本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
納豆芽孢桿菌(bacillusnatto)是從日本傳統(tǒng)食品中分離出來(lái)的菌種,其原始菌株與枯草芽孢桿菌相同,是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種。納豆芽孢桿菌不僅具有分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)的性能,使發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸、有機(jī)酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的成分,而且在發(fā)酵過(guò)程中在發(fā)現(xiàn)了一些生理活性物質(zhì)而使納豆具有多種保健功能,如抗腫瘤、降血壓、抗菌等作用,還可預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高蛋白質(zhì)的消化率、抗氧化等。最主要的是，納豆菌能產(chǎn)生具有溶栓活性的納豆激酶,而且在酸性胃環(huán)境中能保持高度的穩(wěn)定性。因此，對(duì)于納豆芽孢桿菌的研究市場(chǎng)前景仍非常廣闊。
納豆激酶具有很強(qiáng)的溶解血栓功能,與目前臨床所用的尿激酶、鏈激酶等溶栓藥物相比，具有安全性好，易被人體吸收，作用直接迅速，藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可由納豆枯草芽抱桿菌直接發(fā)酵生產(chǎn)因而造價(jià)低廉等優(yōu)點(diǎn)。因此，納豆激酶是一種很有潛力的新型溶栓藥物。納豆激酶的發(fā)酵工藝一般分為兩種，分別為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。相比較于固態(tài)發(fā)酵易染菌、難散熱、回收率低、氣味難以接受、很難滿足嚴(yán)格藥品特別是生物制劑的生產(chǎn)要求等問(wèn)題。液體發(fā)酵具有成本低廉、純度高、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此，本實(shí)驗(yàn)室仍采用傳統(tǒng)的液體發(fā)酵的方式，但在發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，極大地節(jié)約了成本，并且提高了納豆激酶的生產(chǎn)效率和酶活。目前用于產(chǎn)納豆激酶的菌株有保加利亞乳桿菌（lactobacillusbulgaricus）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）、鏈霉菌（streptomyces）、乳酸菌(lacticacidbacteria）、大腸桿菌（escherichiacoli）、巴斯德畢赤酵母（pichiapastoris）等。在液體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶中，其副產(chǎn)物中含有部分的嘌呤的產(chǎn)生。目前，專利201110099838.7《一種產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌及該菌種發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的方法》中記載，獲得的納豆激酶酶活最高達(dá)到5670fu/g。通常情況下，納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的時(shí)間為72h左右。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種高分泌納豆激酶枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。該枯草芽孢桿菌的納豆激酶活性高,且可有效利用木糖母液等物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶，降低生產(chǎn)成本且安全環(huán)保。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種高分泌納豆激酶枯草芽孢桿菌，所述菌株的分類命名為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061，已于2017年3月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為cgmccno.13932。
所述菌株是通過(guò)如下方法篩選得到的：從市面上買來(lái)的納豆產(chǎn)品中分離得到五株枯草芽孢桿菌，利用液態(tài)lb培養(yǎng)基進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)，35℃培養(yǎng)1天之后，同時(shí)測(cè)定生物量和納豆激酶的分泌量，得到一株活力最為旺盛的菌株，命名為best-1，作為優(yōu)勢(shì)菌株。
將best-1接于液態(tài)lb種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌的菌液按10倍稀釋法稀釋至細(xì)胞數(shù)為109/ml，取菌液0.1ml均勻涂于無(wú)菌的空平板中，待風(fēng)干后進(jìn)行n+離子束注入，n+離子束注入劑量為(95、140、185、230、275)×2.6×1013n+/cm2，n+離子束注入能量為15kev。輻照結(jié)束后用1ml無(wú)菌水洗滌細(xì)胞，按10倍稀釋法稀釋后涂入平板培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)1d，待挑取單菌落，搖瓶檢測(cè)，篩選出菌落生長(zhǎng)速度快且納豆激酶分泌率最高的菌株，命名為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061。
所述枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061的培養(yǎng)條件為：
菌種采用好氧培養(yǎng)的方式，用于培養(yǎng)該菌株的碳源可以是葡萄糖，蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、木糖母液等材料；用于培養(yǎng)該菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣等材料。該菌株生長(zhǎng)的最佳溫度范圍為25-58℃，ph范圍5-9，最佳ph范圍為6-8。在菌株培養(yǎng)過(guò)程中還可添加磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸鎂、硫酸錳、氯化亞鐵等無(wú)機(jī)鹽類。
所述枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061的生理形態(tài)特征為：
枯草芽胞桿菌，在lb平板上生長(zhǎng)旺盛，明顯觀察到單菌落著色均勻，且芽孢呈現(xiàn)橢圓形或柱狀，孢囊膨大，有鞭毛，顏色呈乳白色。孢子耐熱性強(qiáng)。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。
所述的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061在液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶中的應(yīng)用。包括如下步驟：
1）種子培養(yǎng)：從活化的平板上取一環(huán)菌接入液體種子培養(yǎng)基中，25-58℃培養(yǎng)11h；
2）取步驟1）的種子液接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為2.5%，培養(yǎng)溫度為25℃~58℃，液體發(fā)酵。
步驟1）中所述液體種子培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量百分比的組分：碳源10～50g/l，氮源15～35g/l，無(wú)機(jī)鹽0～1g/l,其余為水，ph5.5～8.0。其中所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、木糖母液等中的至少一種；所述氮源選自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、全豆粉、豆渣、胰蛋白胨等中的至少一種，所述無(wú)機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸鎂、硫酸錳、氯化亞鐵中的至少一種。
最優(yōu)選的生產(chǎn)方式為：將菌株活化后，在37℃下好氧發(fā)酵在25～58℃下好氧發(fā)酵24-60h，裝液量為80ml發(fā)酵液/500ml三角瓶，轉(zhuǎn)速為180rpm。
其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為：木糖母液15g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo43h2o1.2g/l，kh2po41.6g/l，mgso47h2o0.45g/l,cacl20.21g/l,mnso40.001g/l，fecl20.002g/l，其余為水，ph=7。
有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)：
1.與其他菌種相比，本發(fā)明的納豆芽孢桿菌具有很高的代謝活力，在高溫條件下產(chǎn)酶高，發(fā)酵周期明顯的縮短，從原來(lái)的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)96小時(shí)縮短了36小時(shí)，發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶活性高。
2.與傳統(tǒng)的液體發(fā)酵法相比，該菌株發(fā)酵可利用木糖母液，從成本上來(lái)說(shuō)，得到了很大幅度的降低，而且可以減少?gòu)U料的排放，在節(jié)約成本的同時(shí)，降低環(huán)境污染。
具體實(shí)施方式
通過(guò)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料比，工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書說(shuō)所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061的誘變篩選
從市面上買來(lái)的納豆產(chǎn)品中分離得到五株枯草芽孢桿菌，利用液態(tài)lb培養(yǎng)基進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)1天之后，同時(shí)測(cè)定生物量和納豆激酶的分泌量，得到一株活力最為旺盛的菌株，命名為best-1，作為優(yōu)勢(shì)菌株。
將best-1接于液態(tài)lb種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌的菌液按10倍稀釋法稀釋至細(xì)胞數(shù)為109/ml，取菌液0.1ml均勻涂于無(wú)菌的空平板中，待風(fēng)干后進(jìn)行n+離子束注入，n+離子束注入劑量為(95、140、185、230、275)×2.6×1013n+/cm2，n+離子束注入能量為15kev。輻照結(jié)束后用1ml無(wú)菌水洗滌細(xì)胞，按10倍稀釋法稀釋后涂入平板培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)1d，待挑取單菌落，搖瓶檢測(cè)，篩選出菌落生長(zhǎng)速度快且納豆激酶分泌率最高的菌株，命名為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061。
實(shí)施例2枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061的培養(yǎng)及生理學(xué)特征
菌種采用好氧培養(yǎng)的方式。用于培養(yǎng)該菌株的碳源可以是葡萄糖，蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉等材料；用于培養(yǎng)該菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、全豆粉、豆渣等材料。該菌株生長(zhǎng)的最佳溫度范圍為25-50℃，ph范圍5-9，最佳ph范圍為6-8。在菌株培養(yǎng)過(guò)程中還可添加磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，磷酸鎂等無(wú)機(jī)鹽類。
所述枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061的生理形態(tài)特征為：
枯草芽胞桿菌，在lb平板上生長(zhǎng)旺盛，明顯觀察到單菌落著色均勻，且芽孢呈現(xiàn)橢圓形或柱狀，孢囊膨大，有鞭毛，顏色呈乳白色。孢子耐熱性強(qiáng)。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。
實(shí)施例3枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶
平板培養(yǎng)基：蛋白胨15g/l，酵母膏7.5g/l，nacl15g/l，瓊脂20g/l，ph自然。
好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖母液15g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo43h2o1.2g/l，kh2po41.6g/l，mgso47h2o0.45g/l,cacl20.21g/l,mnso40.001g/l，fecl20.002g/l，其余為水，初始ph7.4。500ml三角瓶裝液量80ml，121℃滅菌20分鐘。木糖母液購(gòu)買自巨鹿縣威科食品廠。
分別將初始菌株及cgmccno.13932菌首先于35℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入80ml發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃，180rpm培養(yǎng)11h，然后按照2.5%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入裝液量為80ml發(fā)酵液/500ml三角瓶，35℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180rpm。發(fā)酵60h后cgmccno.13932的發(fā)酵液產(chǎn)納豆激酶為11710.5fu/g較初始菌株相比，納豆激酶產(chǎn)量提高了4.61倍。
實(shí)施例4枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶
好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖母液15g/l，k2hpo43h2o1.2g/l，蛋白胨20g/l，kh2po41.6g/l，mgso47h2o0.45g/l,cacl20.21g/l,mnso40.001g/l，fecl20.002g/l，其余為水，ph=7.4。7l發(fā)酵罐裝液量3l，121℃滅菌20分鐘。
分別將初始菌株cgmccno.13932菌首先于35℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入80ml發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃，180rpm培養(yǎng)11h，然后按照8%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入3l發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣1.1v/vm，轉(zhuǎn)速300rpm，35℃培養(yǎng)。發(fā)酵24h后cgmccno.13932的發(fā)酵產(chǎn)酶為14644.5fu/g。較初始菌株相比，納豆激酶的產(chǎn)酶量提高了5.78倍。
實(shí)施例5枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)gs-11061高溫條件下發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶
好氧發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖母液15g/l，蛋白胨20g/l，k2hpo43h2o1.2g/l，kh2po41.6g/l，mgso47h2o0.45g/l,cacl20.21g/l,mnso40.001g/l，fecl20.002g/l其余為水，ph=7.4。7l發(fā)酵罐裝液量3l，121℃滅菌20分鐘。
分別將初始菌株cgmccno.13932菌首先于58℃平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入80ml發(fā)酵培養(yǎng)基，58℃，180rpm培養(yǎng)11h，然后按照8%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入3l發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣1.1v/vm，轉(zhuǎn)速300rpm，58℃培養(yǎng)。發(fā)酵13h時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌水500ml,發(fā)酵20h結(jié)束后cgmccno.13932的發(fā)酵產(chǎn)酶為10672.5fu/g。較初始菌株相比，納豆激酶的產(chǎn)酶量提高了4.21倍，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)縮短了40小時(shí)。較傳統(tǒng)液態(tài)發(fā)酵周期時(shí)長(zhǎng)相比，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)至少縮短了48小時(shí)。
納豆激酶的檢測(cè)方法：取0.7ml50mmol·l-1tris-hcl(ph8.0)緩沖液與0.2ml0.72%(w·v-1)的纖維蛋白原溶液混勻后，37℃放置5min。向上述溶液中加入0.1ml凝血酶溶液(20u·ml-1)充分混勻，37℃放置10min。再向上述反應(yīng)體系中加入0.05ml稀釋的酶液充分混勻，于37℃水浴中保溫反應(yīng)，分別在反應(yīng)開始后的20min和40min時(shí)，分別混勻10s。在準(zhǔn)確計(jì)時(shí)60min后加入1ml0.2mol·l-1的三氯乙酸終止反應(yīng)，并在37℃水浴中再保溫20min。上述反應(yīng)液于15000r·min-1下離心10min，測(cè)定離心上清液在275nm處的吸光值。一個(gè)酶活力單位(fu)定義為在37℃，ph8.0的條件下，每分鐘在275nm處吸光值變化0.01所需的酶量。
比酶活定義：每mg蛋白所含的酶活力單位數(shù)，即比活力=活力fu·mg-1蛋白。