本發(fā)明涉及一種液體生物肥料的制備方法，特別是一種發(fā)酵制備雞血液體肥料的方法。
背景技術(shù)：
我國雞血資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅有20-30%的雞血資源能夠被利用，其余大部分作為廢料被倒掉，但是僅在被利用的雞血資源中又主要應(yīng)用于食品、飼料、藥品等方面，極少應(yīng)用于肥料的開發(fā)與研究。據(jù)試驗(yàn)研究雞血的蛋白質(zhì)含量高達(dá)16-20%，并含有8種氨基酸和有多種酶、礦物質(zhì)、維生素等多種生物活性物質(zhì)。
液體肥料是含有一種或一種以上農(nóng)作物需要的營養(yǎng)元素的液體產(chǎn)品。這些營養(yǎng)元素作為溶質(zhì)溶解在水中成為溶液或借助于懸浮劑的作用懸浮于水中成為懸浮液。液體肥料大體分為液體氮肥和液體復(fù)合肥兩大類。液體肥料的優(yōu)勢(shì)在于可以根據(jù)實(shí)際的需求精確設(shè)計(jì)肥料的配方，有效的控制各種營養(yǎng)元素（包括微量元素）的含量，其特點(diǎn)在于生產(chǎn)過程中無煙塵、無毒害，不會(huì)對(duì)環(huán)境和人體健康造成危害。其施用方便，適用于各種作物，尤其是水果、蔬菜、花卉等植物，對(duì)肥料的利用率明顯提高，對(duì)植物生長(zhǎng)具有較好的調(diào)節(jié)效果，更重要的是能增加植物的產(chǎn)量，提高產(chǎn)品的品質(zhì)，被人們稱為“綠色肥料”。
我國是農(nóng)業(yè)大國，因此肥料在我國的使用量較大，我國在肥料的研究和利用方面較為落后，所以導(dǎo)致了大量的使用化學(xué)肥料使得我國大面積的土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生惡劣的變化，使得土壤的結(jié)構(gòu)破壞較為嚴(yán)重，土壤自身所含有的微生物種類和數(shù)量的急劇減少，有機(jī)質(zhì)含量降低，由土壤引發(fā)的農(nóng)作物病害顯著增加；同時(shí)在肥料的研發(fā)方面跟不上農(nóng)業(yè)的發(fā)展，導(dǎo)致肥料的種類無法滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的需求。我國的肥料種類較為單一主要以固體肥料為主，而固體肥料只可以作為農(nóng)作物的基肥使用而無法作為追肥施用；固體肥料無法滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的需求，如噴灌、滴灌等現(xiàn)代科技技術(shù)的實(shí)施；固體肥料無法根據(jù)農(nóng)作物的需求而添加有益微生物適應(yīng)土壤及作物的需求等。
傳統(tǒng)的液體肥料生產(chǎn)方法包括化學(xué)水解法、酶解法、生物發(fā)酵法等，但是化學(xué)水解的最大的弊端在于水解的過程中使用的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿會(huì)極大的破壞血液中的生物活性物質(zhì)，而生物發(fā)酵法的最大的優(yōu)勢(shì)在于利用微生物將血液的大分子物質(zhì)降解為小分子的物質(zhì)和水溶性物質(zhì)，而且由于在生物發(fā)酵的過程中沒有加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，可以最大限度的保留血液中的有益物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，這使之可以最大限度的被植物所利用吸收。與此同時(shí)生物發(fā)酵法具有操作簡(jiǎn)單方便實(shí)施，成本低等多方面的優(yōu)勢(shì)，所以極易被推廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵制備雞血液體肥料的生產(chǎn)方法，解決肥料生產(chǎn)過程中的兩大難題，一是將血液中大分子物質(zhì)被分解成小分子物質(zhì)并且可以直接被植物利用和吸收；二是將從血液本身提取出來的有益微生物添加到物質(zhì)本身，使微生物依然保持活性。
本發(fā)明采用微生物自然發(fā)酵法，將雞血在自然條件下自然發(fā)酵，并且將在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行提取，再將上述的優(yōu)勢(shì)菌株加入到新鮮血液中，采用多種微生物共同發(fā)酵的方式，將血液中大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)如小分子的多糖、單糖、含氮化合物等。與此同時(shí)在自然發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量有益的微生物和多種代謝產(chǎn)物可以提高液體肥料的肥力，并且可以降低液體肥料的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明提供的一種發(fā)酵制備雞血液體肥料的方法，包括以下步驟：
（1）雞血發(fā)酵前處理：將新鮮雞血放置在已滅菌好的盛放器皿內(nèi)，加蓋保鮮膜，放置在無菌室內(nèi)，在室溫下自然發(fā)酵30天；
（2）菌種的培養(yǎng)與分離：將發(fā)酵的樣品充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅捎?0倍梯度稀釋法將樣品分別涂置細(xì)菌平板培養(yǎng)基、霉菌平板培養(yǎng)基上，將細(xì)菌組和霉菌組分別編號(hào)為a、b，其中細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h、霉菌在28℃下培養(yǎng)3-4d；
（3）菌種純化：將上述（2）中培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌種分別純化分離，純化三代置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
（4）優(yōu)勢(shì)菌種篩選：將上述（3）中得到的優(yōu)勢(shì)菌種經(jīng)過菌株解磷、解鉀、固氮試驗(yàn)、透明圈試驗(yàn)、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、可溶性蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定篩選，最終得到細(xì)菌a7，a8，霉菌b1、b4四種菌株為優(yōu)勢(shì)菌株；
（5）優(yōu)勢(shì)菌株鑒定：菌株的初步鑒定通過生理生化試驗(yàn)對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》，細(xì)菌和霉菌分別采用16srdna擴(kuò)增和its擴(kuò)增、測(cè)序，得出細(xì)菌a7為蘇云金芽孢桿菌菌株，a8為希瓦氏菌株；霉菌b1為青霉菌屬，b4為塔賓曲霉。
（6）優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵雞血最佳條件篩選：在發(fā)酵過程當(dāng)中，分別以發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量、轉(zhuǎn)速為因素，采用響應(yīng)面法確定最佳條件，最終得出在溫度為32℃、接種量為1%、轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下培養(yǎng)5天時(shí)發(fā)酵效果最佳；
（7）將新鮮的雞血在上述篩選的條件下進(jìn)行大批的發(fā)酵培養(yǎng)最終得到雞血液體肥料。
本發(fā)明的積極效果：
采用了一種微生物發(fā)酵法制備雞血液體肥料，將血液中大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，可以直接被植物利用和吸收；將從血液本身提取出來的有益微生物添加到物質(zhì)本身，使微生物依然保持活性。將天然的營養(yǎng)成分、抗生物質(zhì)等集于一體，具有微生物菌劑、微量元素肥料等復(fù)合的功效。由于該液體肥料含有蘇云金芽孢桿菌菌株、希瓦氏菌株、青霉菌屬、塔賓曲霉，既可以提高土壤和植物對(duì)水分、養(yǎng)分吸收利用率，又可以改善土壤本身的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)速效養(yǎng)分的釋放等功效。本發(fā)明采用微生物發(fā)酵法發(fā)酵雞血液體肥料，可以應(yīng)用于土壤結(jié)構(gòu)的改良、土壤基肥的添加，植物噴施等多方面。
具體實(shí)施方式
1.發(fā)酵前預(yù)處理：將新鮮雞血在無菌條件下，放置于無菌的盛放器皿內(nèi)并加蓋保鮮膜，于無菌室內(nèi)室溫放置，自然發(fā)酵30天；
2.將發(fā)酵雞血中菌種培養(yǎng)與分離：將樣品在無菌條件下攪拌使其充分混勻，采用10倍梯度稀釋法10-1-10-9將樣品分別用涂布器涂置于細(xì)菌和霉菌平板培養(yǎng)基上，并將細(xì)菌組和霉菌組分別編號(hào)為a、b，其中細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h、霉菌在28℃下培養(yǎng)3-4d；
上述的細(xì)菌培養(yǎng)基制備：將蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g各成分分別溶解于1000ml蒸餾水中，以1mol/l氫氧化鈉校正ph7.4，分裝三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，而后按培養(yǎng)基的量加入15g-17g瓊脂，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用；
上述的霉菌培養(yǎng)基制備：將蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、瓊脂15-20g、1/3000孟加拉紅溶液100ml、氯霉素0.1g和鏈霉素30μg/ml，蒸餾水1000ml。分別將上述5中成分于900ml蒸餾水中溶解后，再加入孟加拉紅溶液。另外用5ml-10ml的乙醇溶液溶解氯霉素，加入到培養(yǎng)基中。分裝后0.1mpa滅菌20min。再倒平板之前按照10ml培養(yǎng)基加入1ml0.03%鏈霉素溶液；
3.發(fā)酵雞血中菌種純化：觀察上述2中培養(yǎng)分離的菌株，挑取生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌株共80株，其中細(xì)菌50株、霉菌30株，并且分別編號(hào)為a1-a50、b1-b30；采用連續(xù)劃線法將優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行純化分離，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h、霉菌在28℃下培養(yǎng)4d，重復(fù)三次以上操作方法，即將優(yōu)勢(shì)菌株純化分離至第三代（目的是保證菌株的純度和活力），將第三代純化的菌株置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
4.發(fā)酵雞血中優(yōu)勢(shì)菌種篩選：將上述3中純化三代后得到的80株優(yōu)勢(shì)菌株挑單個(gè)菌落，接種到用雞血代替硝酸鈉的改良察式培養(yǎng)基平板上，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h、霉菌在28℃下培養(yǎng)4d，從改良察式培養(yǎng)基平板上獲得細(xì)菌32株優(yōu)勢(shì)菌株、霉菌15株優(yōu)勢(shì)菌株，并將細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌株、霉菌優(yōu)勢(shì)菌株分別經(jīng)過透明圈試驗(yàn)、菌株解磷、解鉀、固氮試驗(yàn)、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定、氨基酸態(tài)氮含量的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定篩選，最終確定細(xì)菌a7、a8，霉菌b1、b4四種菌株確定為優(yōu)勢(shì)菌株；
上述改良察式培養(yǎng)基制備：將雞血2g替代原硝酸鈉2g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g，分別溶解于1000ml蒸餾水中，充分溶解后加入瓊脂15g-20g，ph自然或ph7.0-7.2，分裝于三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用。
上述的菌株篩選指標(biāo)透明圈試驗(yàn)、菌株解磷、解鉀、固氮試驗(yàn)、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定、氨基酸態(tài)氮含量指標(biāo)的測(cè)定包括以下內(nèi)容：
（1）透明圈試驗(yàn)：將獲得的細(xì)菌32株、霉菌15株接種到干酪素培養(yǎng)基平板上，分別在30h和60h時(shí)測(cè)量菌株的透明圈直徑和菌落直徑，再計(jì)算透明圈直徑和菌落直徑的比值（dc），選出生長(zhǎng)旺盛的且在30h和60h時(shí)dc值較大細(xì)菌15株、霉菌8株；
上述干酪素培養(yǎng)基制備：將硝酸鈉2g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、1.2g干酪素，分別溶解于1000ml蒸餾水中，充分溶解后加入瓊脂15-20g，ph自然或ph7.0-7.2，分裝于三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用；
（2）上述菌株解磷、解鉀、固氮試驗(yàn)：將配置好的無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基、阿須貝固體培養(yǎng)基、硅酸鹽培養(yǎng)基，0.1mpa滅菌20min后倒平板，將上述得到的細(xì)菌15株、霉菌8株分別于培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h、霉菌在28℃下培養(yǎng)4d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，其中細(xì)菌a5、a7、a8，霉菌b1、b3、b4均有解磷、解鉀、固氮的作用；
上述的無機(jī)磷培養(yǎng)基制備:葡萄糖10.0g、硫酸銨0.5g、酵母浸粉0.5g、氯化鈉0.3g、氯化鉀0.3g、硫酸鎂0.3g、硫酸亞鐵0.03g、硫酸錳0.03g、卵磷脂0.2g、碳酸鈣5.0g分別溶解于1000ml蒸餾水中，充分溶解后加入瓊脂15.0g，調(diào)節(jié)ph7.0-7.5，分裝于三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用；
上述有機(jī)磷培養(yǎng)基制備：葡萄糖10.0g、硫酸銨0.5g、酵母浸粉0.5g、氯化鈉0.3g、氯化鉀0.3g、硫酸鎂0.3g、硫酸亞鐵0.03g、硫酸錳0.03g、卵磷脂0.2g、碳酸鈣1.0g，分別溶解于1000ml蒸餾水中，充分溶解后加入瓊脂15.0g，調(diào)節(jié)ph7.2-7.4，分裝于三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用；
上述阿須貝培養(yǎng)基制備：磷酸二氫鉀0.2g、硫酸鎂0.2g、氯化鈉0.2g、碳酸鈣5.0g、甘露醇10.0g、硫酸鈣0.1g,分別溶解于1000ml蒸餾水中，充分溶解后加入瓊脂15.0g，調(diào)節(jié)ph7.0，分裝于三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用；
上述硅酸鹽培養(yǎng)基制備：蔗糖5.0g、硫酸鎂0.5g、碳酸鈣0.1g、磷酸氫二鉀2.0g、氯化鐵0.005g、玻璃粉1.0g，分別溶解于1000ml蒸餾水中，充分溶解后加入瓊脂15.0g，調(diào)節(jié)ph7.0，分裝于三角瓶中，分裝時(shí)以三角瓶容積的1/2-1/3為宜，0.1mpa滅菌20min后倒平板備用。
（3）蛋白質(zhì)含量測(cè)定：將上述的細(xì)菌a5、a7、a8，霉菌b1、b3、b4分別接種到已經(jīng)滅菌的雞血50ml，搖床160rpm培養(yǎng)，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)5d、霉菌在28℃下培養(yǎng)5d，與發(fā)酵后的雞血與發(fā)酵前的雞血進(jìn)行對(duì)照，每組作三個(gè)平行，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，最終測(cè)定的細(xì)菌a7、a8，霉菌b1、b4的蛋白質(zhì)含量最高，分別為a7：0.35g/100g，a8：0.40g/100g，b1：0.33g/100g，b4：0.50g/100g；
（4）可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定：將上述的細(xì)菌a5、a7、a8，霉菌b1、b3、b4分別接種到已經(jīng)滅菌的雞血50ml,搖床160rpm培養(yǎng)，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)5d，霉菌在28℃下培養(yǎng)5d，與發(fā)酵后的雞血與發(fā)酵前的雞血進(jìn)行對(duì)照，每組作三個(gè)平行，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量，最終測(cè)定的細(xì)菌a7、a8，霉菌b1、b4的可溶性蛋白質(zhì)含量最高，分別為a7：6.24μg/g，a8：6.68μg/g，b1：9.63μg/g，b4：8.60μg/g；
（5）氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定：將上述的細(xì)菌a5、a7、a8，霉菌b1、b3、b4分別接種到已經(jīng)滅菌的雞血50ml,搖床160rpm培養(yǎng)，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)5d，霉菌在28℃下培養(yǎng)5d，與發(fā)酵后的雞血與發(fā)酵前的雞血進(jìn)行對(duì)照，每組作三個(gè)平行，采用電位滴定法測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量，最終測(cè)定的細(xì)菌a7、a8，霉菌b1、b4的氨基酸態(tài)氮含量最高，分別為a7：0.04g/100g，a8：0.04g/100g，b1：0.05g/100g，b4：0.08g/100g；
依此優(yōu)勢(shì)菌株的篩選試驗(yàn)最終得出細(xì)菌a7、a8，霉菌b1、b4為發(fā)酵雞血液體肥料的優(yōu)勢(shì)菌株；
5．優(yōu)勢(shì)菌株鑒定
菌株的初步鑒定通過生理生化試驗(yàn)對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》，再通過細(xì)菌和霉菌分別采用16srdna擴(kuò)增和its擴(kuò)增、測(cè)序。試驗(yàn)采用單菌落裂解法制備模板dna，該方法是通過天根細(xì)菌基因組dna提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），進(jìn)行菌株的dna提取，然后細(xì)菌采用16srdna擴(kuò)增，真菌dna采用its擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物擴(kuò)增試驗(yàn)是按照試劑盒（上海派森諾生物有限公司）說明進(jìn)行的，菌株的測(cè)序由上海派森諾生物工程公司完成，將測(cè)定的序列用blast軟件與genbank中已知的序列進(jìn)行同源性比較，最終確定a7：蘇云金芽孢桿菌菌株（bacillusthuringiensisberline），細(xì)菌a8：希瓦氏菌屬（shewanella）；b1：青霉菌屬（penicilliumpinophilum），b4:塔賓曲霉（aspergillustubingensis(schober)mosseray）。
《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，第八版，r.e布坎南和n.e吉本斯等編著；《真菌鑒定手冊(cè)》，魏景超編著。
蘇云金芽孢桿菌菌株：可購買于北京中科質(zhì)檢供應(yīng)專業(yè)單位，相關(guān)內(nèi)容可以從中國畜牧獸醫(yī)、熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)、中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)、四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)等雜志報(bào)刊獲得；希瓦氏菌屬：可購買于biovectorntcc保藏中心，相關(guān)內(nèi)容可以從微生物學(xué)報(bào)、浙江工商大學(xué)、水產(chǎn)學(xué)報(bào)、安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)等雜志報(bào)刊獲得；青霉菌屬，可購買于微生物菌種網(wǎng)，相關(guān)內(nèi)容可以從華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)、中國藥學(xué)雜志、中國醫(yī)藥工業(yè)雜志等雜志報(bào)刊獲得；塔賓曲霉：可購買于上海復(fù)祥生物科技有限公司，相關(guān)內(nèi)容可以從食品工業(yè)科技、環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)、廣西大學(xué)學(xué)報(bào)等雜志報(bào)刊獲得。
6.優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵雞血最佳條件篩選：在發(fā)酵過程當(dāng)中，分別以a7:a8:b1:b4=1:1:1:1的接種比例接種到滅菌的雞血50ml中，以發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量、轉(zhuǎn)速為因素，采用響應(yīng)面法確定最佳條件，最終得出在溫度為32℃、接種量為1%、轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下培養(yǎng)5天時(shí)發(fā)酵效果最佳；
7.將5l新鮮的雞血依據(jù)上述篩選的條件進(jìn)行大批的發(fā)酵培養(yǎng)最終得到雞血液體肥料；
8.包裝入庫：將雞血液體肥料通過液體灌裝設(shè)備包裝，入庫。
9.將上述4種菌株混合后發(fā)酵的雞血液體肥料按照相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：氮、磷、鉀、有機(jī)質(zhì)、ph、有效活菌、雜菌、無害化指標(biāo)。
依據(jù)《復(fù)合微生物肥料》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（hy/789-2004）的要求和檢驗(yàn)方法對(duì)該雞血液體肥料進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)定雞血液體肥料的總養(yǎng)分為n+p2o5+k2o≥5%、有效活菌≥6×107cfu/ml、ph為6.0-8.0之間、有機(jī)質(zhì)為20%-30%之間和雜菌率≤9%，經(jīng)過嚴(yán)格的試驗(yàn)證明該液體肥料符合微生物肥料的標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)國家微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)，按照國家要求和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該液體肥料進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)定雞血液體肥料中重金屬含量分別為：鉻（cr）：95.08mg/l，砷（as）：0.04mg/l，鎘（cd）：1.03mg/l，鉛（pb）：23.57mg/l，汞（hg）：1.68mg/l，經(jīng)過嚴(yán)格的試驗(yàn)證明，該液體肥料符合國家微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)要求中的無害化指標(biāo)。
實(shí)施例一
將采集的新鮮雞血放置在無菌條件下，室溫放置發(fā)酵30天后，采用梯度稀釋法將發(fā)酵好的雞血分別涂置于細(xì)菌和霉菌平板培養(yǎng)基上，并將細(xì)菌組和霉菌組分別編號(hào)為a、b，其中細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h、霉菌在28℃下培養(yǎng)4d。挑取生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌株共80株，其中細(xì)菌50株、霉菌30株并且分別編號(hào)為a1-a50、b1-b30,并采用連續(xù)劃線法將優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行純化分離，將優(yōu)勢(shì)菌株純化分離至第三代,將第三代純化的菌株置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將純化第三代后?0株優(yōu)勢(shì)菌株挑單個(gè)菌落接種到2%雞血代替硝酸鈉作為唯一氮源的改良察式培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，從改良察式培養(yǎng)基平板上獲得細(xì)菌32株、霉菌15株生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌株，并將優(yōu)勢(shì)菌株分別經(jīng)過透明圈試驗(yàn)、菌株解磷、解鉀、固氮試驗(yàn)、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定、氨基酸態(tài)氮含量等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定篩選，最終確定細(xì)菌a7、a8，霉菌b1、b4四種菌株為優(yōu)勢(shì)菌株。
實(shí)施例二
取新鮮雞血10l，以a7:a8:b1:b4=1:1:1:1的接種比例接種到滅菌的雞血中，在培養(yǎng)溫度32℃、接種量為1%、轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下培養(yǎng)發(fā)酵5天后取出，，測(cè)定雞血液體肥料的總養(yǎng)分為n+p2o5+k2o≥5%、有效活菌≥6×107cfu/ml、ph為6.0-8.0之間、有機(jī)質(zhì)為20%-30%之間和雜菌率≤9%，測(cè)定雞血液體肥料中重金屬含量分別為：鉻（cr）≤150mg/l、砷（as）≤75mg/l、鎘（cd）≤10mg/l、鉛（pb）≤100mg/l、汞（hg）≤5，經(jīng)過嚴(yán)格的試驗(yàn)證明，該液體肥料符合液體復(fù)合微生物肥料的技術(shù)指標(biāo)和國家微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)要求中的無害化指標(biāo)。
實(shí)施例三
雞血液體肥料對(duì)種子發(fā)芽率的影響
以小白菜為例：試驗(yàn)設(shè)置清水、液體肥料10倍稀釋、30倍稀釋、50倍稀釋，分別做3次平行。首先，試驗(yàn)將干凈濾紙放在已滅菌培養(yǎng)皿中，再分別將50顆種子放在相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿中加入相應(yīng)的稀釋度的肥料進(jìn)行浸種8小時(shí)，之后將種子轉(zhuǎn)移到已滅菌的培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿放置在25℃培養(yǎng)箱中，進(jìn)行培養(yǎng)常規(guī)催芽。在此期間進(jìn)行不斷地通風(fēng)換氣，每天進(jìn)行觀察直至第5天，記錄種子的發(fā)芽率。通過實(shí)驗(yàn)記錄可以明顯地發(fā)現(xiàn)清水、液體肥料10倍稀釋、30倍稀釋、50倍稀釋的4個(gè)處理中，清水試驗(yàn)中發(fā)芽率最低，10倍稀釋的發(fā)芽率最高，而30倍和50倍稀釋度下的發(fā)芽率大致相同，無顯著性差異。實(shí)施例四
雞血液體肥料對(duì)幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的影響
以小白菜為例：試驗(yàn)設(shè)置清水、液體肥料10倍稀釋、30倍稀釋、50倍稀釋，分別做3次平行。將經(jīng)過浸泡處理過的且發(fā)芽良好的種子取出10顆分別放在相應(yīng)的用紗布繃緊的培養(yǎng)皿中，并且將各處理的液體肥料加到與培養(yǎng)皿口相平，再放入到燒杯中，將燒杯口用保鮮膜覆蓋，在25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。7天后用直尺測(cè)量幼苗的株高、根長(zhǎng)。通過實(shí)驗(yàn)記錄可以明顯地發(fā)現(xiàn)清水、液體肥料10倍稀釋、30倍稀釋、50倍稀釋的4個(gè)處理中，清水試驗(yàn)中幼苗的生長(zhǎng)較為緩慢，對(duì)幼苗生長(zhǎng)不顯著；其中10倍稀釋和30倍稀釋度下的幼苗的生長(zhǎng)較為顯著；50倍稀釋度下對(duì)幼苗的生長(zhǎng)影響略微顯著于清水。