潔凈的蓋玻片上，然后4℃低溫真空干燥，然后用1％四氧化鋨(oso4)進(jìn)行樣品固定，樣品被置于金屬樣品臺(tái)上，放入真空蒸發(fā)器中噴鍍一層約20nm厚的金屬膜。準(zhǔn)備好的樣品置于s3-400n掃描電鏡(hitachiltd,japan)，20kv電壓條件下進(jìn)行圖像觀察記錄。

實(shí)施例3

sds-page電泳分析bts2160-1菌株晶體蛋白

bt菌株在200ml的g-tris培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天以上，培養(yǎng)條件為30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察，確認(rèn)芽孢充分形成，4℃，12,000g離心10min收集伴孢晶體和芽孢混合物。沉淀用等體積冰冷的1m的nacl洗滌3次，然后超聲波破碎細(xì)胞處理20min(modelvc-130,sonicsandmaterialsinc,usa)。4℃，12,000g離心10min，收集沉淀，溶于5ml的50mm的na2co3溶液(ph＝10.0)中。一般7.5％或者12％的sds-page可用于分析bt菌晶體蛋白組成，5ul制備好的伴孢晶體蛋白與5ul的2×sds-pagesamplebuffer[0.075mtris·cl,(ph6.8)；0.020medta；2％sds；0.02％bromophenolblue；0.25mdithiothreitol(dtt)；50％glycerol]混合，100℃沸水中煮5min，然后12,000g離心5min，上清立即上樣，在100v電壓下，利用mini-proteinii,cellslabverticalapparatus裝置(biorad,usa)()電泳大約1h，然后用coomassiebluer250進(jìn)行染色，蛋白質(zhì)大小根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

實(shí)施例4

bt菌株質(zhì)粒dna提取純化

在lb培養(yǎng)基，30℃，220rmp振蕩培養(yǎng)至od600為2左右，離心收集菌體懸浮于gtebuffer[2.5mmglucose，25mmtris-cl10mmedta(ph8)]中，加入lysozyme至終濃度為10mg/ml，37℃水浴1h。然后加入2倍體積的sds(1.0％)和naoh(0.8m)溶液，輕輕上下倒置6～8次，然后加入1/2體積冰冷的3msodiumacetate(ph4.8)溶液，立刻輕輕上下倒置6～8次，冰上放置4h以上，然后經(jīng)過(guò)等體積苯酚：氯仿：異戊醇(phenol:chloroform:isoamylalcohol)25:24:1抽提2次，70％乙醇沉淀獲得bt菌株的質(zhì)粒dna。然后利用氯化銫cscl梯度密度超速離心純化質(zhì)粒dna。

實(shí)施例5

bts2160-1菌株質(zhì)粒dna脈沖場(chǎng)電泳分析

應(yīng)用于chefxapulsedfieldelectrophoresissystem(biorad，usa)對(duì)bt質(zhì)粒profiles進(jìn)行分析。低熔點(diǎn)瓊脂糖的濃度為1％(amresco,usa)，電泳緩沖液為0.5×tbe(45mmtris·cl，1mmedta)，電泳槽溫度控制為15℃，電壓為5v/cm，轉(zhuǎn)換角度為120度，起始脈沖時(shí)間1.19s，終止脈沖時(shí)間44.69s，電泳時(shí)間為20h。電泳完成后瓊脂糖膠塊用0.5μg/mleb浸泡30min，再用冰冷的純水清浸泡2h，期間換水3次，最后在紫外光成像儀下觀察。

實(shí)施例6

bts2160-1菌株的基因組dna提取

bt單菌落接種于7ml的lb液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，按照1％的量轉(zhuǎn)接于盛有50ml的lb培養(yǎng)基的250ml體積的三角瓶中，30℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)至od600＝1.0～2.0；離心收集10ml菌體，然后2mljbuffer(0.1mtrishcl(ph8.0)、0.1medta(ph8.0)、0.15mnacl)洗滌沉淀；將沉淀輕懸于2mljbuffer中加入80ul新鮮配制的溶菌酶(50mg/ml),混勻，37℃溫育45min；再加入15ulrnase(10mg/ml)，50℃作用15min；接著加入200μlsds(20％)，70℃處理20min；緩慢冷卻至37℃，用等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)及氯仿：異戊醇(24：1)各抽提一次，再加入等體積異戊醇混勻置于-20℃下沉淀上清20min，12,000rmp離心10min。70％乙醇洗滌沉淀2次,風(fēng)干后溶于100ultebuffer(10mmtrishcl(ph8.0)、1mmedta(ph8.0))中，取5uldna樣品在0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳，gelred核酸染料染色后用紫外分析儀檢測(cè)。

實(shí)施例7

菌株bts2160-1基因組測(cè)序及其序列組裝：

取菌株bts2160-1基因組dna5ug，利用covaris隨機(jī)打斷至400-600bp，末端補(bǔ)平后在3'末端加a，然后連接illumina的pair-end接頭。連接片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收500-700bp范圍的條帶。回收的條帶通過(guò)10個(gè)循環(huán)的pcr擴(kuò)增，富集得到500bp插入片段的pair-end文庫(kù)。取10ng的文庫(kù)，在c-bot中進(jìn)行clustergeneration，然后在illuminahiseq2000中進(jìn)行雙向測(cè)序，經(jīng)過(guò)200個(gè)循環(huán)的測(cè)序反應(yīng)。獲得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)需要經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理，產(chǎn)生的reads數(shù)據(jù)的質(zhì)量效果利用fastqc進(jìn)行評(píng)價(jià)，并根據(jù)質(zhì)控要求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的質(zhì)量控制。質(zhì)控后獲得的序列denovo組裝由軟件abyss(參數(shù)kmer25；n,10)完成，運(yùn)用soapdenovo短序列組裝軟件(http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html；版本：r240)對(duì)處理后的reads數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，經(jīng)多次調(diào)整后主要參數(shù)k設(shè)置為46。把reads比對(duì)到contig上，根據(jù)reads的paired-end和overlap關(guān)系，對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部組裝和優(yōu)化，最終獲得82個(gè)scaffold(contig)。

實(shí)施例8

菌株bts2160-1基因組標(biāo)準(zhǔn)信息分析流程：

基本流程：(1)數(shù)據(jù)過(guò)濾：對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾及統(tǒng)計(jì)；(2)組裝：運(yùn)用soapdenovo2短序列組裝軟件，對(duì)處理后的reads數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝；(3)組裝結(jié)果評(píng)價(jià)：以ncbi上公布的26個(gè)完成基因組測(cè)序的bt菌株基因組作為參考序列，對(duì)基因組和基因區(qū)覆蓋度進(jìn)行評(píng)價(jià)；(4)蛋白編碼基因預(yù)測(cè)：采用genemarker軟件從組裝結(jié)果中獲得基因序列；(5)non-codingrna注釋?zhuān)和ㄟ^(guò)與參考序列rrna比對(duì)找到rrna，或rrnammer軟件預(yù)測(cè)rrna；通過(guò)trnascan軟件預(yù)測(cè)trna區(qū)域和trna的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)rfam軟件預(yù)測(cè)srna；(6)重復(fù)序列注釋?zhuān)和ㄟ^(guò)repeatmasker軟件(使用repbase數(shù)據(jù)庫(kù))和repeatproteinmasker軟件(使用repeatmasker自帶的轉(zhuǎn)座子蛋白庫(kù))兩種方法來(lái)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)座子；通過(guò)trf(tandemrepeatfinder)軟件預(yù)測(cè)串聯(lián)重復(fù)序列；(7)crispr預(yù)測(cè)：使用crisprfinder軟件，識(shí)別crisprs，得到drs和spacers；(8)基因功能注釋?zhuān)豪胟aas工具將基因的序列與各數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息；(9)基因組可視化草圖：使用(g–c)/(g+c)的計(jì)算方法來(lái)進(jìn)行g(shù)cskew分析，同時(shí)根據(jù)cog的注釋結(jié)果和基因的位置信息繪出cog注釋的基因在基因組上的分布情況，以及gccontent和菌株可能編碼的毒蛋白的位置信息。利用cgviewserver完成基因組可視化草圖的繪制。

實(shí)施例9

菌株bts2160-1總蛋白質(zhì)譜鑒定

菌株bts2160-1總蛋白質(zhì)譜鑒定利用線(xiàn)性離子阱結(jié)合軌道阱高分辨率組合質(zhì)譜技術(shù)(ltq-orbitrapms)分析。bts2160-1用nb培養(yǎng)基培養(yǎng)72h，每隔4h收集2ml菌液，最后將各時(shí)間點(diǎn)收集到的菌液混合，提取總蛋白。利用胰蛋白酶對(duì)總蛋白進(jìn)行酶解消化預(yù)處理，然后hplc陽(yáng)離子交換分離多肽，ziptipc18吸頭進(jìn)行脫鹽處理，獲得上機(jī)檢測(cè)液。利用easy-nlc結(jié)合orbitrap質(zhì)譜檢測(cè)樣品，質(zhì)譜采集到的原始數(shù)據(jù)采用proteomediscovery軟件的sequest搜索器進(jìn)行搜索和匹配，使用bt菌基因組預(yù)測(cè)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。最后發(fā)現(xiàn)，從4h到72h，染色體上表達(dá)的總蛋白數(shù)量共為1929個(gè)，質(zhì)粒1上有80個(gè)表達(dá)的蛋白，質(zhì)粒2上有44個(gè)蛋白表達(dá)。

實(shí)施例10

小菜蛾的人工飼養(yǎng)

小菜蛾利用溫室種植的中國(guó)白菜進(jìn)行人工飼養(yǎng)，人工飼養(yǎng)環(huán)境的相對(duì)濕度為65％左右，溫度保持為26℃上下，光照周期為14h:10h。用將飽含10％葡萄糖溶液(或蜂蜜溶液)的脫脂棉球放入成蟲(chóng)飼養(yǎng)籠中，供成蟲(chóng)取食，每天更換一次。蛹羽化后，成蟲(chóng)當(dāng)天即交配產(chǎn)卵，一條雌性的小菜蛾可以生產(chǎn)250到300枚卵。收集卵直接置于人工飼養(yǎng)中國(guó)白菜的葉片上，第5～6天開(kāi)始孵化，孵化出的幼蟲(chóng)即可以取食葉片，適時(shí)不斷更換菜葉，5～6天即可以發(fā)育成2～3齡幼蟲(chóng)直接用于生物測(cè)定。

實(shí)施例11

致倦庫(kù)蚊(culexquinquefasciatus)和白紋伊蚊(aedesalbopictus)的蟲(chóng)源取自于廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防與控制中心，采取人工室內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境，溫度為26℃，相對(duì)濕度在60％以上，光照周期為14h:10h。蚊的生長(zhǎng)周期為4個(gè)階段：卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)。幼蟲(chóng)生長(zhǎng)在去氯的自來(lái)水中，喂飼人工飼料。成蟲(chóng)放置在網(wǎng)狀籠中，放入10％的葡萄糖溶液的脫脂棉球喂飼成蟲(chóng)，放入小老鼠讓蚊吸血以進(jìn)入繁殖階段。一般雌蚊將蟲(chóng)卵產(chǎn)在靜止的水中，通常我們?cè)诔上x(chóng)籠中放入一個(gè)盛水瓷碗以收集蟲(chóng)卵。蟲(chóng)卵在水中孵化成幼蟲(chóng)，飼養(yǎng)10天左右即可進(jìn)入2-3齡，即可用于生測(cè)。

實(shí)施例12

菌株bts2160-1蛋白對(duì)小菜蛾的毒性測(cè)試

粗蛋白取菌液六個(gè)不同濃度梯度被測(cè)液，加入0.1％tween20或者tritonx100。選取新鮮的中國(guó)白菜葉片(大小一致，20g左右，含有中脈)，用器皿切割成直徑為9cm左右的圓菜葉片，均勻地浸入上述待測(cè)樣品溶液中，20s，取出后在室溫下涼干(中間翻轉(zhuǎn)一次)。塑料培養(yǎng)皿中放入一張大小相仿的濾紙，用蒸餾水濕潤(rùn)，再放入晾干的葉片。用毛筆輕輕接入二齡幼蟲(chóng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入小菜蛾10頭，每個(gè)處理重復(fù)3-6次，蓋上培養(yǎng)皿，膠布纏好，防止幼蟲(chóng)逃逸。放置25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為12h：12h。每天觀察，檢查菜葉是否腐爛或干枯，是否有水蒸氣凝結(jié)；第2天和第4天分別調(diào)查死、活蟲(chóng)數(shù)，利用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行毒力回歸分析，計(jì)算lc50值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株bts2160-1蛋白對(duì)小菜蛾并無(wú)生物活性。

實(shí)施例13

菌株bts2160-1蛋白對(duì)致倦庫(kù)蚊和白紋伊蚊的殺蟲(chóng)活性測(cè)試

蚊的生物測(cè)定參照who建立的標(biāo)準(zhǔn)程序。標(biāo)定好濃度的蛋白溶液由除氯自來(lái)水稀釋成8個(gè)濃度梯度，分別置于消毒透明飲水塑料杯里(直徑5cm)，每個(gè)塑料杯盛30ml的蛋白溶液，用pasteurpipette移入30頭3齡的蚊幼蟲(chóng)。以不加入任何蛋白的除氯自來(lái)水作為陰性對(duì)照，以bti的蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)蛋白濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理。所有生物測(cè)定都在人工恒定的環(huán)境，溫度為26℃，65％的相對(duì)濕度，光照周期為14h:10h，培養(yǎng)48h后，觀察蚊幼蟲(chóng)的死、活數(shù)量，并做好統(tǒng)計(jì)，利用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行毒力回歸分析，計(jì)算lc50值。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，菌株bts2160-1蛋白對(duì)致倦庫(kù)蚊(culexquinquefasciatus)三齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性lc50為5.668ng/ml，菌株bti對(duì)致倦庫(kù)蚊(culexquinquefasciatus)三齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性lc50為1.718ng/ml，相較而言，bti菌株對(duì)于致倦庫(kù)蚊的活性要高于bts2160-1菌株。菌株bts2160-1蛋白對(duì)白紋伊蚊(aedesalbopictus)三齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性lc50為21.113ng/ml，菌株bti對(duì)白紋伊蚊(aedesalbopictus)三齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性lc50為45.585ng/ml，相較而言，菌株bts2160-1所產(chǎn)生的殺蚊蛋白對(duì)于白紋伊蚊(aedesalbopictus)的活性要顯著高于bti菌株。