本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，尤其涉及一種具有抑菌活性的融合子及其制備方法。
背景技術：
：常用的抑菌劑是一些抗生素，能可逆性抑制細菌的繁殖，但不直接殺死細菌。近幾年，隨著抗生素被人們?yōu)E用，導致部分細菌產(chǎn)生耐藥性，從而使抗生素的抗菌作用減弱或消失，因此，開發(fā)具有抑菌活性的的生物抑菌劑替代抗生素已經(jīng)成為世界范圍的研究熱點。highlyn-methylatedlinearpeptidesproducedbyanatypicalsponge-derivedacremoniumsp[jnatprod，2006，69(9)：83-92]中公開了一種從海綿acremonium的代謝產(chǎn)物中分離純化得到的肽類化合物，該化合物具有較強的抗菌作用，其中環(huán)狀肽類抑菌效果比較明顯。線蟲共生致病桿菌pacyellow的吲哚抗生素[微生物通報，2015，42(1)：85-92]中公開了一種從嗜線蟲致病桿菌的代謝產(chǎn)物中分離純化得到4個吲哚生物堿類化合物，其中2個化合物對致病真菌新型隱球菌具有較好的抑制作用。通過上述文獻記載的方法獲得的生物抑菌劑分別對環(huán)狀肽類和致病真菌新型隱球菌具有較好的抑制作用，但是兩者的制備方法均比較復雜，且制備得到的生物抑菌劑達不到化學源抑菌劑的效果，因此利用率并不高。原生質(zhì)體融合是指通過人工的方法，使遺傳性狀不同的兩個或多個細胞的原生質(zhì)體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。原生質(zhì)體融合在提高菌種的產(chǎn)酶活力、代謝產(chǎn)物的含量、降解污染物的能力，以及對環(huán)境的耐受性等方面的應用已有報道。目前，大多數(shù)原生質(zhì)體融合的研究均針對種屬內(nèi)的微生物實施，目標是改善微生物的生長、生產(chǎn)特性，對跨界融合的少量報道集中在廢水處理、葡萄酒降酸微生物選育方面。與屬種間的融合相比，跨界融合更有可能產(chǎn)生結構和功能新穎的分子，因而在藥物或前體分子產(chǎn)生方面，提供不同于常規(guī)的“組合化學合成或高通量篩選”的新的途徑。原核微生物粘質(zhì)沙雷氏菌屬于革蘭氏陰性細菌，能夠產(chǎn)生一類具有吡咯環(huán)結構的紫紅色素-靈菌紅素。研究表明，靈菌紅素及其衍生物具有抗細菌、抗真菌、抗瘧劑、免疫抑制和抗腫瘤等活性，靈菌紅素類似物或衍生物正成為藥物研究的熱點。真核生物膠紅酵母屬于隱球菌科，遺傳穩(wěn)定，抑菌普廣，效價高，一般不產(chǎn)生對人和植物有害的代謝產(chǎn)物，安全性高，且對營養(yǎng)要求低，生長快，并對多種脅迫、逆境具有較強的耐受力。由于細菌和真菌基因組的差異以及代謝類型的多樣性，采用已知能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的粘質(zhì)沙雷氏菌和膠紅酵母，開展跨界融合會產(chǎn)生一些新穎的分子結構和抑菌活性的菌株。目前，粘質(zhì)沙雷氏菌和膠紅酵母原生質(zhì)體融合子的研究尚未見報道，因此，具有十分重要的研究意義。技術實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑菌活性的融合子及其制備方法。本發(fā)明建立了基于雙親滅活原生質(zhì)體技術，制備具有抑菌活性的粘質(zhì)沙雷氏菌和膠紅酵母原生質(zhì)體融合子的方法。本發(fā)明的技術方案如下：一種具有抑菌活性的融合子，名稱為rhodotorulamucilaginosasgm，保藏單位為廣東省微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為gdmccno：60141，保藏日期為2017年1月16日，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。所述具有抑菌活性的融合子的制備方法，包括以下步驟：s1：原生質(zhì)體的制備與滅活(1)粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體的制備①粘質(zhì)沙雷氏菌甘油菌株活化過夜，按5％接種量接入30mllb培養(yǎng)基，30℃，200r/min培養(yǎng)4h，制得菌液a；②取5-8ml步驟①制得的菌液a，6000-8000r/min離心5-8min，用pbs緩沖液洗滌3次并重懸于6-10mlpbs緩沖液中，制得懸菌液b；⑧取50μl步驟②制得的菌懸液b，加入5-10μl用pbs緩沖液配制的質(zhì)量分數(shù)為0.2％的溶菌酶，35℃水浴50-60min，4000r/min離心10min，棄上清液，制得菌液c；④用含0.6mol/lnacl的pbs緩沖液洗滌步驟⑧制得的菌液c兩遍，6000r/min離心8min，最后重懸于1ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制得粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體，所述粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體濃度為106個細胞/ml；(2)膠紅酵母原生質(zhì)體的制備①將試管活化的膠紅酵母于170r/min，30℃恒溫搖床培養(yǎng)8h，制得菌液d；②取5-10ml步驟①制得的菌液d，4000-8000r/min離心5-10min，收集細胞，用pbs緩沖液洗滌2-3次，并將其重懸于5-10mlpbs緩沖液中，制得菌懸液e；⑧取50μl步驟②制得的菌懸液e，加入0.5-2.5μl混合酶，30℃水浴40min，4000r/min離心10min，棄上清液，制得菌液f；④用含0.6mol/lnacl的pbs緩沖液洗滌步驟⑧制得的菌液f兩遍，4000r/min離心10min，最后重懸于1ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制得膠紅酵母原生質(zhì)體，所述膠紅酵母原生質(zhì)體濃度為106個細胞/ml；(3)粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體的熱滅活取1ml步驟(1)制得的粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體于60℃水浴30-60min，使其滅活率達100％，制得滅活的粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體；(4)膠紅酵母原生質(zhì)體的紫外滅活取1ml步驟(2)制得的膠紅酵母原生質(zhì)體，在20w的紫外燈下，距離10cm照射3-5min，使其滅活率達100％，制得滅活的膠紅酵母原生質(zhì)體；s2：原生質(zhì)體的融合與再生(1)各取1ml滅活的粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體和滅活的膠紅酵母原生質(zhì)體，混合后2000r/min離心5min，制得滅活的原生質(zhì)體混合液g；(2)收集步驟(1)中滅活的原生質(zhì)體混合液g，加入1-5ml原生質(zhì)體融合劑，30℃水浴20min，1000r/min離心5min，棄上層清液，制得初步融合子h；(3)將步驟(2)制得的初步融合子h用1.0mol/l山梨醇水溶液洗滌2次，稀釋并涂布于pda再生培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)4d；s3：原生質(zhì)體融合子的篩選待上述pda再生平板上有菌落長出，該菌落即為粘質(zhì)沙雷氏菌和膠紅酵母的原生質(zhì)體融合子；s4：具有抑菌活性的融合子的篩選對步驟s3制得的原生質(zhì)體融合子通過試管液體濁度法或抑菌圈直徑法篩選，獲得具有抑菌活性的融合子。優(yōu)選的，所述步驟s1中的混合酶用pbs緩沖液配制，其中蝸牛酶質(zhì)量分數(shù)為2％、纖維素酶質(zhì)量分數(shù)為1％。優(yōu)選的，所述步驟s2所述的原生質(zhì)體融合劑配比為：質(zhì)量分數(shù)為25％的peg6000、0.05mol/lcacl2、0.05mol/l甘氨酸。本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明建立了粘質(zhì)沙雷氏菌和膠紅酵母雙親滅活原生質(zhì)體條件，以及基于試管濁度或抑菌圈的篩選方法，能夠快速地獲得具有抑菌活性的目標融合子，且融合子遺傳形狀穩(wěn)定。(2)本發(fā)明優(yōu)化了粘質(zhì)沙雷氏菌和膠紅酵母原生質(zhì)體的制備條件，采用熱滅活和紫外滅活兩種不同的滅活方式以確保融合子的穩(wěn)定性。(3)本發(fā)明所獲得的融合子在生物農(nóng)藥、抗菌藥物篩選、遺傳學等領域有潛在的應用價值。附圖說明圖1為具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞外產(chǎn)物用不同溶劑萃取后對枯草芽孢桿菌(atcc6633)的抑菌活性，其中：1、空白對照，2、正丁醇層，3、乙酸乙酯層，4、石油醚層，5、萬古霉素；圖2為具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞內(nèi)產(chǎn)物用不同溶劑萃取后對枯草芽孢桿菌(atcc6633)的抑菌活性，其中：1、空白對照，2、乙酸乙酯層，3、正丁醇層，4、萬古霉素。具體實施方式以下通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明涉及的菌株：粘質(zhì)沙雷氏菌由中國專利cn102888351b公開的一種靈菌紅素高產(chǎn)菌株及其生產(chǎn)方法獲得。膠紅酵母購自廣東省微生物菌種保藏中心。實施例1、本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基(1)lb培養(yǎng)基的制備分別取蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，將上述蛋白胨、酵母提取物、nacl混合均勻并用蒸餾水定容至1l，即得。(2)pda培養(yǎng)基的制備取200g土豆，去皮，切塊，加水煮沸30min，得到煮沸后的土豆，將上述煮沸后的土豆用雙層紗布過濾，然后加入20g葡萄糖，攪拌溶解，加水至1l，即得。(3)再生培養(yǎng)基的制備分別在lb培養(yǎng)基、pda培養(yǎng)基中加入nacl，至nacl最終濃度為0.6mol/l，制得相應的再生培養(yǎng)基。(4)zr培養(yǎng)基的制備分別取蔗糖0.1g，牛肉浸粉1.23g，nacl0.3g，mgso40.12g，cacl20.10g，將上述組分混合均勻并用蒸餾水定容至100ml，即得。上述lb培養(yǎng)基、pda培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基、zr培養(yǎng)基對應的固體培養(yǎng)基均需加入質(zhì)量濃度為2％的瓊脂粉。實施例2、本發(fā)明涉及的主要試劑(1)pbs緩沖液的制備分別取磷酸二氫鉀8.34g，三水合磷酸氫二鉀0.87g，將上述磷酸二氫鉀和三水合磷酸氫二鉀混合均勻，并用蒸餾水定容至1l，即得pbs緩沖液，所述pbs緩沖液ph＝5.8。(2)原生質(zhì)體穩(wěn)定液的制備向上述pbs緩沖液中加入nacl，至nacl終濃度為0.6mol/l，即得。(3)原生質(zhì)體融合劑的制備原生質(zhì)體融合劑配比為：質(zhì)量分數(shù)為25％的peg6000、0.05mol/lcacl2、0.05mol/l甘氨酸。實施例3、具有抑菌活性的融合子所述具有抑菌活性的融合子的制備方法為：s1：原生質(zhì)體的制備與滅活(1)粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體的制備①粘質(zhì)沙雷氏菌甘油菌株活化過夜，按5％接種量接入30mllb培養(yǎng)基，30℃，200r/min培養(yǎng)4h，制得菌液a；②取8ml步驟①制得的菌液a，6000r/min離心8min，用pbs緩沖液洗滌3次并重懸于6mlpbs緩沖液中，制得懸菌液b；⑧取50μl步驟②制得的菌懸液b，加入6μl用pbs緩沖液配制的質(zhì)量分數(shù)為0.2％的溶菌酶，35℃水浴55min，4000r/min離心10min，棄上清液，制得菌液c；④用含0.6mol/lnacl的pbs緩沖液洗滌步驟⑧制得的菌液c兩遍，6000r/min離心8min，最后重懸于1ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制得粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體，所述粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體濃度為106個細胞/ml；(2)膠紅酵母原生質(zhì)體的制備①將試管活化的膠紅酵母于170r/min，30℃恒溫搖床培養(yǎng)8h，制得菌液d；②取10ml步驟①制得的菌液d，4000r/min離心10min，收集細胞，用pbs緩沖液洗滌2次，收集細胞，并將其重懸于5mlpbs緩沖液中，制得菌懸液e；⑧取50μl步驟②制得的菌懸液e，加入1-2μl混合酶，30℃水浴40min，4000r/min離心10min，棄上清液，制得菌液f，上述混合酶用pbs緩沖液配制，其中含蝸牛酶質(zhì)量份數(shù)2％、纖維素酶質(zhì)量分數(shù)1％；④用含0.6mol/lnacl的pbs緩沖液洗滌步驟⑧制得的菌液f兩遍，4000r/min離心10min，最后重懸于1ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制得膠紅酵母原生質(zhì)體，所述膠紅酵母原生質(zhì)體濃度為106個細胞/ml；(3)粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體的熱滅活取1ml步驟(1)制得的粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體，于60℃水浴50min，使其滅活率達100％，制得滅活的粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體；(4)膠紅酵母原生質(zhì)體的紫外滅活取1ml步驟(2)制得的膠紅酵母原生質(zhì)體，在20w的紫外燈下，距離10cm照射3min，使其滅活率達100％，制得滅活的膠紅酵母原生質(zhì)體；s2：原生質(zhì)體的融合與再生(1)各取1ml滅活的粘質(zhì)沙雷氏菌原生質(zhì)體和滅活的膠紅酵母原生質(zhì)體，混合后2000r/min離心5min，制得滅活的原生質(zhì)體混合液g；(2)收集步驟(1)中滅活的原生質(zhì)體混合液g，加入1.5ml原生質(zhì)體融合劑，30℃水浴20min，1000r/min離心5min，棄上層清液，制得初步融合子h；(3)將步驟(2)制得的初步融合子h用1.0mol/l山梨醇水溶液洗滌2次，稀釋并涂布于pda再生培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)4d；s3：融合子的篩選上述pda再生平板上長出的11個單菌落均為融合子。s4：具有抑菌活性的融合子的篩選通過抑菌圈直徑法，比較上述11個融合子發(fā)酵液用不同溶劑萃取后對枯草芽孢桿菌的相對抑菌活性，獲得對枯草芽孢桿菌抑菌活性相對較高的融合子f7。該融合子f7被命名為rhodotorulamucilaginosasgm。具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞外產(chǎn)物用不同溶劑萃取后對枯草芽孢桿菌(atcc6633)的抑菌活性如圖1所示，由圖1可知，rhodotorulamucilaginosasgm胞外產(chǎn)物用正丁醇、乙酸乙酯萃取后對枯草芽孢桿菌抑菌活性較強；具有抑菌活性的融合子rhodotorulamucilaginosasgm胞內(nèi)產(chǎn)物用不同溶劑萃取后對枯草芽孢桿菌(atcc6633)的抑菌活性如圖2所示，由圖2可知rhodotorulamucilaginosasgm胞內(nèi)產(chǎn)物用乙酸乙酯、正丁醇萃取后對枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌活性。試驗例1、具有抑菌活性的融合子的同源性分析1.試驗材料：實施例3制備的具有抑菌活性的融合子。2.試驗方法：細菌16srrna測序引物27f/1492r，真菌its區(qū)測序引物為its4/its5。(1)pcr反應體系為：模板dna(5ng/μl)2μl，引物(10μm)各0.4μl，dntp(2.5mm)0.4μl，taq酶(5u/μl)0.25μl，雙蒸水補至20μl。(2)擴增條件為：95℃預變性3min；每個循環(huán)條件為：94℃變性1min，52℃退火50s，72℃延伸50s，35個循環(huán)。產(chǎn)物末端72℃延伸10min，pcr產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。(3)經(jīng)測序獲得1462bp的16srrna擴增產(chǎn)物(genbank：ky542118.1)和640bp的rrna擴增產(chǎn)物(genbank：ky488461)。3.試驗結果：(1)對獲得的16srrna片段序列進行同源性比較，結果表明，融合子與數(shù)據(jù)庫中的serratiamarcescenssubsp.sakuensisstrainkred(accessionno.nr036886.1)、serratianematodiphilastraindz0503sbs1(accessionno.nr044385.1)具有約96％的同源性(querycoverage為99％，maxident為96％，e為0.0)，證明親本之一為沙雷氏菌。(2)對獲得的its區(qū)基因序列進行同源性比較，結果表明，融合子與數(shù)據(jù)庫中的紅酵母rhodotorulasp.lh51(accessionno.hq832802.1)、膠紅酵母rhodotorulamucilaginosastrainuoa/hcpf10538(accessionno.hq702343.1)等具有100％的同源性(querycoverage為100％，maxident為100％，e為0.0)，表明親本之一為膠紅酵母。試驗例2、具有抑菌活性的融合子的遺傳穩(wěn)定性檢驗1.試驗材料：實施例3制備的具有抑菌活性的融合子。2.試驗方法：將實施例3制備的具有抑菌活性的融合子在pda固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，14d傳代一次，連續(xù)傳代15次后觀察融合子的形態(tài)，并檢測融合子乙醇提取物的抑菌活性，及細胞內(nèi)總蛋白的表達情況。3.試驗結果：融合子乙醇提取物的抑菌活性及細胞內(nèi)總蛋白的表達均沒有產(chǎn)生顯著的變化，證明融合子遺傳相對穩(wěn)定。試驗例3、具有抑菌活性的融合子的生化特性檢驗1.試驗材料：實施例3制備的具有抑菌活性的融合子。2.試驗方法：(1)采用生物顯微鏡觀察具有抑菌活性的融合子在3種不同培養(yǎng)基上菌落邊緣生長特點以及菌落的質(zhì)地、顏色和表面結構。(2)采用100×10的油鏡觀察具有抑菌活性的融合子、粘質(zhì)沙雷氏菌、膠紅酵母的形態(tài)和運動性，采用透射電鏡觀察具有抑菌活性的融合子、粘質(zhì)沙雷氏菌、膠紅酵母的直徑、鞭毛結構、莢膜結構和增殖方式。(3)具有抑菌活性的融合子的各種氮源、碳源同化研究。3.試驗結果：(1)生物顯微鏡觀察結果如表1所示表1具有抑菌活性的融合子在3種不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)培養(yǎng)基濕潤突起顏色表面pda是否淡粉至粉紅光滑、粘稠zr否是淡粉至粉紅光滑、粘稠lb否是淡粉至粉紅光滑、粘稠由表1可知，本發(fā)明制得的具有抑菌活性的融合子在pda、zr、lb培養(yǎng)基上的顏色均呈淡粉至粉紅色，表面光滑、粘稠。本發(fā)明制得的具有抑菌活性的融合子在pda培養(yǎng)基上濕潤且無突起，在zr、lb培養(yǎng)基上不濕潤且突起。(2)100×10的油鏡、透射電鏡觀察結果如表2所示：表2具有抑菌活性的融合子、粘質(zhì)沙雷氏菌、膠紅酵母的菌體結構比較由表2可知，本發(fā)明制得的具有抑菌活性的融合子菌體呈圓形或橢圓形，直徑2.5～5μm，增殖方式大多單極芽殖，無運動性，無鞭毛。(3)具有抑菌活性的融合子的各種氮源、碳源同化研究結果如表3所示：表3具有抑菌活性的融合子的各種氮源、碳源同化性質(zhì)硫酸銨+硝酸鉀+尿素-甘氨酸+檸檬酸(+)葡萄糖+蔗糖+乙醇+半乳糖+甘油(+)山梨醇-甲醇-肌醇-乳糖-表3中“+”表示陽性，“-”表示陰性，“(+)”表示遲緩陽性。由表3可知，本發(fā)明制得的具有抑菌活性的融合子在硫酸銨、葡萄糖、硝酸鉀、蔗糖、甘氨酸、半乳糖、乙醇中同化性質(zhì)表現(xiàn)為陽性，在尿素、山梨醇、甲醇、肌醇、乳糖中同化性質(zhì)表現(xiàn)為陰性，在甘油和檸檬酸中同化性質(zhì)表現(xiàn)為遲緩陽性。試驗例4、具有抑菌活性的融合子的抑菌譜1.試驗材料：實施例3制備的具有抑菌活性的融合子。2.試驗方法：將實施例3制備的具有抑菌活性的融合子制成發(fā)酵液浸膏，取10mg制得的發(fā)酵液浸膏并將其溶解于1ml質(zhì)量濃度為30％的乙醇中，制得混合液，用質(zhì)量濃度為30％的乙醇分別將上述混合液稀釋為5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml三個不同濃度梯度，用質(zhì)量濃度為30％的乙醇做空白對照，分別使用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、土曲霉作為受試菌，采用濾紙片法，測量并記錄抑菌圈直徑大小。3.試驗結果：具有抑菌活性的融合子對不同致病菌的抑制作用如表4所示。表4具有抑菌活性的融合子對不同致病菌的抑制作用注：“-”表示沒有抑菌圈由表4可知，本發(fā)明制得的具有抑菌活性的融合子對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌具有較強的抑菌作用，且其抑菌作用隨發(fā)酵液浸膏濃度增大而增強，由此說明本發(fā)明提供的具有抑菌活性的融合子，在生物農(nóng)藥、抗菌藥物篩選、遺傳學等領域具有潛在應用價值。當前第1頁12