本發(fā)明提供一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其菌劑的制備和應(yīng)用，屬于農(nóng)用微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：紅掌又名火鶴花、幸運花、安祖花等，是天南星科花燭屬植物，原產(chǎn)地為南美洲熱帶雨林地區(qū)，現(xiàn)廣泛栽培于亞洲、歐洲、非洲等地。該作物屬多年生常綠草本花卉，其花型奇特，色彩鮮艷豐富，使用范圍廣，是在世界范圍非常流行、備受親睞的名貴花卉之一，具有很高的經(jīng)濟價值，在全球熱帶花卉貿(mào)易中，銷量僅次于蘭花。近年來紅掌細菌性病害在紅掌的栽培過程中呈現(xiàn)明顯增長的趨勢，主要有細菌性葉斑病、細菌性葉枯病、細菌性枯萎病。尤其以細菌性葉斑病的增長趨勢最為明顯，其擴散速度快、危害大，給紅掌產(chǎn)業(yè)造成了極大的危害。紅掌細菌性葉斑病，是一種由地毯草黃單胞菌的花葉萬年青致病變異種（xanthomonasaxonopodispv.dieffenbachiae）引起的一類細菌病害。該病害的主要癥狀為染病之初，在紅掌葉片上分布水漬狀凹陷斑，病斑在侵染初期呈半透明狀，其中新葉的病斑出現(xiàn)在葉脈間，斑點顏色呈褐色并伴有清晰的邊緣，老葉的病斑通常出現(xiàn)在其葉部邊緣，小點式排列。當空氣濕度較大時，病斑迅速增多，在新葉的葉背部位可見充滿棕褐色菌膿的斑點，當空氣狀濕度降低時，新葉葉背部位菌膿消失，病斑由棕褐色變?yōu)楹稚蛘吆谏⒊矢煽轄?。病原菌的侵染可由葉柄維管束傳播到莖基部維管束中，侵染過后維管束呈褐色，葉柄中出現(xiàn)菌膿，切斷葉柄，菌膿則會從維管束中溢出。此時，發(fā)病嚴重的紅掌葉片會出現(xiàn)萎蔫、枯死。如果病原菌侵染傳輸?shù)角o基部，很有可能整個植株都會死亡。紅掌細菌性葉斑病傳播速度極快，死亡率很高，在發(fā)病嚴重的地區(qū)紅掌細菌性葉斑病發(fā)病率達到100%，死亡率也高達80%以上。此病的流行嚴重影響了紅掌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，制約了紅掌的生產(chǎn)。目前，防治紅掌細菌性病害的主要措施仍然是化學(xué)農(nóng)藥防治。化學(xué)防治雖然具有抗菌譜廣、成本低、使用便捷、高效穩(wěn)定等諸多優(yōu)點，但化學(xué)殺菌劑的大量使用帶來的土壤、大氣污染，生態(tài)平衡破壞，食品安全威脅，以及病原菌對農(nóng)藥的抗性增強等問題日益嚴重，因此，選擇高效無毒、不污染環(huán)境且不易產(chǎn)生抗藥性的生物防治方法進行植物病害的防治，日益受到人們的重視。但是針對紅掌細菌性病害的生物防治制劑及方法十分缺乏。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一株能對紅掌細菌性葉斑病起到防控作用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其菌劑的制備和應(yīng)用。本發(fā)明從紅掌根際土壤中分離獲得一株細菌，經(jīng)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）；本發(fā)明將其命名為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9。該菌株于2017年4月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。保藏號為cgmccno.14022。本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9，菌體為桿狀，為兼性厭氧發(fā)酵型，接觸酶、硝酸鹽還原、淀粉水解、v-p測定、明膠液化、檸檬酸鹽利用和氮源利用等反應(yīng)為陽性，甲基紅試驗和苯丙氨酸脫氨酶試驗為陰性，能在nacl質(zhì)量濃度為2%和5%的lb固體培養(yǎng)基生長，生長12h后菌落隆起，表面干燥，為白色、不透明圓形。本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9，其16srdna序列長度為1454bp，具體序列如seqidno.1所示。本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9，具有較廣的抑菌譜，對引起紅掌細菌性葉斑病的病原菌以及葡萄炭疽病菌、尖孢鐮刀菌、楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、灰霉菌等病原菌都具有較強的抑制效果；對引起紅掌細菌性葉斑病的病原菌的抑制效果尤為顯著，且能夠在紅掌根際、葉片及葉柄表面穩(wěn)定定殖；因此能夠用于紅掌細菌性葉斑病的預(yù)防和控制。本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9，能夠制備成液體菌劑或固體菌劑施用。所以，本發(fā)明還提供了一種利用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9生產(chǎn)微生物菌劑的方法，將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9的二級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)得到液體菌劑，發(fā)酵條件：轉(zhuǎn)速為100-120r/min、溫度為30-32℃、通氣量為1：0.5-1.6、壓力為0.05-0.06mpa、培養(yǎng)時間為24-28h。上述方法，將得到的液體菌劑進行6000-8000r/min離心，收集沉淀物，向沉淀物中緩慢加入沉淀物重量百分比6-10％的玉米粉混合均勻，噴霧干燥，即得固體菌劑。上述方法，所用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9的二級種子液可以通過常規(guī)方法獲得，還可以通過下述步驟獲得：（1）菌種活化：將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9接種于lb固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)20-24h；挑取單菌落再次劃線轉(zhuǎn)接于lb固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)16-20h，備用；（2）一級種子液制備：將活化的hz-9菌株接種于lb液體培養(yǎng)基，30℃、200r/min、搖瓶培養(yǎng)16h，備用；（3）二級種子液制備：將一級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速200-400r/min、溫度28-30℃、通氣量1∶0.5-1.6、壓力0.05-0.06mpa、培養(yǎng)28-36h，得種子液。上述方法，所述通氣量為每分鐘通入空氣的體積與發(fā)酵液的體積的比值；lb固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、氯化鈉10g、酵母粉5g、瓊脂15g、蒸餾水1l，121℃滅菌30min；lb液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、氯化鈉10g、酵母粉5g、蒸餾水1l，121℃滅菌30min；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g、淀粉10g、可溶性玉米漿5g、硫酸銨1.5g、磷酸二氫鉀0.5g、碳酸鈣1g，蒸餾水1l，121℃滅菌30min。本發(fā)明所制備的微生物菌劑為液體菌劑或固體粉劑，其活性成分為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9的芽孢及其孢外代謝物。本發(fā)明還提供了微生物菌劑的具體使用方法：液體菌劑與水按照1:100的體積比例混合均勻，灌根；固體菌劑按照4-6kg/畝用量，灌根施用；兩種菌劑均可以作為生物有機肥、復(fù)合微生物肥料菌種使用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：1、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9菌株具有較廣的抑菌譜，能夠在紅掌根際穩(wěn)定定殖。2、利用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9生產(chǎn)的菌劑可有效防治紅掌細菌性葉斑病、葡萄炭疽病、楊樹腐爛病以及黃瓜枯萎病等。3、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9無污染，無生態(tài)毒性，安全性好，傳代抑菌性狀穩(wěn)定。4、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9發(fā)酵性狀好，菌劑生產(chǎn)工藝簡單、周期短，成本低，利于工業(yè)化生產(chǎn)、運輸。保藏信息：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2017年4月13日；保藏編號：cgmccno.14022；分類命名：甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(bacillusmethylotrophicus)。附圖說明圖1為根據(jù)16srdna序列，利用mega5.05分析構(gòu)建的hz-9菌株的系統(tǒng)進化樹；由圖1可以看出hz-9菌株與已知菌株bacillusmethylotrophicus(jf899288)的16srdna同源性達到99%，結(jié)合hz-9菌株的菌體形態(tài)、菌落特征及生理生化指標的測定結(jié)果，將其鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(bacillusmethylotrophicus)。圖2為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9的抑菌譜。具體實施方式下述實施例中：pda固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、牛肉膏5g、葡萄糖20g、瓊脂15g、(nh4)2so41g、mgso41g、kh2po40.6g、caco33g、瓊脂粉15g、蒸餾水1l，ph6.8-7.2，121℃滅菌30min；lb固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、氯化鈉10g、酵母粉5g、瓊脂粉15g、蒸餾水1l，121℃滅菌30min；lb液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、氯化鈉10g、酵母粉5g、蒸餾水1l，121℃滅菌30min。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g、淀粉10g、可溶性玉米漿5g、硫酸銨1.5g、磷酸二氫鉀0.5g、碳酸鈣1g、蒸餾水1l，121℃滅菌30min。實施例11、hz-9菌株的分離無菌條件下取采集的紅掌根際土樣5g，將其溶于45ml的無菌水中，28℃、220r/min條件下振蕩1h，吸取0.5ml與4.5ml無菌水混勻，得到10-1的稀釋液，再取0.5ml10-1的稀釋液與4.5ml無菌水混勻，即得10-2的稀釋液，依稀類推，制備10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀釋液。將10-4、10-5、10-6的稀釋液，分別用移液器吸取100μl加入pda固體培養(yǎng)基平板中央，用涂布器將稀釋液在各pda固體培養(yǎng)基平板上涂抹均勻，于37℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)1-3天。在平板中用接種環(huán)挑取各個菌株的單菌落，在lb固體培養(yǎng)基平板劃線成純培養(yǎng)物，保存。將上述獲得的若干株純培養(yǎng)物進行平板對峙試驗，以紅掌細菌性葉斑病菌為指示菌，觀察抑菌情況，測量抑菌帶寬度，篩選獲得抑菌效果強的菌株，命名為hz-9菌株，于2017年4月13日送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保存，保藏號為cgmccno.14022。2、hz-9菌株的鑒定（1）菌體形態(tài)與菌落特征hz-9菌株在lb固體培養(yǎng)基上生長12h后：其菌落隆起，表面干燥，為白色、不透明圓形；菌體為桿狀，無鞭毛。（2）生理生化特征hz-9菌株的生理生化特征見表1，該菌株為革蘭氏陽性菌，兼性厭氧發(fā)酵型，接觸酶、硝酸鹽還原、淀粉水解、v-p測定、明膠液化、檸檬酸鹽利用和氮源利用等反應(yīng)為陽性；甲基紅試驗和苯丙氨酸脫氨酶試驗為陰性；可在nacl濃度為2%和5%的lb液體培養(yǎng)基生長。表1hz-9菌株的生理生化特征注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。（3）菌株16srdna序列分析hz-9菌株的16srdna序列長度為1454bp，如seqidno.1所示，將此序列與genbank數(shù)據(jù)庫中序列進行blast分析比對，發(fā)現(xiàn)與其同源性較高的菌株均屬于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。選取10株與hz-9菌株序列相似性較高的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用mega5.05軟件，采取neighbor-joining法構(gòu)建以16srdna序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進化樹(附圖1)。hz-9菌株的16srdna序列同公開發(fā)表的bacillusmethylotrophicus(jf899288)的16srdna的同源性達到99%，結(jié)合其菌體形態(tài)、菌落特征和生理生化特征，將其鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）。實施例2hz-9菌株的抑菌譜測定用接種環(huán)挑取一環(huán)純化的菌體，點在距pda平板中央兩端3cm處，以實驗室保存的葡萄炭疽病菌、尖孢鐮刀菌、楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、灰霉菌5種病原真菌為靶標，用打孔器切下直徑為5mm的菌盤接種于pda平板中央，28℃培養(yǎng)3-5天，試驗結(jié)果表明hz-9菌株對葡萄炭疽病菌、尖孢鐮刀菌、楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、灰霉菌有較好的拮抗效果，試驗結(jié)果見表2、附圖2。表2hz-9菌株對多種植物病原真菌的拮抗作用注：“+”表示抑菌帶寬度<2mm，“++”表示抑菌帶寬度為2-5mm，“+++”表示抑菌帶寬度>5mm。實施例31、hz-9菌株在紅掌根際以及葉片、葉柄表面的定殖能力測定（1）hz-9菌株的雙抗生素篩選及穩(wěn)定性檢測將hz-9菌株接種到lb液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。將種子液以2%（體積百分比）的接種量接種到含5μg/ml利福平的lb液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)24h；將該培養(yǎng)液以2%（體積百分比）的接種量接種到含10μg/ml利福平的lb液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24h；依次類推，使利福平的濃度逐漸由5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、150μg/ml直至增加到300μg/ml，培養(yǎng)得到抗利福平的菌株。將得到的抗利福平菌株接種到含300μg/ml利福平和5μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中，對抗利福平和壯觀霉素的雙抗菌株進行篩選，篩選過程中，lb液體培養(yǎng)基中利福平的濃度始終為300μg/ml，壯觀霉素濃度逐漸由5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、150μg/m直至增加到300μg/ml，最終獲得同時抗利福平和壯觀霉素的初始雙抗標記菌株。將篩選的雙抗標記突變菌株在不含利福平和壯觀霉素的lb固體培養(yǎng)基和lb液體培養(yǎng)基中交替培養(yǎng)3-5代，再回接到含利福平300μg/ml和壯觀霉素300μg/ml的lb液體培養(yǎng)基中進行檢測，以證實其耐藥性的穩(wěn)定性，最終獲得能夠穩(wěn)定遺傳的同時抗利福平和壯觀霉素的雙抗標記菌株。（2）定殖試驗將雙抗標記的hz-9菌株接種到lb液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min培養(yǎng)18-20h，作為種子液。將種子液以2%（體積百分比）的接種量接種到同時含有利福平300μg/ml和壯觀霉素300μg/ml的lb液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)18-20h；再將該培養(yǎng)液以2%（體積百分比）的接種量接種到lb液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/mim振蕩培養(yǎng)18-20h，即得到雙抗標記的hz-9菌株菌液。本發(fā)明通過盆栽實驗，對hz-9菌株在紅掌根際以及葉片、葉柄表面的定殖能力進行了研究。hz-9菌株在紅掌根際的定殖試驗花盆內(nèi)徑22cm，每盆種植紅掌1棵，3個重復(fù)。去除紅掌根部的表面土，每盆接種5ml培養(yǎng)好的雙抗標記的hz-9菌株菌液，然后將表面土重新覆蓋好。接種菌液后的第15天、30天、45天和60天，分別采集紅掌根際土樣。無菌環(huán)境下稱取紅掌根際土5g，加入裝有45ml無菌水的三角瓶中，混勻并在28℃條件下恒溫振蕩1h，使細菌細胞充分分散，吸取0.5ml與4.5ml無菌水混勻，得到10-1稀釋液；向裝有4.5ml無菌水的小試管中加入0.5ml10-1稀釋液，混勻得10-2稀釋液；依次類推，得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋液。取不同濃度稀釋液100μl分別加入雙抗平板中央，用涂布器在平板中均勻涂布，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d之后進行菌落計數(shù)，試驗結(jié)果見表3。由表3可知，接種hz-9菌株后第15天，紅掌根際土壤中的hz-9菌落數(shù)為3.2×108cfu/g；第30天，紅掌根際土壤中的hz-9菌落數(shù)為5.2×107cfu/g；第45天，紅掌根際土壤中的hz-9菌落數(shù)稍有下降；第60天，紅掌根際土壤中的hz-9菌落數(shù)為2.0×107cfu/g，基本維持穩(wěn)定。根據(jù)對hz-9菌株在紅掌根際60天定殖菌落數(shù)量的跟蹤，表明hz-9菌株能夠在紅掌根際穩(wěn)定定殖。表3hz-9菌株在紅掌根際的定殖結(jié)果hz-9菌株在紅掌葉片、葉柄表面的定殖試驗花盆內(nèi)徑22cm，每盆種植紅掌1棵，3個重復(fù)。用小型噴霧器將培養(yǎng)好的雙抗標記的hz-9菌株菌液均勻噴施在葉片和葉柄表面，每株噴施5ml。噴施菌液后的第7天、14天、21天、28天，分別采集葉片和葉柄樣本。無菌環(huán)境下分別稱取葉片和葉柄5g和1g，分別加入裝有45g和9g無菌水的三角瓶中，28℃條件下恒溫振蕩30min，將液體梯度稀釋涂布雙抗平板（方法同根際定殖試驗），在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天之后進行菌落計數(shù)，試驗結(jié)果見表4。由表4可知，接種hz-9菌株后第7天，葉片定殖菌落數(shù)為2.2×105cfu/g，葉柄定殖菌落數(shù)為5.0×104cfu/g；第14天，葉片定殖菌落數(shù)為9.6×104cfu/g，葉柄定殖菌落數(shù)下降為4.2×102cfu/g；第21天，葉片定殖菌落數(shù)下降為5.0×103cfu/g，葉柄定殖菌落數(shù)下降為3.1×102cfu/g；第28天，葉片定殖菌落數(shù)為1.5×103cfu/g，葉柄定殖菌落數(shù)為2.9×102cfu/g，基本維持穩(wěn)定。根據(jù)對hz-9菌株在紅掌葉片、葉柄28天定殖數(shù)量的跟蹤，表明hz-9菌株能夠在紅掌葉片、葉柄表面穩(wěn)定定殖。表4hz-9菌株在紅掌葉片、葉柄的定殖結(jié)果時間（天）葉片定殖菌落數(shù)（cfu/g）葉柄定殖菌落數(shù)（cfu/g）72.2×1055.0×104149.6×1044.2×102215.0×1033.1×102281.5×1032.9×102實施例4hz-9菌株最佳產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化hz-9菌株基礎(chǔ)配方的選擇基于培養(yǎng)基材料來源方便、成本低、組成成分簡單等原則，從本實驗室經(jīng)驗發(fā)酵配方中篩選獲得。分別選擇葡萄糖為速效碳源，淀粉和玉米漿為緩效碳氮源，碳酸鈣、硫酸銨和磷酸二氫鉀三種無機鹽，進行6個因素3個水平正交試驗設(shè)計，試驗因素和水平設(shè)置見表5。將hz-9菌株接種到裝有50mllb液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、200r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，然后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（配方見表5）中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的2%（體積百分比），30℃、200r/min培養(yǎng)，直至在顯微鏡下觀察芽孢轉(zhuǎn)化率達到95%以上，涂布平板并計數(shù)，計算發(fā)酵液中的芽孢數(shù)。hz-9菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵結(jié)果數(shù)據(jù)分析見表6，從表6中可以看出，17號發(fā)酵培養(yǎng)基的芽孢數(shù)量達到4.0×109cfu/ml，與其他發(fā)酵培養(yǎng)基的菌落數(shù)存在顯著差異。最終得到的最佳產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10g、淀粉10g、玉米漿5g、硫酸銨1.5g、磷酸二氫鉀0.5g、碳酸鈣1g、水1l。表5因素與水平的設(shè)置表6hz-9菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化數(shù)據(jù)分析注：數(shù)據(jù)后面的大寫字母為處理間的多重比較結(jié)果，α=0.01。實施例5甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9菌劑的制備（1）菌種活化：將低溫保存的hz-9菌株劃線或涂布接種于lb固體培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)24-36h；挑取單菌落再次劃線轉(zhuǎn)接于lb固體培養(yǎng)基上平板上，30℃下培養(yǎng)16-24h，備用。（2）一級種子液制備：用接種環(huán)刮取兩環(huán)已活化的hz-9菌株菌苔，接種于50ml的lb液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)16h，備用。（3）二級種子液制備：將步驟（2）所得的一級種子液按照1%-2%（體積百分比）的接種量接入2噸發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)制備的二級種子液，轉(zhuǎn)速120r/min、溫度30-32℃、通氣量6m3/h、罐壓0.05-0.06mpa，培養(yǎng)12-16h，作為二級種子液；所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基。（4）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（3）所得二級種子液按照10%（體積百分比）的接種量接入20噸發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，轉(zhuǎn)速120r/min、溫度為30-32℃、通氣為量60m3/h、罐壓0.05-0.06mpa，培養(yǎng)時間為24-28h，芽孢得率大于90%，即得到hz-9菌株的液體菌劑；所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基。（5）固體菌劑制備：將發(fā)酵完成的hz-9菌株發(fā)酵液，經(jīng)碟式離心機6700r/min離心，收集所有沉淀物泵入攪拌器，慢慢加入玉米粉作為載體基質(zhì)，加入玉米粉的量為沉淀物的6-10%（w/w），攪拌均勻后被輸送至離心式噴霧干燥機，通過霧化器分散和高溫空氣迅速蒸干，料液中的固體物質(zhì)形成粉狀產(chǎn)品，最后通過旋風分離器收集，即得hz-9菌株的固體菌劑；所得固體菌劑中活體菌數(shù)可達1200億cfu/g。實施例6甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9對紅掌葉斑病的防控效果紅掌葉斑病病原菌菌液的制備：用接種環(huán)刮取紅掌葉斑病菌菌苔，放入無菌水中混合均勻，使其濃度達到1×106cfu/ml。選取大小長勢一致的健康紅掌幼苗，分為三個試驗處理：（1）ck空白：不施加病原菌和菌劑；（2）病原菌對照：施加病原菌，不施加菌劑；（3）菌劑處理：施加病原菌和菌劑。每個處理20株紅掌幼苗。其中，病原菌對照組和菌劑處理組，將紅掌幼苗傷根浸泡在濃度為1×106cfu/ml的病原菌菌液中30min；ck空白組將紅掌幼苗傷根浸泡在等量的清水中。浸泡后將紅掌幼苗移栽至直徑22cm的塑料盆中；菌劑處理組施加菌劑（實施例6制備的液體菌劑稀釋50倍）、每盆100ml，ck空白組和病原菌對照組施加等量清水；每隔7天再重復(fù)施入等量的菌劑及清水；試驗期間，各處理盆栽管理措施一致，每天觀察各處理的發(fā)病情況，待病原菌對照組的發(fā)病率達到80%以上時，調(diào)查各處理的病情指數(shù)、測量株高并計算相對防效。經(jīng)過跟蹤觀察，紅掌幼苗在移栽20天時，ck空白組沒有發(fā)病，病原菌對照組和菌劑處理組開始發(fā)病，待移栽35天時病原菌對照組的紅掌幼苗發(fā)病率達到80%以上。調(diào)查各處理的病情指數(shù)，病原菌對照組的病情指數(shù)為25.32、相對防效為0，菌劑處理組的病情指數(shù)為12.64、相對防效為50.1%；結(jié)果如表7所示。試驗結(jié)果表明hz-9菌株菌劑對于紅掌細菌性葉斑病具有較好的防治效果。表7甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌hz-9菌株對紅掌葉斑病的防控效果<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其菌劑的制備和應(yīng)用<160>1<210>1<211>1454<212>dna<213>人工合成<400>1agggcgggcgtgctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgt60tagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgg120gaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggc180ttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctc240accaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagaca300cggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctga360cggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaa420gaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggct480aactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattggg540cgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccgggg600agggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtag660cggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgta720actgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccac780gccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacg840cattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggg900ggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccag960gtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacag1020gtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagc1080gcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgac1140aaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacac1200acgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaa1260atctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagt1320aatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtca1380caccagagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccga1440aaggtgaccaaggt1454當前第1頁12