專利名稱：在甲基營養(yǎng)型酵母中表達(dá)乙型肝炎前s的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)領(lǐng)域。一方面，本發(fā)明涉及提高基本上由前S2蛋白組成的抗原顆粒在甲基營養(yǎng)型酵母中之表達(dá)能力的方法;另一方面，本發(fā)明涉及新的DNA分子及由其轉(zhuǎn)化的新的酵母菌株。
B型肝炎病毒(HBV)可引起急性和慢性肝臟疾病，并可造成全球性的社會保健問題。HBV表現(xiàn)以慢性感染作用，其可引起進(jìn)行性嚴(yán)重肝損傷，原發(fā)性肝癌和死亡。在大多數(shù)情況下，受HBV感染的病人能徹底恢復(fù)。但也有相當(dāng)一部分人在遭受HBV感染后成為疾病的慢性攜帶者，而有可能將疾病傳播給別人。
近年來由于DNA重組技術(shù)的進(jìn)展，已出現(xiàn)了許多揭示HBV之基因結(jié)構(gòu)及制備抗HBV疫苗的方法?，F(xiàn)已知道HBV基因組由大約3，200個堿基對的雙鏈DNA組成，并有一共價連接的DNA聚合酶分子一起包裹在27nm核殼體中。核殼體則被包藏在由細(xì)胞脂質(zhì)和B型肝炎表面抗原(HBsAg)組成的脂蛋白外殼中;這就是所說的病毒顆粒，其直徑為42nm。
也已發(fā)現(xiàn)病毒外殼包含三種不同但相關(guān)的表面蛋白質(zhì)。一般將這些蛋白質(zhì)稱為S、前S2和前S1蛋白。每個病毒顆粒包含300-400個S蛋白分子、40-80個前S2和前S1蛋白分子。
S蛋白由226個氨基酸組成，并且是正常病毒脂蛋白外殼的主要成分。S蛋白分子量約為24-25千道爾頓(KDa)并可稱為P24或P25。S蛋白也可被糖基化為稱作GP27或GP28的27-28千道爾頓的糖蛋白。
第二種HBs Ag(乙型肝炎病毒表面抗原)蛋白是前S2表面抗原，也稱為中期HBs Ag多肽。前S2包含281個氨基酸，由在S蛋白的N末端加上55個氨基酸而形成的。前S2蛋白分子量約為31千道爾頓，并可稱為p31蛋白。前S2也有33千道汞頓和36千道爾頓兩種糖基化的形式，分別稱為GP33和GP36。據(jù)信該抗原可在對S無反應(yīng)或反應(yīng)微弱者體內(nèi)引起另一種抗原反應(yīng)。
第三種HBs Ag蛋白是前S1表面抗原，也稱為晚期HBs Ag多肽。前S1由389-400個氨基酸組成(根據(jù)HBV的抗原亞型而異)。它是將一段含有108-119個氨基酸的屬于前S1的氨基酸序列加到完整前S2蛋白的N端而形成的。前S1蛋白分子量約43千道爾頓，并可稱為P43蛋白。前S1也有一種基化形式，分子量為46千道爾頓，稱為GP46糖蛋白。
在HBV感染的過程中，完整的病毒核殼體被包在脂蛋白外殼內(nèi)形成42nm顆粒。HBV感染期間還可形成主要含S和前S2蛋白及某些前S1蛋白的中空的22nm顆粒。雖然完整的病毒核殼體有感染性，但22nm中空顆粒則沒有感染性。但中空顆?？梢l(fā)免役系統(tǒng)足夠的免疫反應(yīng)，并可用于制備抗HBV疫苗。
從前，用于制備B型肝炎疫苗的22nm顆粒是從HBV攜帶者的血漿中制得的。但必須對得自人血漿的22nm顆粒充分純化，以除去感染性HBV顆粒以及其它存在于血漿的病原體。再者，由于人血漿的來源有限，而使B型肝炎疫苗的制備受到極大的限制。
利用DNA重組技術(shù)，已經(jīng)有可能在轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞系及酵母中表達(dá)22nm顆粒的S蛋白。
試圖生產(chǎn)抗原性和可能作為有效疫苗的前S2蛋白的努力迂到很大困難。已發(fā)現(xiàn)前S2蛋白對重組系統(tǒng)中的蛋白水解作用十分敏感。水解作用產(chǎn)生兩個失去了前S2抗原性的較小片段。另外，前S2蛋白很難在重組系統(tǒng)中表達(dá)。前S2的表達(dá)水平大約是在同一重組系統(tǒng)中表達(dá)S蛋白水平的十分之一。
因此，建立一種生產(chǎn)主要由非糖基化HBV前S2蛋白組成之HBV抗原顆粒的方法，將是對本領(lǐng)域的重要貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的一個目的在于提供一種以較高產(chǎn)率生成主要由非糖基化HBV前S2蛋白組成之HBV抗原顆粒的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼前S2蛋白之DNA順序的新的載體。
本發(fā)明的再一個目的是提供用能夠增加由前S2蛋白組成之HBV抗原顆粒生產(chǎn)的一種或多種載體轉(zhuǎn)化的新的甲基營養(yǎng)型酵母。
本發(fā)明的再一個目的是提供用生產(chǎn)主要由非糖基化前S2蛋白組成HBV抗原顆粒的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。
根據(jù)本文公開的內(nèi)容及權(quán)利要求，將會進(jìn)一步了解本發(fā)明的這些和其它的目的。
根據(jù)本發(fā)明，我已發(fā)現(xiàn)提高抗原性HBV顆粒生產(chǎn)的方法包括(1)用至少一種載體轉(zhuǎn)化甲基營養(yǎng)型酵母，所說的載體具有一個含有前S2結(jié)構(gòu)基因的可相容的表達(dá)暗盒;(2)在適于生產(chǎn)顆粒的條件下培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體。


圖1顯示了含有HBV adw血清型的前S2基因。質(zhì)粒AM6是圖1所示HBV基因組的衍生物，其中pBR322質(zhì)粒是在26位BamHⅠ位點插入的。
圖2顯示質(zhì)粒pYM4，是在BamHⅠ位點插入巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)HIS4基因的pBR322的衍生質(zhì)粒。括號標(biāo)示被破壞的酶切位點。HIS4基因寄存在pYJ30(NRRL-15800)之中。
圖3顯示質(zhì)粒pYM10。PYM10是pYJ30(NRRLB-15890)的衍生物，其在2959位的BamHⅠ位點已被破壞。圖中括號標(biāo)示被破壞的限制性酶切位點。
圖4顯示質(zhì)粒pA0804，其在順鐘向由BglⅡ到BglⅡ的片段中含有一個線性的整合位點特別性載體。結(jié)構(gòu)基因可被插入該質(zhì)粒的唯一的EcoRⅠ位點中。
前S2結(jié)構(gòu)基因是本領(lǐng)域中已知的，已由L0測定了它的順序(Characteristics of Pre S Region of Hepatitis BVirus，135 Biochemical and Biophysical Research Communications 382，1986)。本領(lǐng)域內(nèi)的許多研究人員已克隆了該結(jié)構(gòu)基因并已表達(dá)成功(如見L0和Valenzuela，Synthesis and Assembly in Yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containing the Polyalbumin Receptor，3Biotechnology 317，1985)。因此可由本領(lǐng)域的研究者處得到該結(jié)構(gòu)基因，或者合成或再分離到該結(jié)構(gòu)基因。任何前S2血清型均可用于本發(fā)明的實踐中。
用于本發(fā)明實踐的前S2結(jié)構(gòu)基因adw血清型是由質(zhì)粒AM6得到的。質(zhì)粒AM6是圖1所示HBV基因組的衍生物，其中在位于26的BamHⅠ酶切點插入了pBR322質(zhì)粒。表1中給出該前S結(jié)構(gòu)基因的核苷酸順序。可在任何合適的大腸桿菌宿主(如MC1061)中培養(yǎng)本發(fā)明所用的質(zhì)粒。
由質(zhì)粒AM6中回收前S結(jié)構(gòu)基因的兩個片段，并在體外合成N端前13個氨基酸的核苷酸序列?？捎没瘜W(xué)或酶學(xué)方法合成用于本發(fā)明的核苷酸序列，如使用基于磷酸三酯或亞磷酸鹽化學(xué)的化學(xué)合成法。
含有75%前S2結(jié)構(gòu)基因的C端編碼區(qū)是用內(nèi)切酶Dral消化質(zhì)粒而得到的。Dral消化是使用商品DraⅠ核酸內(nèi)切酶完成的(所有核酸內(nèi)切酶均按照制造商推薦的方法使用)。然后用苯酚提取Dral片段并用乙醇沉淀之。
然后依照標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)制備一個八個堿基對的StuⅠ接頭(AAGGCCTT)，并使用T4連接酶以平頭連接法連接到DraⅠ片段上。用苯酚提取以終止連接反應(yīng)，然后用乙醇沉淀。再用StuⅠ核酸內(nèi)切酶消化所得片段以除去StuⅠ的多聚體。
然后用XbaⅠ消化StuⅠ連接的片段。用凝膠電泳法分離所得到含前S2結(jié)構(gòu)基因之C湍編碼區(qū)的約600bp長的StuⅠ/XbaⅠ片段。
然后用T4連接酶將該600bp片段連接到已用瓊脂糖凝膠電泳法分離到的質(zhì)粒pYM4的5.7kaXbaⅠ/StuⅠ水解片段中(圖2)。
然后將連接混合物直接用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(MC1061)，并在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)之。
篩選轉(zhuǎn)化成功的菌落并用Birnboim和Doly所述的方法(NucleicAcidsResearch71513，1979)提取質(zhì)粒DNA。
用StuⅠ消化所提取的質(zhì)粒DNA，用苯酚提取并經(jīng)乙醇沉淀。制備EcoRⅠ接頭并用T4連接酶將其連接到StuⅠ片段上。用EcoRⅠ消化以除去多余的接頭。進(jìn)一步用XbaⅠ消化這些EcoRⅠ連接的片段并經(jīng)電泳分離含有前S2結(jié)構(gòu)基因之C端部分的片段。
將XbaⅠ-EcoRⅠ消化產(chǎn)物連接到用XbaⅠ-EcoRⅠ切割的pUC18中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(MC1061)中，然后于氨芐青霉素存在下培養(yǎng)所得細(xì)胞。使用ClaⅠ和XbaⅠ經(jīng)片段消化分析法選擇含有前S2結(jié)構(gòu)基因之C端部分的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用該方法篩選到的質(zhì)粒定名為pHS2-B。
用XbaⅠ和BamHⅠ一次消化質(zhì)粒AM6回收前S2基因的中間部分。經(jīng)凝膠電泳分離所要的250bp片段。然后將此250bp XbaⅠ/BamHⅠ片段連接到已用XbaⅠ和BamHⅠ消化過的pVC18中，并用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061。通過回收質(zhì)粒DNA并用BamHⅠ消化來分析生長于含氨芐青霉之培養(yǎng)基中的細(xì)胞。經(jīng)電泳分析，證明這些含有2.7kb線性片段的質(zhì)粒具有所需的250bp片段。分離一個含有250bp片段的轉(zhuǎn)化菌株并進(jìn)行大量培養(yǎng)。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化由該菌落中分離并純化的質(zhì)粒DNA。用電泳法分離載體帶。然后使載體與下列已用激酶處理過的雙鏈寡核苷酸相連接PstIBamHI5′AATTCAATCCGTCTGCAG3′3′GTTAGGCAGACGTCCTAG5′用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061并根據(jù)氨芐青霉素抗性選擇含正常插入片段的菌落。該質(zhì)粒定名為pPS2。
為制備前S2的N端編碼區(qū)，合成具有下列順序的寡核苷酸HindIII5′AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA3′ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG5′將該順序克隆到pUC18的HindⅢ和PstⅠ消化片段中。經(jīng)EcoRⅠ消化和電泳后，根據(jù)存在一大約75bp片段來鑒定所需的轉(zhuǎn)化體。將用該方法篩選的質(zhì)粒定名為pTBO-2A。
經(jīng)用PstⅠ和XbaⅠ消化載體pIBO-2A而加入該基因的中間部分;該插入片段是得自pPS2的250bp PstⅠ-XbaⅠ片段。根據(jù)存在＞300bp的EcoRⅠ片段以及290bp XbaⅠ/Hind Ⅲ片段確定轉(zhuǎn)化體。將該正確的分離物稱為pTBO-3。將來自pTBO-3的Hind Ⅲ/XbaⅠ片段插入XbaⅠ/Hind Ⅲ消化的pHS2B中即構(gòu)成完整的前S2基因。該構(gòu)建物被稱為pTBO4。
可用適當(dāng)方法培養(yǎng)上述大腸桿菌菌株。培養(yǎng)大腸桿菌的一般技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，而根據(jù)本發(fā)明所用菌株的特殊要求，對所用方法作適當(dāng)改進(jìn)將是本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員能夠作到的。
可根據(jù)其致密程度和環(huán)形超螺旋型，用幾種不同的技術(shù)回收大腸桿菌的質(zhì)粒DNA。例如可在收獲后離心沉淀宿主細(xì)胞，然后懸浮并溶菌。離心溶菌產(chǎn)物以除去細(xì)胞碎片，并保留含DNA的上清液。然后進(jìn)行苯酚提取以從DNA中除去大部分其它污染物。然后用密度梯度離心法或凝膠過濾技術(shù)進(jìn)一步處理苯酚抽提的DNA，以使質(zhì)粒DNA與細(xì)菌DNA分離開。完成上述分離的技術(shù)是已知的，而且所用的各種方法也是已知的。
可選擇適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶消化，所選擇的酶應(yīng)能以利于回收前S2結(jié)構(gòu)基因的方式切割所選擇的質(zhì)粒。應(yīng)根據(jù)欲從中切掉前S2基因的質(zhì)粒選用核酸內(nèi)切酶。例如，質(zhì)粒AM6攜帶的前S2結(jié)構(gòu)基因可作為DraⅠ-Hind Ⅲ片段回收。
可用許多技術(shù)完成DNA的凝膠電泳(參見P.G.SealyandE.M.Southern，GelElectrophoresisofNucleicAcids-APracticalApproach，(D.RickuoodandB.D.Hames，eds.)p39(1982))?？筛鶕?jù)所用凝膠的不同使用不同的技術(shù)進(jìn)行洗脫，，如電洗脫、擴(kuò)散、凝膠溶融(瓊脂糖凝膠)或物理擠壓(瓊脂糖凝膠)。但應(yīng)明確的是，對于某些凝膠，如高質(zhì)量、低熔點的凝膠則不一定要洗脫。
一旦分離出含前S2結(jié)構(gòu)基因或其片段的片段，即應(yīng)在將其插入載體之前進(jìn)行另外的處理。這些處理可包括加入接頭或?qū)⑵涡蕹善筋^，但不僅限于這些。
分離了前S2結(jié)構(gòu)基因之后，即可將基因插入適當(dāng)?shù)募谆鶢I養(yǎng)型酵母載體(如質(zhì)粒)中。本發(fā)明實踐中優(yōu)選的載體是能與畢赤屬(Pichia)酵母，特別是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)相容的載體。
質(zhì)粒一直是DNA重組技術(shù)中所用的基本材料之一。質(zhì)粒是見于微生物中的染色體外的環(huán)形雙鏈DNA。已發(fā)現(xiàn)每個細(xì)胞可出現(xiàn)一個或多個質(zhì)?？截悺Ｙ|(zhì)粒DNA中包括了質(zhì)粒增殖所需的信息，正如細(xì)菌復(fù)制包括所需的復(fù)制原點。質(zhì)粒內(nèi)編碼的信息中還包括了一種或多種根據(jù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表型篩選質(zhì)粒的方法。由于存在表型或篩選標(biāo)志，如抗生素抗性基因或補(bǔ)償宿主生化途徑中缺陷的基因，從而可以識別、篩選和保留已被轉(zhuǎn)化之宿主細(xì)胞的克隆。
為了在甲基營養(yǎng)酵母中表達(dá)前S2結(jié)構(gòu)基因，必須將基因以可啟動的方式連接到5′調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止序列上，以形成表達(dá)暗盒，然后通過載體插入宿主細(xì)胞內(nèi)。
為清楚起見，將有關(guān)術(shù)語定義如下以可啟動方式連接調(diào)整有關(guān)組成部分的位置，以使之完成其啟動表達(dá)的功能。
調(diào)節(jié)區(qū)對各種刺激起反應(yīng)并影響mRNA轉(zhuǎn)錄速率的DNA序列。
3′終止序列指3′端至終止密碼間的序列，其功能在于導(dǎo)致多聚苷酸化以穩(wěn)定其mRNA。
“畢赤屬相容的”是指在畢赤屬酵母中能完成其正常功能的DNA順序，如得自畢赤屬酵母的調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止順序。
本發(fā)明實踐中優(yōu)選的是整合性載體，如歐洲專利申請86114700.7號中所述的、Cregg的線性位點特異性整合載體。這種載體包含至少一個所說的有序排列的順序1)第一個插入的DNA片段;2)可選擇的標(biāo)志基因;3)第二個可插入的DNA片段。
第一和第二個可插入的DNA片段，每個長度均至少為大約200個核苷酸，并具有與畢赤屬酵母之基因組DNA的某些部分同源的核苷酸順序。整合載體的各組分均有序排列而形成一線性DNA片段，這樣表達(dá)暗盒和用于篩選的標(biāo)志基因即定位于第一個可插入的DNA片段的3′端與第二個可插入之DNA片段的5′端之間。在有序排列的線性片段中，第一和第二個可插入的DNA片段相應(yīng)地定向如在其親代基因組中一樣。
用作第一和第二個可插入之DNA片段的核苷酸順序是與固有基因組位點(在該位點將發(fā)生基因修飾)的分離部位的核苷酸順序同源的。為此，如果基因組修飾發(fā)生在乙醇氧化酶基因位點上，所用的第一和第二個可插入的DNA片段將是與乙醇氧化酶基因位點的分離部位同源的順序。為了按本發(fā)明的方法進(jìn)行基因組修飾，兩個可插入的片段在線性片段中必須如其存在于親代基因組中一樣相應(yīng)定向?？捎米鞯诙偷诙€可插入之DNA片段的核苷酸包括選自乙醇氧化酶(AOX1)基因、二羥丙酮合成酶(DHAS1)基因、p40基因和HIS4基因的核苷酸順序。涉及AOX1基因、DHAS1基因、p40基因和HIS4基因的共同待批專利申請780，102號被列為本文參考文獻(xiàn)。
第一個可插入的DNA片段可含有一個可啟動的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)則可能包括用于表達(dá)暗盒的調(diào)節(jié)區(qū)。使用第一個可插入的DNA片段作為表達(dá)暗盒的調(diào)節(jié)區(qū)是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。圖4顯示了利用第一個可插入的DNA片段作為暗盒之調(diào)節(jié)區(qū)的載體。
如圖4所示，可將一個或多個插入位點及3′終止順序直接位于第一個可插入之DNA片段的3′側(cè)。線性位點特異性整合載體的這種構(gòu)型所具有另一優(yōu)點是提供了一個便于結(jié)構(gòu)基因插入的位點，而不必加入一段相容的3′終止順序。
用以轉(zhuǎn)化宿主菌株的DNA中至少還必需包括一個可供篩選的標(biāo)志基因。這將有助于篩選和分離那些已獲得轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)胞。該標(biāo)志基因可為對已轉(zhuǎn)化的生物體貢獻(xiàn)宿主所沒有的表型特征，如可使某種特定氨基酸生物合成途徑有缺陷的未轉(zhuǎn)化的宿主菌株恢復(fù)產(chǎn)生該特定氨基酸的能力，或者使宿主菌獲得抗生素的抗生等。
篩選的標(biāo)志基因可選擇得自巴斯德畢赤酵母和啤酒酵母的HIS4基因和ARG4基因、得自啤酒酵母的轉(zhuǎn)換酶基因(SUC2)或得自大腸桿菌可轉(zhuǎn)座成分Tn601或Tn909的G418磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以理解到，其它的DNA順序，如細(xì)菌質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等也可以摻入到本發(fā)明所使用的載體中。這些DNA順序使得上述載體可在細(xì)菌宿主中擴(kuò)增或保留。
如果第一個可插入的DNA片段不含有調(diào)節(jié)區(qū)，則需要一個合適的調(diào)節(jié)區(qū)以可啟動的方式連接到結(jié)構(gòu)基因上，以提供可啟動的表達(dá)暗盒。同樣，如果在插入位點沒有提供3′終止順序，便不能構(gòu)成完整的表達(dá)暗盒，而必須將-3′終止順序以可啟動方式連接到欲被插入的結(jié)構(gòu)基因上。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)了解，已經(jīng)鑒定了許多調(diào)節(jié)區(qū)并可與甲基營養(yǎng)型酵母一起使用。所說的調(diào)節(jié)區(qū)包括選自由啤酒酵母中分離酸性磷酸酶、半乳糖激酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素C、α-接合因子和3-磷酸甘油醛脫氫酶等的調(diào)節(jié)區(qū);特別是得自巴斯德畢赤酵母的醇氧化酶(AOX1)、二羥丙酮合成酶、(DAS1)、p40調(diào)節(jié)區(qū)及HIS4調(diào)節(jié)區(qū)等，但不止這些。用于本發(fā)明的優(yōu)選的調(diào)節(jié)區(qū)是根據(jù)它們對含甲醇培養(yǎng)基誘導(dǎo)能力而確定的，這樣的調(diào)節(jié)區(qū)包括AOX1、DHAS1、p40以及共同待批專利申請780，102號中所公開者。
本發(fā)明最優(yōu)選的調(diào)節(jié)區(qū)是AOX1調(diào)節(jié)區(qū)。
3′終止順序可用于表達(dá)暗盒或成為上述載體的一部分。當(dāng)以可啟動的方式連接到基因上時，3′終止順序可以起到終止、聚腺苷酸化和/或穩(wěn)定由結(jié)構(gòu)基因編碼之信使RNA的作用。用于本發(fā)明的3′終止順序的來源包括(但不僅限于)啤酒酵母、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)及畢赤酵母3′終止順序。其中優(yōu)選的是衍生于巴斯德畢赤酵母者，如AOX1基因、DHAS1基因、p40基因和HIS4基因的3′終止順序，但特別優(yōu)選的是AOX1基因的3′終止順序。
為完成本發(fā)明，最好使用線性轉(zhuǎn)化載體，如圖4所示之構(gòu)建物的BglⅡ片段。
可用任何適當(dāng)技術(shù)將前S2結(jié)構(gòu)基因插入適當(dāng)載體中，該方法選擇在適當(dāng)位點切斷載體，并致使至少一個含前S2結(jié)構(gòu)基因的可啟動的表達(dá)暗盒存在于載體中。
可用適當(dāng)?shù)倪B接技術(shù)，如使用T4 DNA連接酶完成前S2結(jié)構(gòu)基因的連接。
可將連接混合物轉(zhuǎn)化到細(xì)菌宿主如大腸桿菌內(nèi)，以完成對前S結(jié)構(gòu)基因與載體之連接混合物的最初篩選、增殖和最適擴(kuò)增。適用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。論文，為在細(xì)菌宿主內(nèi)保留載體所必須的篩選標(biāo)志和細(xì)菌復(fù)制原點也是本領(lǐng)域中已知的。
可使用自宿主DNA中分離質(zhì)粒DNA的適當(dāng)方法，分離和純化表達(dá)系統(tǒng)中含前S2結(jié)構(gòu)基因的所需質(zhì)粒。
相似地，最好在增殖后檢驗經(jīng)連接作用所形成的載體，以證實前S2基因的存在，及其與調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止順序的可啟動的連接。這可借助多種技術(shù)來完成，這些技術(shù)包括(但不僅限于)核酸內(nèi)切酶消化、凝膠電泳或核酸內(nèi)切酶消化-Southern印跡雜交。
可使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)?；蚓€性載體轉(zhuǎn)化到酵母宿主內(nèi)，這些技術(shù)包括(但不僅限于)Hinnen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.75，1929(1978)、Ito等人(J.Bacteriol.153，163(1983))、Cregg等人(Mol.CellBiol.5，3376(1985))或Kreekrishna等人(Gene59，115(1987))所描述者。本發(fā)明實踐中最好使用Cregg的轉(zhuǎn)化技術(shù)。操作中需要使用過量的線性載體，并使用Southern雜交技術(shù)對多種插入進(jìn)行篩選。
所轉(zhuǎn)化的酵母宿主可以是任何適用的甲基營養(yǎng)型酵母。甲基營養(yǎng)型酵母包括(但不僅限于)選自漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Rhodotoruld)的、能在甲醇基質(zhì)上生長的酵母。C.Anthony在TheBiochemistryofMethylotrophs，269(1982)中列出了這類酵母的某些特定種。其中最好是畢赤酵母的甲基營養(yǎng)型酵母，如營養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母GS115(NRRLY-15851)。因此易于選擇，所以營養(yǎng)缺陷型甲基營養(yǎng)酵母很適用于本發(fā)明。如果選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化標(biāo)志基因，也可使用野生型甲基營養(yǎng)酵母并獲得同樣的成功，如可使用SUC2將巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化為能夠在蔗糖上生長的菌株，或者使用抗生素抗性標(biāo)志，如G418基因。
可使用適當(dāng)技術(shù)來篩選已轉(zhuǎn)化的甲基營養(yǎng)酵母，這些技術(shù)包括(但不僅限于)在轉(zhuǎn)化后沒有(由于細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷)所要求的生化產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)原營養(yǎng)缺陷細(xì)胞，通過檢驗新的表型(“methanolslow”)或在對轉(zhuǎn)化體內(nèi)沒有相應(yīng)抗性基因的酵母有毒性的抗生素存在下培養(yǎng)細(xì)胞而進(jìn)行篩選。
可用適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵技術(shù)，如搖瓶發(fā)酵法、高密度發(fā)酵法或Cregg等人(High-LevelExpressionandEfficicentAssemblyofHepatitisBBurfaceAntigenintheMethylotrophicYeast，PichiaPastoris，5Bio/Technoloqy479(1987))公開的發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)已分離的、轉(zhuǎn)化之甲基營養(yǎng)型酵母細(xì)胞。
可用適于利用調(diào)節(jié)區(qū)的方法完成表達(dá)。顯然如果利用的是甲醇反應(yīng)性調(diào)節(jié)區(qū)，可以將營養(yǎng)性培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含適量醇培養(yǎng)基中啟動調(diào)節(jié)區(qū)而誘導(dǎo)表達(dá)。
可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如先破碎細(xì)胞然后離心除去細(xì)胞碎片，從經(jīng)過足夠長時間誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化下表獲得粗制品中回收抗原顆粒。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的許多從單細(xì)胞宿主微生物中提取異源性蛋白質(zhì)的方法，均可用來代替上述的一般提取技術(shù)，或用于進(jìn)一步純化所需產(chǎn)品。Gregg等人于1988年4月13日提交的專利申請中公開的純化方法可作為本發(fā)明實踐中優(yōu)先選用的方法(該文獻(xiàn)代理案號為[32342US]，并已列入本文參考文獻(xiàn))。
下列實施例旨在進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
各實施例均使用巴斯德畢赤酵母GS115(his4)NRRLY-15851作為宿主酵母菌株。
培養(yǎng)基YPD，1升10g酵母浸膏20g蛋白胨20g葡萄糖LB培養(yǎng)液，1升5.0g酵母浸膏(Difco)10.0g胰蛋白胨(Difco)5.0gNaCl實施例1載體pTBO4的構(gòu)建質(zhì)粒AM6是圖1所示HBV基因組的衍生物，其中在26位BamHⅠ酶切點處插入了質(zhì)粒pBR322。
載體pTBO4含有編碼B型肝炎表面抗原281氨基酸前S2蛋白的基因。該基因是由三個片段構(gòu)建成的包括75%結(jié)構(gòu)基因的C端、編碼13個氨基酸的N端接頭，以及其余的中間部分。含有前S2基因(adw血清型)的質(zhì)粒AM6是本發(fā)明所用的前S2基因之C端部分及中央部分的來源。Valenzuela等人[ICN-UALA Symposia on Animal Virus Genetics，p57-70(1980)]公開了該順序，其中有下列修飾天然序列ATG-CAG-TGG-AAT-TCC誘變序列ATG-CAG-TGG-AAC-TCCA.前S2的C端部分(所有限制性內(nèi)切酶均購自BoehringerMannheim公司，并均按制造商推薦的方法使用)。
用DraⅠ酶切割質(zhì)粒AM6，將在其中的B型肝炎病毒基因上兩個位點上切斷，(圖1)，從中分離C端部分，其中一個切點在表面抗原最后一個氨基酸的密碼子處。在30μl反應(yīng)體積中用牛小腸堿性磷酸酶處理以使末端去磷酸化(在50m M Tris·Cl(PH 9.0)、1mM MgCl2、100μM ZnCl2、1mM精脒中用1單位酶于37℃處理1小時)。用苯酚提取全部消化產(chǎn)物并用乙醇沉淀(Maniatis等)。用DNA合成儀(Applied BiosystemsModel 380A)，通過氰乙基氨基磷酸酯法合成八個堿基的StuⅠ接頭(AAGGCCTT)。取1μg等分部分并在含70mM Tris·Cl、PH7，6，10mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mMATP和10單位多核苷酸激酶的總反應(yīng)體積為50μl的溶液中，于37℃用磷酸鹽標(biāo)記30分鐘。將接頭加熱到90℃以終止酶促反應(yīng)，并緩慢冷卻到室溫以利于雙鏈DNA形成。將StuⅠ接頭加到上述DraⅠ消化產(chǎn)物中并用T4連接酶按下述方法連接之在10μl含有6.6M Tris·Cl，PH7.6，5mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和1Weiss單位T4連接酶的反應(yīng)混合物中，于23℃反應(yīng)1小時。經(jīng)苯酚提取及繼后的乙醇沉淀而終止連接反應(yīng)。然后用大于50單位的StuⅠ酶處理過夜，以除去StuⅠ接頭的多聚體。經(jīng)DraⅠ消化后加上StrⅠ接頭，便恢復(fù)了因DraⅠ消化所除去的翻釋終正密碼子。
用XbaⅠ消化StuⅠ連接的DraⅠ片段，結(jié)果生成約600bp的所需StuⅠ/XbaⅠ片段;可由0.8%制備性瓊脂糖凝膠中將其分離出來。然后將該含有基因C端75%片段克隆到已用XbaⅠ和StuⅠ消化的載體pYM4(圖2)中，并按上述方法去磷酸化(可用ClaⅠ消化質(zhì)粒pYM30并再連接兩末端得到pYM4)。包含pYM30的大腸桿菌宿主細(xì)胞寄存在NorthernRegionalResearchCenter，UnitedStatesDepartmentofAgriculture，Peoria，Illinois，寄存號為NRR7B-15890)。由0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離pYM4的5.7kb限制性片段。使用載體pYM4僅因其具有便于利用的限制性酶切點。在總反應(yīng)應(yīng)積為10μl的50mMTris-HCl(PH7.4)、10mM MgCl、10mM二硫蘇糖醇、1mM亞精胺、1mM ATP中，于23℃用1 Weiss單位T4連接酶連接50ng載體和500ng插入片段。直接用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)MC1061細(xì)胞(大腸桿菌)，使之產(chǎn)生氨芐青霉素抗性。大腸桿菌MC1061菌株可得自Northern Regional Research Center，United States Department of Agriculture，Peoria，Illinois，寄存號為NRRL-18016。MC1061具有下列表型F(-)，ara D139 δ(lac IPOZY)X74 galk galv hsr hsm(+)rpslδ(ara ABOIC leu)7697?？捎孟率龇椒ㄊ筂C1061成為感受態(tài)細(xì)胞以便轉(zhuǎn)化在Damon IEC DPR 600離心機(jī)中，以3，000rpm離心5分鐘收獲大腸桿菌MC1061的對數(shù)生長中期的培養(yǎng)物并在10m M NaCl中洗滌。將培養(yǎng)物再懸浮于25ml 50mM CaCl2中，于0℃放置30分鐘。按上述方法離心得到細(xì)胞并重新懸浮于2ml 50mM CaCl2中。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將連接反應(yīng)混合物加到100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中并在水浴中冷卻15分鐘，然后于37℃熱沖擊5分鐘后于23℃保溫5分鐘。將細(xì)胞直接鋪敷在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平皿上。平皿于37℃下保溫10～16小時。收獲所得菌落并用限制性消化法鑒定。將細(xì)胞在5ml含50μ/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中培養(yǎng)5小時(37℃)并用Birnboim和Doly[Nucleic Acids Research 71513(1979)]的方法制備DNA。用BamHⅠ和XbaⅠ消化微量制備物。產(chǎn)生1.5kb Xba/Bam消化之片段的培養(yǎng)物被視為具有插入片段，按上述方法純化培養(yǎng)物的大量DNA制品，然后進(jìn)行氯化銫-溴乙啶梯度離心分帶。該克隆稱為pHS1。
用StuⅠ消化質(zhì)粒pHS1，按上述方法去磷酸化、用苯酚提取并用乙醇沉淀。按前述方法合成EcoRⅠ接頭(GGAATTCC)、使之磷酸化、自身退火，并連接到修成平端的DNA上。用EcoRⅠ消化過夜以除去過量的接頭，并在經(jīng)苯酚提取和乙醇沉淀后用XbaⅠ消化DNA。經(jīng)1.0%制備性凝膠電泳分離相似600bpXbaⅠ-EcoRⅠ片段DNA及582bp(XbaⅠ-EcoRⅠ)載體片段之一。將這些片段(500ng)連接到XbaⅠ-EcoRⅠ消化并去磷酸化的上述pUC18(50ng)中，用以按上述方法轉(zhuǎn)化MC1061使之成為氨芐青霉素抗性菌株。檢測微量DNA的限制性消化產(chǎn)物，以確定兩片段中那一個已被克隆。不需要的片段有-ClaⅠ切點，從而ClaⅠ/XbaⅠ雙酶消化產(chǎn)物將產(chǎn)生大約560bp+2400bp的片段，而正確的片段在用ClaⅠ消化后則產(chǎn)生一個線性3kb片段。用EcoRⅠ和XbaⅠ消化待選擇的片段以產(chǎn)生600bp+2400bp片段。大量純化一個這樣的克隆并定名為pHS2-B。該克隆片段在其完整的前S2基因C端區(qū)域最后一個密碼子后面有一個EcoRⅠ位點。
B.前S2基因的中間部分按下述方法克隆前S2基因的中間部分。用XbaⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒AM6，并由0.8%制備瓊脂糖凝膠中分離250bp片段。按上述方法將該片段(50ng)連接到用XbaⅠ和BamHⅠ消化并去磷酸化的5ng pUC18上。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Mc1061以使之產(chǎn)生氨芐青霉素抗性。用BamHⅠ消化微量制備物并選擇含2.7kb線性片段的消化產(chǎn)物。選擇一個分離克隆大量培養(yǎng)并按上述方法分離和純化DNA。該克隆稱為pPS1。用EcoRⅠ和BamHⅠ切割該克隆并用0.8%制備瓊脂糖凝膠電泳分離和純化載體帶。將依上述方法合成的下列經(jīng)激酶處理的雙鏈寡核苷酸連接到該載體上。EcoRIPstIBamHI5′AATTCAATCCGTCTGCAG3′3′GTTAGGCAGACGTCCTAG5′用此連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061使之成為氨芐青霉素抗性菌株。經(jīng)用PstⅠ消化以鑒定微量制備物。選擇一個含250bpPstⅠ片段的克隆，進(jìn)行大量DNA制備并分離質(zhì)粒pPS2。
C.前S2基因的N端部分由按上述方法合成下列順序的寡核苷酸，其中包括EcoRⅠ接頭及前13個氨基酸編碼順序的N端區(qū)域HindIIIEcoRI5′AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA3′3′ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG5′該片段含有HindⅢ和Pst末端及在ATG前面的EcoRⅠ識別順序。將十倍過量的寡核苷酸克隆到經(jīng)HindⅢ和PstⅠ消化并去磷酸化的pUC18中，然而根據(jù)其是否存在一個小的EcoRⅠ位點(～75bp)而鑒定之。該克隆被定名為pTBO-2A。
用PstⅠ和XbaⅠ消化載體pTBO-2A以加入基因的中間部分;插入部分為得自pPS2的250bp Pst-Xba片段。根據(jù)大于300bp EcoRⅠ片段及290bp XbaⅠ/HindⅢ片段的存在來確定轉(zhuǎn)化體。篩選的正確克隆被稱為pTBO-3。將pTBO-3的HindⅢ/XbaⅠ片段插入XbaⅠ/HindⅢ消化hop HS2B中即得到完整的前S2基因。根據(jù)存在825bp EcoRⅠ片段來鑒定上述氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體，該構(gòu)建物被稱為pTBO4。
實施例2載體pTBO5A的構(gòu)建用于大腸桿菌宿主中的pAO804載體得自美國農(nóng)業(yè)部北方地區(qū)研究中心(NorthernRegionalResearchCenterofUnitedStatesDepartmentofAgriculture，Peoria，Illinois)，寄存登記號為NRRLB-18114。經(jīng)分離質(zhì)粒DNA得到pA0804、用EcoRⅠ消化，凝膠電泳以回收～7.5kb片段，該片段為在唯一的EcoRⅠ位點切斷的線性pA0804。
由載體pA0804和pTBO4(pTBO4是實施例1中制得的)構(gòu)建含有編碼前S2之基因的載體。按前述方法用EcoRⅠ消化2μg pA0804并在30μl反應(yīng)體積用堿性磷酸酶處理之(在50mM Tris·Cl PH9.0，1mM MgCl2、100μM ZnCl2、1mM亞精胺中用1單位酶于37℃處理1小時)。用EcoRⅠ消化pTBO4并得到含前S2基因的825bp片段。用0.8%瓊脂糖制備凝膠電泳純化該片段。使用實施例1中所述的方法連接500ng片段和50ng pA0804。使用實施例1所述的方法，用所得載體轉(zhuǎn)化MC1061，使之成為氨芐青霉素抗性菌株。依Birnboim和Doly[Nucleic Acids Research 11513(1979)]的方法分離DNA并用PstⅠ消化進(jìn)行鑒定。鑒定一含2.1kb PstⅠ片段的克隆，確定其具有正確定向的插入段，并定名為pTBO5A。
實施例3多拷貝前S2菌株GS115/p TBO5A(S10)和單拷貝菌株GS115/p TBO5A的建立在0.8%制備瓊脂糖凝膠上純化pTBO5A的5.9kbBglⅡ片段以產(chǎn)生多拷貝菌株GS115/pTBO5A(S10)。在實施例1中所述條件下使10μg片段自身連接過夜。根據(jù)在0.6%瓊脂糖凝膠上存在高分子量產(chǎn)物來監(jiān)測連接反應(yīng)混合物的各等分樣品。使用Cregg等人(Bio/Techmology5479-485，1987)所述的球型原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)以其轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115。在基本培養(yǎng)基上恢復(fù)轉(zhuǎn)化體并按下述方法篩選合適的突變表型。在無菌蒸餾水存在下經(jīng)刮取平皿的表面收集轉(zhuǎn)化菌株并以低輸出功率超聲處理15秒鐘。然后稀釋到A600＝0.1并以10-3和10-4稀釋度平鋪在含甘油(作為碳源)的基本培養(yǎng)皿上(各兩份)，于30℃下溫育2-3天。然后再以重復(fù)方式轉(zhuǎn)移至其中蒸發(fā)相內(nèi)加有100μl甲醇的小平皿上。于30℃溫育24小時后，可見10-20%的轉(zhuǎn)化株在甲醇上較之其他轉(zhuǎn)化株生長慢。然后選擇10個生長慢的菌落作進(jìn)一步分析。由含甘油的小培養(yǎng)皿中收集這些菌落，使之生長在實施例5所述的搖瓶中，并按實施例8中所述方法檢測22nM樣顆粒的活性。用Southern印跡分析法(Maniatis等)進(jìn)一步鑒定了一個活性提高了四倍的轉(zhuǎn)化株。將一個多拷貝轉(zhuǎn)化體的BglⅡ消化片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，并用缺口平移標(biāo)記的HIS4特異性探針即pYM4(pYM4如實施例Ⅰ所述)進(jìn)行探查。印跡中含有兩個雜交帶一個來自基因組HIS4位點，一個來自表達(dá)載體。得自多拷貝菌株中表達(dá)暗盒之各帶強(qiáng)度的比例，相對于標(biāo)準(zhǔn)化HIS4基因組帶的單一拷貝，其每個下表共產(chǎn)生4個拷貝。
以同樣方法產(chǎn)生單拷貝菌株GS115/pTBO5A，但省去片段自身連接反應(yīng)。
實施例4酵母DNA微量制備物104細(xì)胞/ml在5ml YPD中30℃培養(yǎng)過夜，然后用DamonIEC DPR600臨床離心機(jī)的3，000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于0.5ml的1M山梨醇、0.1ml 0.5M EDTA(PH7.5)中，并將樣品移入1.5ml微量離心管中。加入0.02ml濃度為2.5mg/ml的Zymolyase60，000(MilesLaboratories)并將樣品于37℃下保溫60分鐘。用微量離心管以高速離心1分鐘沉淀細(xì)胞，重新懸浮于0.5ml50mMTris·Cl(PH7.4)和20mMEDTA中。加入0.05ml10%SDS，混合均勻后于65℃下保溫30分鐘。加入0.2ml5M醋酸鉀并將樣品在冰上放置60分鐘。再將樣品在微量離心管中以高速離心5分鐘。
將上清液移入另一干凈的1.5ml微量離心管中并于室溫下加入1倍體積的異丙醇。混合樣品并于室溫下靜置5分鐘，然后在微量離心管中以高速短時間(10秒)離心。棄去上清并將細(xì)胞沉淀風(fēng)干。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于0.3ml10mMTris·Cl(PH7.4)和1mMEDTA中之后，加入1mg/ml胰RNase溶液，將樣品于37℃下保溫30分鐘。加入0.03ml3M醋酸鈉，混勻樣品并加入0.2ml異丙醇。在微量離心管中以高速度離心樣品以沉淀DNA。棄去上清，沉淀干燥后重新懸浮在0.1～0.3ml10mMTris·Cl(PH7.4)和1mMEDTA中。(注在DNA用于限制性酶切之前，必須在微量離心管中以高速度將溶液離心15分鐘，以除去可能會抑制消化過程的不溶性物質(zhì))。
實施例5搖瓶表達(dá)研究發(fā)酵之前，使所用菌株均生長于搖瓶中以確保有足夠的表達(dá)水表1對前SZ表達(dá)的分析%蛋白質(zhì)%蛋白質(zhì)菌株 AUSRIATMWestern1.GS115/PTBO5A0.11%0.23%2.GS115/pTBO5A(S10)0.31%0.63%實施例6發(fā)酵表達(dá)研究按下述方法進(jìn)行發(fā)酵。向Fernbach瓶中的500ml酵母氮基培養(yǎng)液(YNB)+2%甘油內(nèi)接種種子培養(yǎng)物或基本葡萄糖平皿培養(yǎng)物。(每月傳代以維持培養(yǎng)皿，應(yīng)沒有可測出的菌株損傷)。以200rpm和30℃下振蕩培養(yǎng)1天后，將菌接種到7.5升含480g甘油、40mg生物素和40ml微量鹽溶液(表Ⅲ)的基本培養(yǎng)基(表Ⅱ)中。發(fā)酵器保持30℃及PH5.5，培養(yǎng)物則以批量方式生長，直到甘油耗盡(約24小時)。加入NH3氣以控制PH。根據(jù)CO2釋放量的急劇降低和溶解氧的急劇增加(或氧攝取速率降低)來指示甘油耗平。一般作法是將轉(zhuǎn)化菌株接種到含2-5%甘油的0.67%酵母氮源培養(yǎng)基(YNB)中，于30℃溫育過夜，使之達(dá)到中至晚生長對數(shù)期。然后使用Damon IEC DPR600臨床離心機(jī)于3，000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。用無菌水將細(xì)胞沉淀洗滌兩次，然后以0.5A600單位/ml的密度接種到含1%甲醇的0.67%YNB中并以中速振蕩在30℃下培養(yǎng)4-6天。在不同時間取出50A600單位等分樣品并儲存于-20℃。由這些樣品制備的蛋白質(zhì)提取物用于AUSRIATM和Western印跡分析(分別見實施例8和7)。將細(xì)胞的等分樣品(100A600單位)移入13×100mm硅酸硼培養(yǎng)管中并通過在Sorvall RC-5B型離心機(jī)中以12，000rpm離心(4℃)用20倍體積的溶菌緩沖液(0.5M NaCl、0.1%Triton X-100(w/v)、1M苯甲基磺酰氟和10mM磷酸鈉，PH7.5)洗滌兩次。用0.5g酸洗的玻璃珠(0.5mm)加0.35ml溶菌緩沖液再懸浮細(xì)胞樣品，使用Vortex混合器以最大速度，每隔一分鐘攪拌一次共八次。攪拌間隔期間，混合物至少在冰上冷卻1分鐘。溶菌完成后，去除破碎之細(xì)胞溶液，用0.35ml溶胞緩沖液洗滌玻璃珠，合并兩溶液并使用SorvallRC-5B離心機(jī)以13，000rpm，4℃離心以除去細(xì)胞碎片。然后用AUSRIA法和Western印跡法分析蛋白質(zhì)樣品(見表1)。經(jīng)TCA(三氯醋酸)沉淀后用Lowry法測定蛋白濃度。盡。開始以18ml/小時供入甲醇以使發(fā)酵器內(nèi)含量達(dá)～0.5%MeOH，并維持在這一水平。根據(jù)甲醇的實際消耗率調(diào)整進(jìn)料流速。以大約2天間隔加入20ml等分的微量鹽溶液以維持甲醇消耗速率。供入甲醇期間HBsAg水平約持續(xù)增加三天。
表Ⅱ培養(yǎng)基組成(7.5升)480g甘油40mg生物素134ml H3PO4(85%)5.8g CaSO4·2H2O92g H2SO475g MgSO4·7H2O21gKOH
表ⅢIM1微量鹽溶液五水合硫酸銅0.06碘化鉀0.08一水合硫酸鎂0.30鉬酸鈉0.20硼酸0.02一水合硫酸鋅2.00一水合氧化鐵4.8硫酸5.00ml/升圖Ⅳ顯示了對由生長于發(fā)酵罐內(nèi)的菌株制得的提取物按實施例1所述方法作AUSR1 ATM分析的結(jié)果。
表Ⅳ菌株經(jīng)AUSRIATM測得的容積產(chǎn)率(mg/L)GS115/pTBO5A9GS115/pTBO5A(S10)60實施例7檢測和證實前S2的存在按實施例5中所述方法對溶解畢赤酵母細(xì)胞得到的蛋白質(zhì)作Western印跡分析。所用抗體購自CalBiochem，Lot＃702106、以1000倍稀釋的HBsAg特異性抗體。
另外，SDS/PAGE分析和對部分純化之蛋白制品的銀染色也證明了前S2多肽，即p31的存在。
實施例8AUSRIATM放射免疫分析法使用AbbottAUSRIA試劑盒檢測畢赤酵母生產(chǎn)體系合成的HBsAg量。試劑盒中的抗體與HBsAg顆粒結(jié)合，但不與HBsAg單體結(jié)合。所有稀釋液均在含1.0%BSA、0.02%迭氮鈉的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(PH7.4)中配制。所用方法基本上如藥盒使用說明書所述。依下述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
管號檢查的ng數(shù)緩沖液(μl)陽性對照(μl)1-4無NSB無200(只有緩沖液)5-60.119557-80.2190109-100.51752511-121.01505013-142.010010015-163.05015017-184.0無200
按下述方法標(biāo)記微量滴定極的各小孔AABBCCDD112342567839101112413141516517181920……各小孔內(nèi)先加入小珠，然后加緩沖液，最后加入標(biāo)準(zhǔn)(陽性對照)或稀釋的樣品。稀釋待測物以得到在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的結(jié)果。將估計的樣品濃度(mg/ml)除以0.02，得到所用的稀釋度。一般將100μl樣品加到含100μl緩沖液的小孔內(nèi)。附蓋各小孔并朝頂部輕輕敲擊托盤。然后在室溫下保溫過夜以得到最大結(jié)合效率。第二天早晨使用Abbott試驗室提供的Pentawash系統(tǒng)，用去離子水將各小孔洗4次。向各小孔內(nèi)加入200μlⅠ標(biāo)記的抗HBs抗體，輕輕敲擊托盤，然后于45℃水中保溫1小時。按前述方法洗小珠并作γ計數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定未知物的濃度。
權(quán)利要求
1.一種提高抗原性HBV顆粒生產(chǎn)量的方法，其包括a)用至少具有一個表達(dá)暗盒的至少一個載體轉(zhuǎn)化甲基營養(yǎng)型酵母，其中所說的表達(dá)暗盒含有以可啟動方式連接到調(diào)節(jié)區(qū)及3′終止序列上的前S2結(jié)構(gòu)基因；然后b)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所得已轉(zhuǎn)化的酵母菌株，從而得以產(chǎn)生所說的HBsAg前S2蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的載體選自于質(zhì)?；蚓€性的整合位點特異性載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中載體是線性的整合位點特異性載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的線性整合位點特異性載體含有下列連續(xù)排布的順序a)第一個可插入的DNA順序，b)一個標(biāo)志基因，及至少一個含前S2結(jié)構(gòu)基因的、以可啟動的方式與調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止序列連接的表達(dá)暗盒，及c)第二個可插入的DNA順序;其中成分(b)所述標(biāo)志基因及暗盒的次序可以互換。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第一個可插入的序列和第二個可插入的序列是由巴斯德畢赤酵母分離的、選自由AOX1、p40、DHAS和HIS4組成的那組中的一個基因的DNA順序衍生的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的表達(dá)暗盒包括a)一個選自從巴斯德畢赤酵母分離之AOX1、p40、DHAS，及從啤酒酵母分離之酸性磷酸酶、半乳糖苷酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素C、α接合因子和3-磷酸甘油醛脫氫酶的調(diào)節(jié)區(qū)，與該調(diào)節(jié)區(qū)以可啟動方式連接的b)前S2的結(jié)構(gòu)基因，與該結(jié)構(gòu)基因以可啟動方式連接的c)選自由AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HIS4基因分離之3′終止序列的巴斯德畢赤酵母3′終止序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的標(biāo)志基因選自從巴斯德畢赤酵母分離的HIS4和ARG4、由啤酒酵母分離的SUC2以及Tn903和Tn601的G418R基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的載體包括a)第一個可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母分離之AOX1調(diào)節(jié)區(qū)的約1千堿基，與該片段以可啟動方式連接的b)前S2的結(jié)構(gòu)基因，與該結(jié)構(gòu)基因以可啟動方式連接的c)由巴斯德畢赤酵母分離的AOX1的3′終止序列，該終止順序連接到d)由巴斯德畢赤酵母分離的HIS4標(biāo)志基因，該標(biāo)志基因連接到e)3′AOX1終止順序之大約0.65千堿基的第二個可插入的DNA片段。
9.一個線性的整合位點特異性載體，其包括下列連續(xù)排列的部分a)第一個可插入的DNA片段，b)以可啟動方式連接到調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止順序上的標(biāo)志基因及至少一個包含前S2之結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)暗盒，及c)第二個可插入的DNA順序;其中組分(b)中的標(biāo)志基因和暗盒的次序可以互換。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所說的第一個可插入的DNA片段和同樣的第二個可插入的DNA片段是由巴斯德畢赤酵母中分離的并選自AOX1、p40、DHAS和HIS4的基因的DNA順序衍生的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所說的表達(dá)暗盒包括a)一個選自由巴斯德畢赤酵母分離之AOX1、p40、DHAS和HIS4、由啤酒酵母分離之酸性磷酸酶、半乳糖苷酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素C、α-接合因子及3-磷酸甘油醛脫氫酶的調(diào)節(jié)區(qū)，與該調(diào)節(jié)區(qū)以可啟動方式連接的b)前S2的結(jié)構(gòu)基因，與該結(jié)構(gòu)基因以可啟動方式連接的c)選自從巴斯德畢赤酵母的AOX1基因，p40基因、DHAS基因和HIS4基因分離的3′終止序列的3′終止序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所說的標(biāo)志基因選自從巴斯德畢赤酵母中分離的HIS4、ARG4;從啤酒酵母分離的SUC2及細(xì)菌Tn903和Tn601的G148R。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所說的載體包括a)第一個可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母中分離的長約1千堿基的5′AOX1基因的可啟動調(diào)節(jié)區(qū)，與該調(diào)節(jié)區(qū)以可啟動方式連接的b)前S2的結(jié)構(gòu)基因，與該結(jié)構(gòu)基因以可啟動方式連接的c)由巴斯德畢赤酵母中分離的AOX1的3′終止順序，與該順序連接的d)從巴斯德畢赤酵母中分離的HIS41標(biāo)志基因，及與標(biāo)志基因連接的e)3′AOX1終止順序的長約0.65千堿基的第二個可插入的DNA片段。
14.用至少含一個表達(dá)暗盒的至少一個載體轉(zhuǎn)化的甲基營養(yǎng)型酵母，其中所說的表達(dá)暗盒包含一以可啟動方式連接到前S2結(jié)構(gòu)基因上的調(diào)節(jié)區(qū)，該結(jié)構(gòu)基因則以可啟動方式連接到3′末端終止順序上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的甲基營養(yǎng)型酵母，其中所說的酵母是巴斯德畢赤酵母。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的甲基營養(yǎng)型酵母，其中所說的酵母是巴斯德畢赤酵母菌株GS115。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的巴斯德畢赤酵母GS115菌株，其中所說的GS115菌株是用至少一個線性的整合位點特異性載體轉(zhuǎn)化的，所說的載體包含依次排列的a)第一個可插入的DNA片段;b)一個標(biāo)志基因和至少一個包括前S2結(jié)構(gòu)基因的相容的表達(dá)暗盒，與該結(jié)構(gòu)基因以可啟動方式連接的c)由巴斯德畢赤酵母的AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HIS4基因分離之3′終止順序篩選的3′終止順序，d)第二個可插入的DNA片段，其中組成成分(b)中標(biāo)志基因和暗盒的次序是可以互換的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的線性位點特異性整合載體，其中所說的載體包括a)由巴斯德畢赤酵母中分離的5′AOX1調(diào)節(jié)區(qū)之約1千堿基長的第一個可插入的DNA片段，與該片段以可啟動方式連接的b)前S2的結(jié)構(gòu)基因，與該基因以可啟動方式連接的c)由巴斯德畢赤酵母中分離AOX1基因的3′終止順序，與該終止順序連接的d)由巴斯德畢赤酵母中分離的HIS4標(biāo)志基因，以及與之連接的e)3′AOX1終止順序之大約65千堿基腸的第二個可插入的DNA順序。
19.巴斯德畢赤酵母GS115/pTBO5A。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母菌株GS115，其中所說的GS115菌株是用一個以上所說的線性的整合位點特異性載體的拷貝轉(zhuǎn)化的。
21.巴斯德畢赤酵母GS115/pTBO5A(S10)。
22.依權(quán)利要求1的方法制得的抗原性HBV顆粒。
全文摘要
一種提高主要由前S
文檔編號A61K39/29GK1040053SQ89102660
公開日1990年2月28日 申請日期1989年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1988年4月25日
發(fā)明者格里高利·P·黑歐 申請人:菲利浦石油公司