本發(fā)明屬于環(huán)境有機污染物生物處理技術領域，具體涉及一株去氫孕酮降解菌及其應用。

背景技術：

去氫孕酮是一種人工合成孕激素，比天然孕激素具有更強的選擇性和生物利用率，廣泛應用于人類疾病治療(如不孕不育、先兆流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)、月經(jīng)失調(diào)、子宮內(nèi)膜異位等)以及規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖(如誘導同期排卵、預防流產(chǎn)及促進生長等)。由于廢水處理設施不完善及傳統(tǒng)處理工藝效果有限，污水處理廠及規(guī)?；B(yǎng)豬場周邊受納環(huán)境、地下水中普遍檢出去氫孕酮物質(zhì)，濃度范圍為2～2188ng/l(liuss,yinggg,lius.analysisof21progestagensinvariousmatricesbyultra-high-performanceliquidchromatographytandemmassspectrometry(uhplc-ms/ms)withdiversesamplepretreatment.anal.bioanal.chem.2014,406(28),7299-7311.)。去氫孕酮作為一種內(nèi)分泌干擾物，具有高生物活性，在ng/l的水平就可表現(xiàn)出對水生生物(如斑馬魚)的毒性作用，微觀作用包括改變基因表達、影響類固醇生成酶的活性，宏觀表現(xiàn)為損害生殖能力、影響性器官成熟及正常形態(tài)、改變晝夜節(jié)律(zhaoyn,castiglionis,fentk.syntheticprogestinsmedroxyprogesteroneacetateanddydrogesteroneandtheirbinarymixturesadverselyaffectreproductionandleadtohistologicalandtranscriptionalalterationsinzebrafish(daniorerio).environ.sci.technol.2015,49,4636-4645.)。人類與斑馬魚的基因相似度高達87％，兩者的生理學特征相似，所以去氫孕酮對人類的潛在危害不容小覷。因此，尋求高效防治去氫孕酮污染技術對人類健康和生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義。

環(huán)境孕激素近幾年才引起人們的關注，其降解去除研究還處于起步階段，關于去氫孕酮的去除更是少見，幾乎空白。盡管污水處理廠和規(guī)?；B(yǎng)殖場傳統(tǒng)的污水處理設施對去氫孕酮有一定的去除效果，然而周邊受納環(huán)境及地下水中頻繁檢出去氫孕酮等孕激素物質(zhì)，表明缺乏一種有針對性的去除這類新型有機污染物的方法。綜合考慮環(huán)境和經(jīng)濟因素，微生物降解被認為是目前去除環(huán)境中有機物最經(jīng)濟綠色的方法。國內(nèi)外暫未見關于菌株降解去氫孕酮的報道，亟需開展相關研究。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株去氫孕酮降解菌。該菌能高效、快速降解去氫孕酮物質(zhì)。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述去氫孕酮降解菌的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供一株去氫孕酮降解菌，菌種命名為芽孢桿菌(bacillussp.)dgt2，是來源于廣東省佛山市某規(guī)?；B(yǎng)豬場沖刷水中，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到。

所述的芽孢桿菌(bacillussp.)dgt2的保藏信息：保藏單位：廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏日期：2016年11月2日，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏編號：gdmccno：60101。

所述的芽孢桿菌(bacillussp.)dgt2的菌落為圓形、凸起光滑、白色，有粘性；電子顯微鏡下觀察該菌的形態(tài)為芽孢桿菌；生物學特性為：氧化酶陰性，接觸酶陽性，革蘭氏染色陽性，非發(fā)酵型，專性需氧，該菌可在好氧條件下降解去氫孕酮。該菌經(jīng)16srdna序列測序，結果在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，菌株與bacillussp.t2(2013)親緣關系最近，同源性達99％以上。菌株dgt2的16srdna如seqidno：1所示。

所述的去氫孕酮降解菌在養(yǎng)殖廢水生物處理中的應用。特別是可用于降解養(yǎng)殖廢水中的去氫孕酮等類固醇激素。

所述的類固醇激素為去氫孕酮、1,4-雄烯二酮、17β-勃地酮、雄烯二酮、諾龍、睪酮、羥孕酮、黃體酮、氫化黃體酮和甲地孕酮等中的至少一種。

本發(fā)明菌株具有高效降解去氫孕酮的能力，在muellerhinton(mh)肉湯培養(yǎng)基中，60h能完全降解5mg/l的去氫孕酮(dgt)；在實際養(yǎng)豬廢水中，只需要24h能完全降解5mg/l的去氫孕酮；而且72h基本能完全降解實際養(yǎng)豬廢水中的1,4-雄烯二酮(add)、17β-勃地酮(17β-bol)、雄烯二酮(aed)、諾龍(19-nt)、睪酮(t)、羥孕酮(hp)、黃體酮(p)、氫化黃體酮(5α-dhp)、去氫孕酮(dgt)和甲地孕酮(mgt)等常見類固醇激素物質(zhì)。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果：

本發(fā)明菌株對去氫孕酮的降解速率快，可用于降解單一的去氫孕酮污染，也可用于降解多種類固醇激素混合污染物，為含去氫孕酮等類固醇激素的養(yǎng)殖廢水生物處理提供了一種新的種質(zhì)資源。

附圖說明

圖1是mh肉湯培養(yǎng)基中菌株dgt2對去氫孕酮的降解效果。

圖2是實際養(yǎng)豬廢水中菌株dgt2對去氫孕酮的降解效果。

圖3是實際養(yǎng)豬廢水中菌株dgt2對多種類固醇激素的降解效果。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1：去氫孕酮降解菌dgt2的馴化、分離及鑒定

菌源采自廣東省佛山市某規(guī)模化養(yǎng)豬場的沖刷水。收集充足的沖刷水，混勻后分裝于3個1l的錐形瓶中，每瓶500ml；分別添加去氫孕酮標樣使廢水中去氫孕酮濃度達500μg/l；多層紗布封口后于25℃、150rpm避光馴化培養(yǎng)；約1周之后，添加更高濃度的去氫孕酮；按照此法反復馴化多次，至60天，去氫孕酮濃度為5mg/l。

停止馴化后，取100μl馴化液于mh瓊脂培養(yǎng)基上，三角涂布法涂平板；多次涂平板后，盡可能挑選形態(tài)、顏色、氣味不同的菌進行劃線；多次劃線后篩選出單菌，將單菌加入僅有去氫孕酮的mh肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)；根據(jù)肉湯中去氫孕酮的殘留量，篩選出具有降解去氫孕酮能力的單菌；dmso法保存菌種(取900μl菌液于1.5ml離心管中，加入100μl已滅菌的dmso溶液，渦旋混勻，4℃放置20min后，-20℃保存菌種)，盡快送樣測序，鑒定菌種。

菌種送往北京華諾時代科技有限公司，進行16srdna鑒定：序列的擴增采用正向引物(p690f)：5'-tgtgtagcggtgaaatgcg-3'(690～708bp)，反向引物(p829r)：5'-catcgtttacggcgtggac-3'(829～811bp)，以細菌總dna為模板，pcr反應程序如下：95℃變性15min，95℃30s，55℃30s，72℃90s，共30個循環(huán)；72℃10min，4℃保存。將得到的16srdna序列登錄genbank，進行blast同源比對，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，菌株dgt2(本實驗中對去氫孕酮降解最快的菌株)與bacillussp.t2(2013)的同源性最高，達99％。結合形態(tài)、生理生化指標和16srdna基因序列分析，初步鑒定菌株dgt2為bacillussp.。命名為芽孢桿菌(bacillussp.)dgt2，其保藏信息：保藏單位：廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏日期：2016年11月2日，保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所，保藏編號：gdmccno：60101。

所述的芽孢桿菌(bacillussp.)dgt2的16srdna序列如seqidno：1所示。

實施例2：mh肉湯培養(yǎng)基中菌株dgt2對高濃度去氫孕酮的降解

配制mh肉湯培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至室溫，無菌條件下分裝至1l錐形瓶中，加入去氫孕酮使其初始濃度達5mg/l，實驗分為兩組：(1)有菌實驗組，將菌株dgt2接種到mh肉湯培養(yǎng)基中，混合均勻；(2)無菌對照組，不接種dgt2菌株，且肉湯培養(yǎng)基中加入疊氮化鈉(最終濃度為0.5％)。所有錐形瓶均用多層紗布封口，錫紙包裹避光，置于搖床中(150rpm，25℃)培養(yǎng)；實驗組和對照組均設置3個平行，連續(xù)測定培養(yǎng)液中去氫孕酮的殘留量，分析菌株dgt2對去氫孕酮的降解能力，結果如圖1所示。由圖可知，dgt2在60h內(nèi)完全降解5mg/l去氫孕酮，未添加dgt2的對照組中去氫孕酮濃度基本沒有變化。

本案例說明菌株dgt2在mh肉湯培養(yǎng)基中對高濃度的去氫孕酮具有良好的降解效果。

實施例3：養(yǎng)豬廢水中菌株dgt2對高濃度去氫孕酮的降解

廢水采自廣東省佛山市某規(guī)?；B(yǎng)豬場的沖刷水。滅菌后的廢水于無菌條件下分裝于錐形瓶中，分別添加去氫孕酮標樣使廢水中去氫孕酮濃度達5mg/l。實驗分為兩組：(1)有菌實驗組，將菌株dgt2接種到滅菌后的養(yǎng)豬廢水中，混合均勻；(2)無菌對照組，不接種dgt2菌株，且廢水中加入疊氮化鈉(最終濃度為0.5％)。所有錐形瓶均用多層紗布封口，錫紙包裹避光，置于搖床中(150rpm，25℃)培養(yǎng)；實驗組和對照組均設置3個平行，連續(xù)測定廢水中去氫孕酮的殘留量，分析菌株dgt2對去氫孕酮的降解能力，結果如圖2所示。由圖可知，dgt2在24h內(nèi)基本完全降解5mg/l去氫孕酮，未添加dgt2的對照組中去氫孕酮濃度基本沒有變化。

本案例說明菌株dgt2在高cod的實際養(yǎng)豬廢水中仍能保持對高濃度去氫孕酮的高效降解。

實施例4：養(yǎng)豬廢水中菌株dgt2對含有高濃度去氫孕酮等類固醇激素類物質(zhì)的降解

廢水采自廣東省佛山市某規(guī)模化養(yǎng)豬場的沖刷水，其cod為2310mg/l，去氫孕酮等類固醇激素物質(zhì)的總濃度為21.67μg/l。滅菌后的廢水于無菌條件下分裝于錐形瓶中；實驗分為兩組：(1)有菌實驗組，將菌株dgt2接種到滅菌后的養(yǎng)豬廢水中，混合均勻；(2)無菌對照組，不接種dgt2菌株，且廢水中加入疊氮化鈉(最終濃度為0.5％)。所有錐形瓶均用多層紗布封口，錫紙包裹避光，置于搖床中(150rpm，25℃)培養(yǎng)；實驗組和對照組均設置3個平行，分別于0h，24h，48h，72h，96h測定廢水中1,4-雄烯二酮(add)、17β-勃地酮(17β-bol)、雄烯二酮(aed)、諾龍(19-nt)、睪酮(t)、羥孕酮(hp)、黃體酮(p)、氫化黃體酮(5α-dhp)、去氫孕酮(dgt)和甲地孕酮(mgt)等常見類固醇激素物質(zhì)的殘留量，計算各個時間段菌株dgt2對類固醇激素物質(zhì)的降解率，結果如表1和圖3所示。由圖可知，dgt2在72h內(nèi)基本完全降解了去氫孕酮等類固醇激素物質(zhì)。實驗結果顯示對照組中類固醇激素物質(zhì)基本沒有降解。

表1不同時刻養(yǎng)殖廢水中類固醇激素濃度(ng/l)

注：nd表示未檢出。

本案例說明菌株dgt2在高cod的實際養(yǎng)豬廢水中不僅仍能保持對去氫孕酮的高效降解，而且對其他類固醇激素物質(zhì)均具有良好的降解效果。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國科學院廣州地球化學研究所

<120>一株去氫孕酮降解菌及其應用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>正向引物（p690f）

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<210>2

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>反向引物（p829r）

<400>2

catcgtttacggcgtggac19

<210>3

<211>1430

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>芽孢桿菌（bacillussp.）dgt2的16srdna序列

<400>3

cgtgctatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggc60

ggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccg120

gggctaataccggataacattttgaactgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggct180

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