本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種納豆激酶菌劑的制備及使用方法。
背景技術(shù)：
納豆激酶(nattokinase簡(jiǎn)稱nk)是一種枯草桿菌蛋白激酶，是在納豆發(fā)酵過程中由納豆枯草桿菌(bacillussubtilislnatto)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，于1980年在納豆中被發(fā)現(xiàn)，由275個(gè)氨基酸按照固定排列方式組成，分子量是27724，有分解血栓的獨(dú)特功能。納豆激酶具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循環(huán)，軟化和增加血管彈性等作用。
納豆激酶菌劑的制備可實(shí)現(xiàn)納豆小規(guī)模速釀生產(chǎn)，使納豆成為價(jià)廉易制的保健食品。因此，納豆激酶菌劑的制備對(duì)于家庭化制備食用納豆以及納豆的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。但是，現(xiàn)有納豆激酶菌劑的制備方法的原料投入產(chǎn)出比較低、發(fā)酵得到的納豆激酶活性不高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種納豆激酶菌劑的制備及使用方法，提高發(fā)酵產(chǎn)物納豆激酶的活性。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種納豆激酶菌劑的制備方法，包括以下步驟：
s1.準(zhǔn)備原料：原料包括下述質(zhì)量百分比含量的組分：2-18%的納豆激酶產(chǎn)生菌、20-30%的葡萄糖、4-15%的大豆分離蛋白、5-12%的l-絲氨酸、2-6%的l-半胱氨酸和25-50%的麥芽糊精；
s2.菌種活化：制備濃度為0.7×106-1.3×106cfu/ml的納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液，按照1-5%的體積比取納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液接種于20~50ml活化培養(yǎng)基中活化，在30-38℃、100-200r/min的條件下培養(yǎng)18-24h；
s3.擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的液體培養(yǎng)物按照1-3%的體積比例接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30-38℃、100-200r/min的條件下培養(yǎng)18-24h；
s4.離心取菌體：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物在3-5℃、8000-10000r/min的條件下離心10-15min，然后去掉上清液，剩下部分即為菌體；
s5.復(fù)配：將原料中的全部葡萄糖、全部l-絲氨酸、全部l-半胱氨酸、30-70%的大豆分離蛋白和15-35%的麥芽糊精混合均勻得到第一粉劑，將所述菌體與原料中剩余的大豆分離蛋白和2/3的麥芽糊精混合均勻得到第二粉劑。
優(yōu)選的，所述制備方法在復(fù)配后還包括一個(gè)干燥步驟：采用減壓干燥法將第二粉劑進(jìn)行干燥。
優(yōu)選的，所述減壓干燥法的具體步驟為：將所述第二粉劑平鋪于干燥器皿中，然后在真空度為40-50kpa、溫度為50-65℃的條件下真空減壓干燥3-5h。
優(yōu)選的，所述第二粉劑的平鋪厚度小于等于1cm。
優(yōu)選的，所述活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
優(yōu)選的，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的ph值為7.2-7.6，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基包括蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水，所述蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水的質(zhì)量比例為9-11：2-4：4-6：0.004-0.006：900-1100。
優(yōu)選的，所述納豆激酶產(chǎn)生菌為枯草芽胞桿菌枯草亞種。
優(yōu)選的，所述納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液由納豆激酶產(chǎn)生菌和生理鹽水混合制得。
如上述制備方法制得的納豆激酶菌劑的使用方法，包括：
將黃豆煮熟，瀝去水分，晾涼；
取質(zhì)量為黃豆0.4-0.6%的納豆激酶菌劑，所述納豆激酶菌劑包括質(zhì)量比為1.5-2.5：1的第一粉劑和第二粉劑，先將第一粉劑拌入黃豆，攪拌均勻后再將第二粉劑拌入黃豆；
拌勻后將黃豆置于納豆機(jī)中，發(fā)酵16-22h得到納豆；
將所述納豆置于3-5℃的環(huán)境下冷藏9-11h進(jìn)行后熟。
優(yōu)選的，所述使用方法還包括：在將黃豆煮熟前，將黃豆浸泡10h或以上。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)復(fù)配形成高酶活性菌劑，提升原料投入產(chǎn)出比，得到的納豆激酶菌劑的發(fā)酵產(chǎn)物納豆激酶的活性高。
具體實(shí)施方式
下面進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。
【實(shí)施例一】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的制備方法，包括以下步驟：
s1.準(zhǔn)備原料：原料包括下述質(zhì)量百分比含量的組分：10.5%的納豆激酶產(chǎn)生菌、28%的葡萄糖、10%的大豆分離蛋白、9.8%的l-絲氨酸、4.2%的l-半胱氨酸和37.5%的麥芽糊精。
s2.菌種活化：將納豆激酶產(chǎn)生菌和生理鹽水混合，制備濃度為1×106cfu/ml的納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液，按照2%的體積比取納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液接種于20ml活化培養(yǎng)基中活化，在36℃、120r/min的條件下培養(yǎng)24h；取納豆激酶產(chǎn)生菌接種于20ml活化培養(yǎng)基中活化，在36℃、120r/min的條件下培養(yǎng)24h；所述活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
s3.擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的液體培養(yǎng)物按照1.7%的體積比例接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在36℃、120r/min的條件下培養(yǎng)24h；所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的ph值為7.4，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基包括蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水，所述蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水的質(zhì)量比例為10：3：5：0.005：1000。
s4.離心取菌體：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物在4℃、10000r/min的條件下離心10min，然后去掉上清液，剩下部分即為菌體。
s5.復(fù)配：將原料中的全部葡萄糖、全部l-絲氨酸、全部l-半胱氨酸、50%的大豆分離蛋白和20%的麥芽糊精混合均勻得到第一粉劑，將所述菌體與原料中剩余的大豆分離蛋白和剩余的麥芽糊精混合均勻得到第二粉劑。
所述制備方法在復(fù)配后還包括一個(gè)干燥步驟：采用減壓干燥法將第二粉劑進(jìn)行干燥。所述減壓干燥法的具體步驟為：將所述第二粉劑平鋪于干燥器皿中，所述第二粉劑的平鋪厚度為0.8cm，然后在真空度為45kpa、溫度為60℃的條件下真空減壓干燥4h。
所述納豆激酶產(chǎn)生菌為枯草芽胞桿菌枯草亞種，購買自cicc（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心），菌株編號(hào)：21076。
【實(shí)施例二】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的制備方法，包括以下步驟：
s1.準(zhǔn)備原料：原料包括下述質(zhì)量百分比含量的組分：2%的納豆激酶產(chǎn)生菌、20%的葡萄糖、10%的大豆分離蛋白、12%的l-絲氨酸、6%的l-半胱氨酸和50%的麥芽糊精；
s2.菌種活化：將納豆激酶產(chǎn)生菌和生理鹽水混合，制備濃度為1×106cfu/ml的納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液，按照1%的體積比取納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液接種于25ml活化培養(yǎng)基中活化，在30℃、100r/min的條件下培養(yǎng)18h；所述活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
s3.擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的液體培養(yǎng)物按照1%的體積比例接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30℃、100r/min的條件下培養(yǎng)18h；所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的ph值為7.3，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基包括蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水，所述蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水的質(zhì)量比例為9：2：4：0.004：900。
s4.離心取菌體：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物在3℃、8000r/min的條件下離心10min，然后去掉上清液，剩下部分即為菌體。
s5.復(fù)配：將原料中的全部葡萄糖、全部l-絲氨酸、全部l-半胱氨酸、60%的大豆分離蛋白和30%的麥芽糊精混合均勻得到第一粉劑，將所述菌體與原料中剩余的大豆分離蛋白和剩余的麥芽糊精混合均勻得到第二粉劑。
所述制備方法還包括：干燥：采用減壓干燥法將第二粉劑進(jìn)行干燥。所述減壓干燥法的具體步驟為：將所述第二粉劑平鋪于干燥器皿中，所述第二粉劑的平鋪厚度為1cm，然后在真空度為40kpa、溫度為50℃的條件下真空減壓干燥3h。
所述納豆激酶產(chǎn)生菌為枯草芽胞桿菌枯草亞種，購買自cicc（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心），菌株編號(hào)：21076。
【實(shí)施例三】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的制備方法，包括以下步驟：
s1.準(zhǔn)備原料：原料包括下述質(zhì)量百分比含量的組分：18%的納豆激酶產(chǎn)生菌、30%的葡萄糖、15%的大豆分離蛋白、10%的l-絲氨酸、2%的l-半胱氨酸和25%的麥芽糊精；
s2.菌種活化：將納豆激酶產(chǎn)生菌和生理鹽水混合，制備濃度為1×106cfu/ml的納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液，按照2%的體積比取納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液接種于30ml活化培養(yǎng)基中活化，在38℃、200r/min的條件下培養(yǎng)24h；所述活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
s3.擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的液體培養(yǎng)物按照3%的體積比例接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30℃、100r/min的條件下培養(yǎng)18h；所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的ph值為7.5，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基包括蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水，所述蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水的質(zhì)量比例為11：4：6：0.006：1100。
s4.離心取菌體：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物在5℃、10000r/min的條件下離心15min，然后去掉上清液，剩下部分即為菌體。
s5.復(fù)配：將原料中的全部葡萄糖、全部l-絲氨酸、全部l-半胱氨酸、65%的大豆分離蛋白和15%的麥芽糊精混合均勻得到第一粉劑，將所述菌體與原料中剩余的大豆分離蛋白和剩余的麥芽糊精混合均勻得到第二粉劑。
所述制備方法還包括：干燥：采用減壓干燥法將第二粉劑進(jìn)行干燥。所述減壓干燥法的具體步驟為：將所述第二粉劑平鋪于干燥器皿中，所述第二粉劑的平鋪厚度為0.9cm，然后在真空度為50kpa、溫度為65℃的條件下真空減壓干燥5h。
所述納豆激酶產(chǎn)生菌為枯草芽胞桿菌枯草亞種，購買自cicc（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心），菌株編號(hào)：21076。
【實(shí)施例四】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的制備方法，包括以下步驟：
s1.準(zhǔn)備原料：原料包括下述質(zhì)量百分比含量的組分：12%的納豆激酶產(chǎn)生菌、25%的葡萄糖、4%的大豆分離蛋白、5%的l-絲氨酸、4%的l-半胱氨酸和50%的麥芽糊精；
s2.菌種活化：將納豆激酶產(chǎn)生菌和生理鹽水混合，制備濃度為0.7×106cfu/ml的納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液，按照5%的體積比取納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液接種于50ml活化培養(yǎng)基中活化，在35℃、150r/min的條件下培養(yǎng)20h；所述活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
s3.擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的液體培養(yǎng)物按照2%的體積比例接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在35℃、150r/min的條件下培養(yǎng)20h；所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的ph值為7.2，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基包括蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水，所述蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水的質(zhì)量比例為10：3：5：0.005：1000。
s4.離心取菌體：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物在4℃、9000r/min的條件下離心13min，然后去掉上清液，剩下部分即為菌體。
s5.復(fù)配：將原料中的全部葡萄糖、全部l-絲氨酸、全部l-半胱氨酸、30%的大豆分離蛋白和35%的麥芽糊精混合均勻得到第一粉劑，將所述菌體與原料中剩余的大豆分離蛋白和剩余的麥芽糊精混合均勻得到第二粉劑。
所述制備方法還包括：干燥：采用減壓干燥法將第二粉劑進(jìn)行干燥。所述減壓干燥法的具體步驟為：將所述第二粉劑平鋪于干燥器皿中，所述第二粉劑的平鋪厚度為0.8cm，然后在真空度為45kpa、溫度為60℃的條件下真空減壓干燥4h。
所述納豆激酶產(chǎn)生菌為枯草芽胞桿菌枯草亞種，購買自cicc（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心），菌株編號(hào)：21076。
【實(shí)施例五】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的制備方法，包括以下步驟：
s1.準(zhǔn)備原料：原料包括下述質(zhì)量百分比含量的組分：13%的納豆激酶產(chǎn)生菌、26%的葡萄糖、6%的大豆分離蛋白、7%的l-絲氨酸、5%的l-半胱氨酸和43%的麥芽糊精；
s2.菌種活化：將納豆激酶產(chǎn)生菌和生理鹽水混合，制備濃度為1.3×106cfu/ml的納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液，按照3%的體積比取納豆激酶產(chǎn)生菌菌懸液接種于20ml活化培養(yǎng)基中活化，在36℃、130r/min的條件下培養(yǎng)21h；所述活化培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
s3.擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化后的液體培養(yǎng)物按照2%的體積比例接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在38℃、200r/min的條件下培養(yǎng)24h；所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的ph值為7.6，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基包括蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水，所述蛋白胨、牛肉膏、nacl、mnso4·h2o和蒸餾水的質(zhì)量比例為10：3：5：0.005：1100。
s4.離心取菌體：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)物在4℃、9000r/min的條件下離心13min，然后去掉上清液，剩下部分即為菌體。
s5.復(fù)配：將原料中的全部葡萄糖、全部l-絲氨酸、全部l-半胱氨酸、70%的大豆分離蛋白和33%的麥芽糊精混合均勻得到第一粉劑，將所述菌體與原料中剩余的大豆分離蛋白和剩余的麥芽糊精混合均勻得到第二粉劑。
所述制備方法還包括：干燥：采用減壓干燥法將第二粉劑進(jìn)行干燥。所述減壓干燥法的具體步驟為：將所述第二粉劑平鋪于干燥器皿中，所述第二粉劑的平鋪厚度為0.7cm，然后在真空度為45kpa、溫度為60℃的條件下真空減壓干燥4h。
所述納豆激酶產(chǎn)生菌為枯草芽胞桿菌枯草亞種，購買自cicc（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心），菌株編號(hào)：21076。
【實(shí)施例六】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的使用方法，包括：
將黃豆浸泡11h；
將豆黃豆煮熟，瀝去水分，晾涼；
取質(zhì)量為黃豆0.5%的納豆激酶菌劑，所述納豆激酶菌劑包括質(zhì)量比為2：1的第一粉劑和第二粉劑，先將第一粉劑拌入黃豆，攪拌均勻后再將第二粉劑拌入黃豆；
拌勻后將黃豆置于納豆機(jī)中，發(fā)酵18h得到納豆；
將所述納豆置于4℃的環(huán)境下冷藏10h進(jìn)行后熟。
本實(shí)施例與實(shí)施例一制備的納豆激酶菌劑結(jié)合，發(fā)酵得到的納豆用紫外分光光度法測(cè)得產(chǎn)品納豆激酶酶活為72280u/g。
【實(shí)施例七】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的使用方法，包括：
將黃豆浸泡10h；
將黃豆煮熟，瀝去水分，晾涼；
取質(zhì)量為黃豆0.4%的納豆激酶菌劑，所述納豆激酶菌劑包括質(zhì)量比為1.5：1的第一粉劑和第二粉劑，先將第一粉劑拌入黃豆，攪拌均勻后再將第二粉劑拌入黃豆；
拌勻后將黃豆置于納豆機(jī)中，發(fā)酵16h得到納豆；
將所述納豆置于3℃的環(huán)境下冷藏10h進(jìn)行后熟。
本實(shí)施例與實(shí)施例二制備的納豆激酶菌劑結(jié)合，發(fā)酵得到的納豆用紫外分光光度法測(cè)得產(chǎn)品納豆激酶酶活為65260u/g。
【實(shí)施例八】該實(shí)施例描述了一種納豆激酶菌劑的使用方法，包括：
將黃豆浸泡12h；
將黃豆煮熟，瀝去水分，晾涼；
取質(zhì)量為黃豆0.6%的納豆激酶菌劑，所述納豆激酶菌劑包括質(zhì)量比為2.5：1的第一粉劑和第二粉劑，先將第一粉劑拌入黃豆，攪拌均勻后再將第二粉劑拌入黃豆；
拌勻后將黃豆置于納豆機(jī)中，發(fā)酵22h得到納豆；
將所述納豆置于5℃的環(huán)境下冷藏11h進(jìn)行后熟。
本實(shí)施例與實(shí)施例三制備的納豆激酶菌劑結(jié)合，發(fā)酵得到的納豆用紫外分光光度法測(cè)得產(chǎn)品納豆激酶酶活為71390u/g。
盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。