專利名稱：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法
發(fā)明的背景本發(fā)明涉及在棒桿菌中分泌生產(chǎn)外源蛋白，特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。用該方法分泌生產(chǎn)的外源蛋白質(zhì)是產(chǎn)業(yè)上有用的酶或有生理活性的蛋白質(zhì)等，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被廣泛地應(yīng)用于食品加工和制藥領(lǐng)域等中。
到目前為止，對于外源蛋白質(zhì)的分泌生產(chǎn)已有很多報(bào)道，如有關(guān)利用桿菌屬細(xì)菌分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的綜述[Microbiol.rev.，57，109-137(1993)]，利用甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris分泌生產(chǎn)外源蛋白的綜述[Biotechnol.，11，905-910(1993)]，以及利用曲霉菌屬霉菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的報(bào)道[Biotechnol.，6，1419-1422(1988)；Biotechnol.，9，976-981(1991)]等。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，分泌生產(chǎn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是催化位于蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)的γ-羧酰胺基的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。該酶作用于蛋白質(zhì)時，可以通過形成ε-(γ-Glu)-Lys橋及Gln脫酰胺化，產(chǎn)生Gln置換為Glu的反應(yīng)。該轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可用于果凍等膠狀食品、酸奶酪、干酪、或膠狀化妝品等的制造或改善肉類食品的肉質(zhì)等(特開平1-50382)。另外該酶也可用于制備熱穩(wěn)定微膠囊的材料、固定化酶的載體等，是工業(yè)上利用性高的酶。
到目前為止，已知有源于動物和源于微生物(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，以下略作“MTG”)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。源自動物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是依賴于鈣離子的酶，分布在動物的臟器、皮膚、血液等。例如，有豚鼠肝臟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(K.Ikura et al.Biochemistry 27，2898(1988))，人表皮角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(M.A.Phillips et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose et al.Biochemistry 25，6900(1990))。
源自微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶有在鏈輪絲菌(Streptoverticillium)屬細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的鈣非依賴性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。這樣的細(xì)菌，例如灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)IFO 12776、肉桂鏈輪絲菌肉桂亞種(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下略作S.cinnamoneum)IFO 12852、茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraense)(以下略作S.mobaraense)IFO 13819(特開昭64-27471)等。這些微生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的一級結(jié)構(gòu)經(jīng)肽譜以及基因結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果表明與源自動物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶完全沒有同源性(歐洲專利公開公報(bào)0481 504 A1)。
源自微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)由于是從上述菌類等的培養(yǎng)物經(jīng)純化操作制備的，所以在供給量、效率等方面存在問題。因此也正在嘗試通過基因工程技術(shù)來制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及其基因，例如在Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)、Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，88-92(1994)、Biochimie，80，313-319(1998)、Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)、WO96/06931、WO 96/22366等中已有報(bào)道，其中有關(guān)于利用淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)、oryzae曲霉菌(Aspergillusoryzae)、大腸桿菌(Escherichia coli)等宿主載體系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的報(bào)道。除此之外，還有通過E.coli、酵母等微生物分泌表達(dá)(特開平5-199883)的方法，以及通過大腸桿菌將MTG以非活性融合蛋白質(zhì)包涵體表達(dá)后，再用蛋白質(zhì)變性劑溶解，經(jīng)去除變性劑使其復(fù)性來生成有活性的MTG的方法的報(bào)道(特開平6-30771)。然而，在E.coli、酵母等微生物的分泌表達(dá)中存在著其表達(dá)量非常少的問題。
而為了利用棒桿菌有效分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的研究到目前為止已有一些報(bào)道，如利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)(以下略作C.Glutamicum)分泌核酸酶(nuclease)或脂肪酶[US4965197，J.Bacteriol.，174，1854-1861(1992)]以及枯草桿菌蛋白酶等蛋白酶[Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)]的研究，有關(guān)棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的分泌的研究[特表平6-502548]，在以上研究基礎(chǔ)上展開的纖連蛋白結(jié)合蛋白分泌的研究[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]和利用變異型分泌手段提高蛋白質(zhì)分泌的研究報(bào)道[特開平11-169182]等，但只是有關(guān)極其有限的蛋白質(zhì)的極少數(shù)的報(bào)道。從蛋白蓄積量來看，雖然有在Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)文獻(xiàn)中報(bào)道的利用源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的枯草桿菌蛋白酶基因(aprE)的啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及信號肽的序列使源自節(jié)瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)的堿性蛋白酶的基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)，確認(rèn)蓄積了大約2.5mg/ml的該蛋白的例子，但在US4965197、特表平6-502548、特開平11-169182的描述中都沒有記載具體的分泌蓄積的蛋白量，而在分泌纖連蛋白結(jié)合蛋白[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]的報(bào)道中被確認(rèn)的分泌蓄積量最大不過是約為2.5μg/L的非常少的量。所以使外源蛋白以實(shí)用水平有效地蓄積在培養(yǎng)基中的報(bào)道還未看到。
棒桿菌的基因操作技術(shù)是通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的建立[J.Bacteriol，159，306-311(1984)；J.Bacteriol，161，463-467(1985)]、各種載體的開發(fā)[Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)；J.Bacteriol，159，306-311(1984)；J.Gen.Microbiol.，130，2237-246(1984)；Gene，47，301-306(1986)；Appl.Microbiol.Biotechnol.，31，65-69(1989)]、基因表達(dá)調(diào)控法的開發(fā)[Bio/Technology，6，428-430(1988)]、粘粒的開發(fā)[Gene.39，281-286(1985)]等、以及利用質(zhì)粒和嗜菌體系統(tǒng)發(fā)展起來的。另外有關(guān)源自棒桿菌的基因克隆也有報(bào)道[Nucleic AcidsRes.，14，10113-1011(1986)；J.Bacteriol，167，695-702(1986)；Nucleic Acids Res.，15，10587(1987)；Nucleic Acids Res.，15，3922(1987)；Nucleic Acids Res.，16，9859(1988)；Agric.Biol.Chem.，52，525-531(1988)；Mol.Microbiol.，2，63-72(1988)；Mol.Gen.Genet.，218，330-339(1989)；Gene，77，237-251(1989)]。
另外，有關(guān)源自棒桿菌的轉(zhuǎn)移因子也有報(bào)道[WO93/18151；EP0445385；特開平6-46867；Mol.Microbiol.，11，739-764(1994)；Mol.Microbiol.，14，571-581(1994)；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；FEMS Microbiol.Lett.，126，1-6(1995)；特開平7-107976]。
所謂轉(zhuǎn)移因子是在染色體上可轉(zhuǎn)移的DNA片段，存在于從原核生物到真核生物范圍很廣的生物中。開發(fā)利用轉(zhuǎn)移因子的轉(zhuǎn)座子[WO93/18151；特開平7-107976；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)、特開平9-70291]、以及通過轉(zhuǎn)座子使外源基因表達(dá)已成為可能。
本發(fā)明人著眼于無論是信號肽還是前體部分在放線菌等的分泌蛋白質(zhì)分泌過程中都起著重要作用的事實(shí)，直至發(fā)明了有效分泌生產(chǎn)工業(yè)上有用的外源蛋白質(zhì)，特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。
就是說，本發(fā)明是有關(guān)外源分泌型蛋白質(zhì)的制備方法的發(fā)明，其特征是使在源自棒桿菌的信號肽的下游連接含有前體結(jié)構(gòu)部分的外源分泌型蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)在棒桿菌中生成和分泌，然后將前體結(jié)構(gòu)部分切除來獲得外源蛋白質(zhì)。
更具體地說，本發(fā)明提供的方法是，將在編碼源自棒桿菌的信號肽區(qū)，特別是細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽區(qū)的序列的下游結(jié)合了含有前體結(jié)構(gòu)部分的目的蛋白質(zhì)基因序列，特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因序列的表達(dá)重組體導(dǎo)入棒桿菌，對得到的轉(zhuǎn)化棒桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，使生成的蛋白質(zhì)有效地分泌到菌體外，用蛋白酶對釋放到菌體外的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，切去前體結(jié)構(gòu)部分，進(jìn)而制備大量的目的外源蛋白質(zhì)，特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
另外，本發(fā)明還提供獲得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的一種方法，即，對蛋白酶等也象轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因重組體那樣構(gòu)建這些蛋白酶等的表達(dá)型基因重組體，然后與含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的表達(dá)重組體都導(dǎo)入棒桿菌，對得到的轉(zhuǎn)化棒桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，或?qū)氲絼e的棒桿菌，對得到的轉(zhuǎn)化棒桿菌與導(dǎo)入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的細(xì)菌共同培養(yǎng)，通過使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原和這些蛋白酶分泌表達(dá)，可以得到切除了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
另外在本說明書中，所謂蛋白質(zhì)或肽被“分泌”是指蛋白質(zhì)或肽分子被轉(zhuǎn)移到菌體外(細(xì)胞外)，最終這些蛋白質(zhì)或肽分子完全游離在培養(yǎng)基中，當(dāng)然也包括只有一部分存在于菌體外的情況以及存在于菌體表面的情況。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式依照本發(fā)明的方法，用棒桿菌作為宿主載體系統(tǒng)，構(gòu)建在棒桿菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽的下游結(jié)合了含有分泌型的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的表達(dá)重組體，然后將該重組體導(dǎo)入棒桿菌內(nèi)，對被表達(dá)、分泌到菌體外的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原用蛋白酶等進(jìn)行處理，切除前體結(jié)構(gòu)部分，就可得到大量的切除了前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
另外依照本發(fā)明的方法，對蛋白酶等也象轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因重組體那樣構(gòu)建這些蛋白酶等的表達(dá)型基因重組體，然后與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因重組體都導(dǎo)入棒桿菌，對得到的轉(zhuǎn)化棒桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，或?qū)氲絼e的棒桿菌，對得到的轉(zhuǎn)化棒桿菌與導(dǎo)入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的細(xì)菌共同培養(yǎng)，通過分泌表達(dá)，可以直接在菌體外得到切除了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
分泌型蛋白質(zhì)一般以前導(dǎo)肽或前導(dǎo)肽原形式被翻譯，然后變成成熟型蛋白質(zhì)。即一般以前導(dǎo)肽或前導(dǎo)肽原形式被翻譯后，切除信號肽(“前導(dǎo)部分”)使之變成成熟肽或肽原，肽原再經(jīng)蛋白酶處理，切除前體部分使之成為成熟肽。在本說明書中，所謂“信號序列”是指存在于分泌型蛋白質(zhì)前體的N末端，且不存在于天然成熟蛋白質(zhì)中的序列，所謂“信號肽”是指從該蛋白質(zhì)前體中切除的肽。一般來說，信號序列隨著蛋白質(zhì)分泌到菌體外的同時，就被蛋白酶(通常稱之為信號肽酶)切除了。這樣的信號肽雖然在所有生物中都有某些共同的序列上的特征，但在某種生物中表現(xiàn)出分泌功能的信號肽在其他生物中未必發(fā)揮能分泌功能。
在本說明書中，有時將信號肽和前體部分都含有的蛋白質(zhì)，即初次翻譯產(chǎn)物稱之為“前蛋白質(zhì)原”，將不含信號肽而含有前體部分的蛋白質(zhì)稱之為“蛋白質(zhì)原”。蛋白質(zhì)原的前體部分有時也稱之為“前體結(jié)構(gòu)部分”或“前體結(jié)構(gòu)”，在本說明書中蛋白質(zhì)的“前體結(jié)構(gòu)部分/前體結(jié)構(gòu)”與蛋白質(zhì)的“前體部分”之間可互換使用。在前蛋白原或前蛋白質(zhì)中，其信號肽可以來自于不同的蛋白質(zhì)，也可以是天然存在于目的蛋白質(zhì)的信號肽，但最好是使用源自所用宿主的分泌型蛋白質(zhì)?；蛘甙凑账盟拗鞯拿艽a子使用頻率將信號肽改造成具有最適密碼子的信號肽。而可用于本發(fā)明的信號肽也可以含有信號肽來源的天然的成熟蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列的一部分。信號肽源自不同的蛋白質(zhì)時，有時也將前蛋白原特別稱之為“外源融合前蛋白原”。例如，蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶時，可分別稱之為“前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原”、“轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原”和“外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原”。所謂“切除前體部分的”蛋白質(zhì)是指通過切斷肽鍵，除去至少一個以上構(gòu)成前體部分的氨基酸的蛋白質(zhì)，包括該N末端區(qū)與天然成熟蛋白質(zhì)的N末端區(qū)完全一致的蛋白質(zhì)，以及只要具有該蛋白質(zhì)活性，與天然蛋白質(zhì)相比其N末端多出一個以上源自前體部分的氨基酸的蛋白質(zhì)以及與天然成熟蛋白質(zhì)相比氨基酸序列短的蛋白質(zhì)也都包括在內(nèi)。
到目前為止，利用棒桿菌將外源蛋白分泌到菌體外的例子如在闡述以往的的技術(shù)時所描述的那樣非常少，而且從技術(shù)上也沒有完善。另外也沒有棒桿菌通過自身將蛋白酶等蛋白質(zhì)分泌到菌體外的例子，但內(nèi)源性DNase的分泌[US4965197]和本發(fā)明使用的細(xì)胞表面蛋白[特表平6-502548]從細(xì)胞表面剝落并出現(xiàn)在菌體外的事實(shí)是已經(jīng)知道的例子。但是，就棒桿菌來說，對參與分泌的信號肽除了細(xì)胞表面蛋白質(zhì)以外到現(xiàn)在還不清楚。到目前為止所了解的棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白只是谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的細(xì)胞表面蛋白PS1和PS2的基因[特表平6-502548]以及產(chǎn)氨棒桿菌(以下略作C.ammoniagenes)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的基因[特開平10-108675]。在這些蛋白質(zhì)內(nèi)，雖然PS1和S1pA之間能看到有許多同源性(30％)，但在其他蛋白質(zhì)之間幾乎看不到同源性，另外關(guān)于信號序列區(qū)域也看不到它們之間的同源性。作為信號序列的例子，如序列號29和1給出的谷氨酸棒桿菌的PS1和PS2的信號序列，以及序列號2給出的產(chǎn)氨棒桿菌的S1pA的信號序列。
本發(fā)明人從谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)(舊名稱為乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum))ATCC13869菌株克隆PS2蛋白質(zhì)基因，測定其序列時，雖然沒有看出在信號序列區(qū)與源自谷氨酸棒桿菌的已知蛋白質(zhì)基因序列有什么差別，但在成熟型細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的N末端氨基酸的38位殘基前的序列中確認(rèn)有2個不同之處(序列號7給出的氨基酸序列中第40位氨基酸殘基的Thr是Asn，第55位的Gly是Glu)。序列號6給出了含有編碼其信號序列號30個氨基酸殘基和成熟細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的N末端38個氨基酸殘基的共68個殘基的堿基序列以及啟動子區(qū)的其5’-上游區(qū)序列，序列號7給出了其氨基酸序列。
然后，為了在棒桿菌中嘗試使外源蛋白質(zhì)大量分泌到菌體外是否可行，本發(fā)明人利用含有細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的啟動子區(qū)和信號肽區(qū)的序列進(jìn)行了外源蛋白質(zhì)的分泌研究。
已知源自放線菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因GC含量高，但棒桿菌與它相近，另外密碼子利用性也近似，所以可直接利用放線菌基因。因此，本發(fā)明人就能否可以直接利用放線菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明源自放線菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的信號肽在棒桿菌中不起作用。但是，編碼與源自棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白的信號肽融合的包含源自放線菌的前體結(jié)構(gòu)部分的成熟蛋白的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因可直接有效地發(fā)揮其功能，并可作為含有前體結(jié)構(gòu)部分的蛋白原有效地分泌到菌體外。另外，使用多出了細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽30個氨基酸殘基與成熟細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的N末端部分的38個氨基酸殘基，即，使用融合了成熟細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的N末端部分的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因時，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原向菌體外分泌的效率將進(jìn)一步增大。
本發(fā)明中所說的棒桿菌是需氧的革蘭式陽性桿菌，包括以前屬于短桿菌屬，現(xiàn)在都合并到棒桿菌屬的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，以及包括與棒桿菌屬親緣關(guān)系近的短桿菌屬細(xì)菌。作為使用棒桿菌的優(yōu)點(diǎn)，與到目前為止適用于外源蛋白分泌的霉菌、酵母或枯草桿菌屬細(xì)菌相比，它本來分泌到菌體外的蛋白質(zhì)就非常少，所以分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)時的純化過程可以簡化和省略，另外在糖、氨和無機(jī)鹽等簡單培養(yǎng)基中能很好生長，在培養(yǎng)基花費(fèi)和培養(yǎng)方法、培養(yǎng)生產(chǎn)效率方面也都有優(yōu)勢。
本發(fā)明中作為宿主菌使用的棒桿菌有，以L-谷氨酸生成菌為代表的解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum，又稱為谷氨酸棒桿菌)ATCC13869、玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)ATCC13825、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum，又稱為谷氨酸棒桿菌)ATCC14067、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、谷氨酸棒桿菌ATCC13032，百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes，又稱為產(chǎn)氨棒桿菌)ATCC6871等野生株，以及由這些野生株誘變的變異株，例如失去谷氨酸生成能力的變異株，還包括生成賴氨酸的氨基酸生成變異株，生成如肌苷等核酸那樣的其他物質(zhì)的變異株。
本發(fā)明使用的基因重組體，一般都在適當(dāng)位置中含有啟動子、編碼合適的信號肽的序列和編碼目的蛋白的核酸片段、以及為了使目的蛋白基因在棒桿菌表達(dá)所必需的調(diào)控序列(起始因子和終止因子)，并能使它們發(fā)揮作用的基因重組體。目的蛋白也可以在N末端含有前體結(jié)構(gòu)部分。用于該重組體的載體沒有特別限制，只要是在棒桿菌中能夠發(fā)揮功能的就可以，象質(zhì)粒那樣在染色體外自我增殖的，還是插入細(xì)菌染色體的載體都可以，最好是源自棒桿菌的質(zhì)粒。其中包括諸如pHM1519(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))、pAM330(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))以及將它們進(jìn)行改造使之含有抗藥性基因的質(zhì)粒。另外人工轉(zhuǎn)座子等也可以利用。使用轉(zhuǎn)座子時，通過同源重組或它們自身轉(zhuǎn)移能力將目的基因?qū)肴旧w中。
本發(fā)明中使用的啟動子沒有特別限定，只要是在棒桿菌中發(fā)揮功能的啟動子一般都可以使用，甚至源自外源的，例如優(yōu)選tac啟動子等源自E.coli的啟動子。其中更優(yōu)選tac啟動子等強(qiáng)力啟動子。源自棒桿菌的啟動子有，細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的PS1、PS2、S1pA基因的啟動子，各種氨基酸合成系統(tǒng)，例如谷氨酸合成系統(tǒng)的谷氨酸脫氫酶基因、谷氨酰胺合成系統(tǒng)的谷氨酰胺合成酶基因、賴氨酸生物合成系統(tǒng)的天冬氨酸激酶基因、蘇氨酸生物合成系統(tǒng)的同型絲氨酸脫氫酶基因、異亮氨酸和纈氨酸生物合成系統(tǒng)的乙酰羥酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系統(tǒng)的2-異丙基蘋果酸合成酶基因、脯氨酸和精氨酸生物合成系統(tǒng)的谷氨酸激酶基因、組氨酸生物合成系統(tǒng)的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成系統(tǒng)的脫氧阿拉伯庚糖醛磷酸(DAHP)合成酶基因、肌苷酸和鳥苷酸那樣的核酸生物合成系統(tǒng)中的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)氨基轉(zhuǎn)移酶基因、肌苷酸脫氫酶基因和鳥苷酸合成酶基因的啟動子。
本發(fā)明使用的信號肽是作為宿主的棒桿菌的分泌型蛋白質(zhì)的信號肽，最好是棒桿菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽。作為棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)有源自谷氨酸棒桿菌的PS1和PS2[特表平6-502548]、以及產(chǎn)氨棒桿菌的S1pA[特開平10-108675]。序列號29給出了PS1的氨基酸序列，序列號1給出了PS2的氨基酸序列，序列號2給出了S1pA的氨基酸序列。另外按照美國專利4965197的描述，在源自棒桿菌的DNase中也包含有信號肽，那樣的信號肽也可以用于本發(fā)明。
在信號肽中也可以加上信號肽來源的分泌型蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列的一部分。信號序列在翻譯產(chǎn)物分泌到菌體外時就被信號肽酶切去了。編碼信號肽的基因可以直接使用天然型的基因，也可以根據(jù)使用宿主的密碼子使用頻率進(jìn)行改變，使之具有最適密碼子。
使用這些信號肽時，編碼目的蛋白的基因接在編碼信號肽的基因的3’-末端一側(cè)，并使它受到源自上述啟動子的表達(dá)調(diào)控。
通過本發(fā)明分泌生產(chǎn)的有用的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上包括源自動植物或微生物的所有分泌型蛋白質(zhì)，但并沒有被特別限定。例如蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、膠原酶和幾丁質(zhì)酶等蛋白質(zhì)都可以通過本發(fā)明進(jìn)行分泌生產(chǎn)。通過本發(fā)明分泌生產(chǎn)的蛋白質(zhì)優(yōu)選天然且為分泌型蛋白質(zhì)，更優(yōu)選帶有前體結(jié)構(gòu)部分的蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為通過本發(fā)明分泌生產(chǎn)的有用的蛋白質(zhì)。作為本發(fā)明可利用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因可以是放線菌，例如茂原鏈輪絲菌IFO13819、肉桂鏈輪絲菌IFO12852、灰色肉鏈輪絲菌IFO12776、利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)[WO9606931]等和Oomycetes[WO9622366]等霉菌的分泌型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因。編碼這些蛋白質(zhì)的基因按照使用的宿主以及為了獲得所希望的活性可以進(jìn)行改變，其中包括添加、缺失、置換一個以上的氨基酸等改變，可以根據(jù)需要變換成響應(yīng)宿主密碼子使用頻率的最適密碼子。
通過本發(fā)明分泌生產(chǎn)以天然的前肽原形式表達(dá)的蛋白質(zhì)時，最好使用編碼含有前體結(jié)構(gòu)部分(前體部分)的蛋白原的基因片段。作為前體結(jié)構(gòu)部分的例子有，序列號3(源自茂原鏈輪絲菌)和序列號4(源自肉桂鏈輪絲菌)給出的源自放線菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的序列。蛋白質(zhì)的前體結(jié)構(gòu)部分可以通過適當(dāng)?shù)氖侄?，例如利用蛋白酶切除，也可以用氨肽酶、在適當(dāng)位置進(jìn)行切割的內(nèi)肽酶、或使用更特異的蛋白酶，但最好是使用能在特定位置切斷，并能使生成的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)同樣的或更高的活性的蛋白酶?；蛘呤歉淖兙幋a目的蛋白質(zhì)或目的蛋白質(zhì)的前體結(jié)構(gòu)部分的基因序列，設(shè)計(jì)成能表達(dá)在所希望的位置含有特異的蛋白酶識別位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。包括上述那樣的誘變技術(shù)、基因克隆技術(shù)、生成蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)在內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)手法業(yè)內(nèi)人士都很清楚。例如可以參照下列文獻(xiàn)Sambrook etal.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York、DNA cloningA Practical Approach，Volumes Iand II(D.N.Glover ed.1985)、F.M.A usubel et al.(eds)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc，(1994)、PCR TechnologyPrinciples and Application for DNAAmplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press等。
作為改變了序列號3和4所示的前體結(jié)構(gòu)部分的前體結(jié)構(gòu)部分的例子，如具有序列號30～38所示的氨基酸序列的修飾前體結(jié)構(gòu)部分。<序列表說明>序列號30～37茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的修飾前體結(jié)構(gòu)部分序列號38茂原鏈輪絲菌和肉桂鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶前體結(jié)構(gòu)部分的嵌合這些修飾前體結(jié)構(gòu)部分具有以下特征序列號30＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的C末端的AP。序列號31＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的C末端的FRAP。序列號32＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的N末端的D。序列號33＝缺失了源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的N末端的DNGAGE。序列號34＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的C末端的RAP改變成了GPK。序列號35＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的C末端的RAP改變成了GPR。序列號36＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的C末端的GPSFRAP改變成了GPK(FRAP缺失，C末端的S改變成R)。序列號37＝將源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(45個氨基酸殘基)的C末端的GPSFRAP改變成了GPR(FRAP缺失，C末端的S改變成R)。序列號38＝由源自茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分一部分(15個氨基酸殘基)和源自肉桂鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分(41個氨基酸殘基)的一部分構(gòu)成的嵌合前體結(jié)構(gòu)部分(56個氨基酸殘基)。
這樣，只要在特定位置有了蛋白酶的特異識別位點(diǎn)，就可以在前體結(jié)構(gòu)部分置換、缺失、插入或添加一個以上的氨基酸。
蛋白酶分解獲得的蛋白質(zhì)的N末端區(qū)未必與天然的蛋白質(zhì)一樣，即使是多添加了1～數(shù)個氨基酸，或缺失了1～數(shù)個氨基酸都可以。一般來說，從蛋白質(zhì)活性觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在與天然蛋白質(zhì)幾乎相同的位置切斷，更優(yōu)選與天然產(chǎn)物一樣的成熟肽。例如，有關(guān)茂原鏈輪絲菌和肉桂鏈輪絲菌的成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列分別是序列號5和43給出的序列。因此，一般來說最優(yōu)選能在生成與天然成熟蛋白質(zhì)一樣的蛋白質(zhì)的位置切斷肽原的特異性蛋白酶。然而，為了特定目的，與天然蛋白質(zhì)相比，N末端或多或少1～數(shù)個氨基酸的肽有時具有更適合的活性。這樣的蛋白酶中除了包括象分散酶(Dispase)(BoeringerManheim公司制)那樣可購買的酶以外，也包括從微生物培養(yǎng)液、例如從放線菌的培養(yǎng)液中獲得的酶。這樣的蛋白酶未經(jīng)純化就可使用，也可根據(jù)需要純化至適當(dāng)?shù)募兌群笤偈褂谩?br> 其他適用的蛋白酶的例子有白灰淺鏈霉菌(Streptomycesalbogriseolus，以下略作S.albogriseolus)生成的絲氨酸蛋白酶SAMP45。而源自茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原由于SAMP45優(yōu)先切斷序列號3的前體結(jié)構(gòu)部分的第41位的Ser和42位的Phe之間肽鍵，可生成在序列號5給出的天然型成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端附加了前體結(jié)構(gòu)部分的C末端的Phe-Arg-Ala-Pro 4個氨基酸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明人確認(rèn)這樣的蛋白質(zhì)也具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。另外SAMP45基因序列已經(jīng)確定，序列號39給出了附加了前體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(SAMP45原)的氨基酸序列(J.Bacteriol，179，430-438(1997))。SAMP45以白灰淺鏈霉菌的培養(yǎng)液或白灰淺鏈霉菌菌體的形式作用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原時，可以切除前體結(jié)構(gòu)的一部分，結(jié)果可以得到除去大部分前體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。或者是將導(dǎo)入了前SAMP45原基因的棒桿菌與使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原分泌到菌體外的棒桿菌一起培養(yǎng)，同樣可以得到除去大部分前體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。另外，用同樣的方法將SAMP45基因?qū)霐y有前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的棒桿菌中，使SAMP45與前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因同時分泌到菌體表面或菌體外，可以更有效地通過切去前體結(jié)構(gòu)部分使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活化。
另外，通過將本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的茂原鏈輪絲菌生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)與SAMP45配合使用，也可以除去附加在N末端的Phe-Arg-Ala-Pro 4個氨基酸，得到與天然型一樣的成熟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
該svPEP是能夠在下述式(1)中↓處特異切斷式(1)表示的肽或肽的類似物，即特異切斷從N末端開始的第3或第4位脯氨酸羧基側(cè)的肽鍵的酶。
Y-Pro-↓-Z(1)(式中，Y是由2個或3個氨基酸殘基構(gòu)成的寡肽，Z代表氨基酸、肽、酰胺、或酯)。
更具體地說，該脯氨酸特異性肽酶是具有以下(1)～(8)性質(zhì)的脯氨酸特異性肽酶。(1)可以在↓所示位置、即在脯氨酸的羧基側(cè)切斷以下至少一種含有脯氨酸的肽(pNA代表對硝基酰替苯胺)。Ala-Ala-Pro-↓-pNA、Ala-Phe-Pro-↓-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-↓-pNA(與Phe-Arg-Ala-Xaa(序列號68)相同(式中Xaa代表Pro-pNA，pNA表示對硝基酰替苯胺))(2)最適pH為6.0～6.5。(3)pH4～9時穩(wěn)定。(4)最適溫度為25～30℃。(5)20℃以下時穩(wěn)定。(6)活性可被苯基甲基磺酰氟化物、氨基乙基苯磺酰氟鹽酸鹽抑制。(7)等電點(diǎn)為10.2。(8)分子量大約為50000。
該svPEP可以按以下步驟制備。按照放線菌培養(yǎng)中通常用的方法培養(yǎng)生成具有svPEP活性的肽酶的放線菌，例如放線菌茂原鏈輪絲菌IFO13819。培養(yǎng)放線菌IFO13819的培養(yǎng)基用含有通常的碳源、氮源、無機(jī)離子等常用的培養(yǎng)基就可以。作為碳源可以使用葡萄糖、淀粉、蔗糖以及其他碳源。作為氮源根據(jù)需要可以適當(dāng)選用蛋白胨、酵母提取液、肉湯、麥芽提取液、銨鹽和其他的氮源。培養(yǎng)是在好氧條件下進(jìn)行的，例如可以將條件控制在pH5.0到8.5、溫度從15℃到37℃的合適的范圍內(nèi)。培養(yǎng)時間雖然因溫度、pH、培養(yǎng)基不同而不同，但通常為1～10天左右，一般來說，在svPEP的產(chǎn)率達(dá)到最大時停止培養(yǎng)最好。
經(jīng)上述時間培養(yǎng)后，從培養(yǎng)物回收菌體，輕輕洗滌后，從菌體表面洗脫出含有svPEP的組分，通過配合使用HPLC、FPLC等通常蛋白質(zhì)純化中使用的業(yè)內(nèi)人士熟悉的各種純化手段進(jìn)行純化，可以獲得純化的svPEP標(biāo)準(zhǔn)品。從菌體表面洗脫svPEP組分，可以通過將菌體在例如0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)等緩沖液中，振蕩一定時間、如1～5小時左右來洗脫。為了防止酶失活，此時的溫度最好控制在0℃～5℃范圍內(nèi)。也可以從培養(yǎng)上清液分離純化出svPEP，但此時雜蛋白質(zhì)較多，因此還是從洗滌的菌體洗脫純化為好。
另外，確認(rèn)各個純化階段的活性組分可以通過測定各個組分中的酶活性來進(jìn)行。酶活性的測定可以配合使用適當(dāng)?shù)牡孜锖头磻?yīng)生成物的檢測方法，例如以Ala-Ala-Pro-pNA、Ala-Phe-Pro-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-pNA為底物進(jìn)行酶反應(yīng)，通過算出游離的pNA(對硝基酰替苯胺)量，對活性進(jìn)行定量測定。
根據(jù)需要，可以使用反相色譜等將上述純化的svPEP進(jìn)一步純化，測定其部分氨基酸序列，通過設(shè)計(jì)合適的探針可以得到編碼svPEP的基因。這樣的操作過程業(yè)內(nèi)人士是很熟悉的，例如可參照MolecularCloning 2nd edtion[J.Sambrook E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p9.31(1989)]。序列號41和42分別給出了上述得到的svPEP的基因的堿基序列和它所編碼的整個氨基酸序列，序列號40給出了svPEP成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
使SvPEP以茂原鏈輪絲菌的培養(yǎng)液或茂原鏈輪絲菌菌體的形式與蛋白酶一起作用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原時，可以完全除去前體結(jié)構(gòu)部分，結(jié)果可以得到前體結(jié)構(gòu)部分完全切除的成熟型的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶?；蛘呤峭ㄟ^將導(dǎo)入了前svPEP原基因和蛋白酶基因的棒桿菌與將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原分泌到菌體外的棒桿菌共同培養(yǎng)，同樣可以得到前體結(jié)構(gòu)部分完全切除的成熟型的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。另外，通過在導(dǎo)入了前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的棒桿菌中按照同樣方法再導(dǎo)入SAMP45基因和svPEP基因兩者，使得svPEP和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原以及SAMP45同時分泌到菌體表面或菌體外，可以有效地生成具有與天然結(jié)構(gòu)一樣的成熟型的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
將本發(fā)明使用的基因重組體導(dǎo)入棒桿菌的方法沒有特別限定，可以利用通常使用的方法，例如原生質(zhì)體法(Gene，39，281-286(1985))、電穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等方法。得到的導(dǎo)入了基因的轉(zhuǎn)化體按照通常使用的方法和條件進(jìn)行培養(yǎng)。例如，轉(zhuǎn)化體可以用含有碳源、氮源和無機(jī)離子的常用的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。為了要獲得高增殖，也可以根據(jù)需要添加維生素、氨基酸等有機(jī)微量營養(yǎng)素。
作為碳源可以使用象葡萄糖和蔗糖那樣的碳水化合物，醋酸那樣的有機(jī)酸、醇類以及其他碳源。作為氮源可以使用氨氣、氨水、銨鹽和其他氮源。作為無機(jī)離子根據(jù)需要可以適當(dāng)使用鈣離子、鎂離子、磷酸根離子、鉀離子、鐵離子等。培養(yǎng)在pH5.0～8.5、15℃～37℃等合適的范圍內(nèi)通氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)1～7天左右。通過在這樣的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，目的蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)大量生成并被有效地分泌到菌體外。就轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶來說，已知如果在微生物菌體內(nèi)大量蓄積一般都會導(dǎo)致菌體死亡，但如果利用本發(fā)明，由于生成的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶都釋放到菌體外，菌體不會受到致死的影響，所以可以連續(xù)地生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
利用本發(fā)明分泌到培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)按照同行都熟悉的方法可以從培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中分離純化。例如，通過離心分離除去菌體后，再通過鹽析、乙醇沉淀、超濾、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、中高壓液相層析，反相層析、疏水層析等已知的合適的方法、或配合使用進(jìn)行分離純化。利用本發(fā)明分泌到菌體表面的蛋白質(zhì)也可使用同行都熟悉的方法，例如提高鹽濃度、使用表面活性劑等使其溶解后，象分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)那樣進(jìn)行分離純化。有時分泌到菌體表面的蛋白質(zhì)不進(jìn)行可溶化，例如作為固定化酶使用。
結(jié)合以下實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例1源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中的表達(dá)(1)源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的獲得源自茂原鏈輪絲菌DSMZ菌株的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的序列已經(jīng)被確定[Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)]。參考該序列，合成如序列號8和9所示的引物，利用PCR法從按照常規(guī)方法(齋藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制備的茂原鏈輪絲菌IFO13819的染色體DNA中擴(kuò)增編碼成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶序列的區(qū)域。在PCR反應(yīng)中使用Pyrobest DNA polymerase(寶酒造公司制)，反應(yīng)條件參照廠家推薦的方案。(序列號8)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’(序列號9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’<序列表說明>序列號8、9PCR引物然后對擴(kuò)增的大約1.0kb的DNA片段用Random Primer DNALabeling Kit Ver.2(寶酒造公司制)和[α-32P]dCTP，按照說明書附帶的方案進(jìn)行反應(yīng)，制備DNA探針。使用制備的探針和茂原鏈輪絲菌IFO13819染色體DNA，按照Molecular Cloning 2nd edtion[J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，p9.31(1989)]所述的方法進(jìn)行Southern blot雜交，便可確認(rèn)在用限制酶Sac I酶切出的大約4kb的片段中存在著轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)通過瓊脂糖凝膠電泳回收用Sac I切茂原鏈輪絲菌IFO13819的染色體DNA得到的大約4kb的片段，并插入pUC18(寶酒造公司制)的Sac I位點(diǎn)后，導(dǎo)入大腸桿菌JM109(寶酒造公司制)的感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建文庫。
使用先前制備的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的DNA探針按照MolecularCloning 2nd edtion[J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p1.90(1989)]所述的菌落雜交方法進(jìn)行文庫的篩選，獲得含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因片段被克隆的質(zhì)粒的菌株，從該菌株回收質(zhì)粒，取名為pUITG。測定克隆于pUITG的片段的堿基序列，可以確認(rèn)茂原鏈輪絲菌IFO13819轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因與茂原鏈輪絲菌DSMZ株的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因具有同樣的堿基序列。
堿基序列測定的結(jié)果表明，該Sac I的大約4kb的片段是缺了一部分信號序列(前導(dǎo)部分)的不完全的DNA片段。于是進(jìn)行了啟動子區(qū)和完整的信號序列區(qū)的克隆的嘗試。克隆是利用TAKARA LA PCR invitro Cloning Kit(寶酒造公司制)和序列號10和11所示的引物，按照說明書附帶的方案實(shí)施的。(序列號10)5’-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3’(序列號11)5’-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3’<序列表說明>序列號10、11用于克隆茂原鏈輪絲菌的啟動子區(qū)和信號序列的PCR引物。
結(jié)果表明，使用Sal I的試劑盒引物時得到大約800bp的PCR擴(kuò)增片段，測定該片段的堿基序列，可確認(rèn)該片段是含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的啟動子區(qū)和信號序列區(qū)的片段。通過將這個大約800bp的PCR擴(kuò)增片段插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點(diǎn)，得到pVITGS5。然后通過用Sal I消化pUITG，通過瓊脂糖凝膠電泳回收含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的約4kb片段，再將該片段插入pVITGS5的Sac I位點(diǎn)，構(gòu)建含有全長的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的質(zhì)粒pVITGC。另外堿基序列的測定使用Dye Terminator Cycle Sequencing kit(PE AppliedBiosystems公司制)和DNA測序儀(PE Applied Biosystems公司制)。序列號12給出了前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的序列，而N末端的31個氨基酸序列被認(rèn)為是信號序列(前導(dǎo)部分)。前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的氨基酸序列如序列號13所示。(2)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)換谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白PS2基因序列已經(jīng)確定[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。參考該序列合成序列號14和序列號15所示的引物，通過PCR法從常規(guī)方法制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869染色體DNA中擴(kuò)增含有PS2蛋白質(zhì)基因的起始密碼5’-上游區(qū)的啟動子的區(qū)域。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號15)5’-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3’<序列表說明>序列號14、15PCR引物以實(shí)施例1(1)中測定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列為基礎(chǔ)，合成序列號16和9所示的引物，利用PCR法從實(shí)施例1(1)中得到的pUITG擴(kuò)增前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因區(qū)。(序列號16)5’-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3’<序列表說明>序列號16PCR引物接下來，將擴(kuò)增的含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869 PS2基因的啟動子的區(qū)域與已擴(kuò)增的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉(cross over)PCR，擴(kuò)增與含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白基因啟動子的區(qū)域相連的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴(kuò)增片段。使用EASYTRAP Ver.(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點(diǎn)，得到pVKPTGO。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認(rèn)構(gòu)建了象預(yù)想那樣的融合基因。(3)前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中的表達(dá)用實(shí)施例1(1)構(gòu)建的pVITGC(啟動子和前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因都源自茂原鏈輪絲菌)或?qū)嵤├?(2)構(gòu)建的pVKPTGO(啟動子源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因，前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因源自茂原鏈輪絲菌)轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素的CM2S瓊脂培養(yǎng)基(將10g酵母提取物、10g蛋白胨、5g蔗糖、5g NaCl、15g瓊脂用水配成1升溶液)中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVITGC或pVKPTGO的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的MM液體培養(yǎng)基(將葡萄糖30g、硫酸鎂7水合物0.4g、硫酸銨30g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鐵7水合物0.01g、硫酸錳5水合物0.01g、硫胺素鹽酸鹽200μg、生物素500μg、DL-蛋氨酸0.15g、碳酸鈣50g用水配成1L溶液，pH調(diào)節(jié)為7.5)分別于30℃條件下培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法(例如，J.Sambrook等人(1989)所述的通常步驟)進(jìn)行Western blot。
結(jié)果沒有檢測出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。從以上結(jié)果可以確認(rèn)茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的信號序列在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中沒有起作用。實(shí)施例2利用編碼谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum ATCC13869)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽和源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌生產(chǎn)(1)具有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)信號序列的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的構(gòu)建谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白PS2的基因序列已經(jīng)確定了[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。參考該序列合成序列號14和序列號17所示的引物，利用PCR法從實(shí)施例1(2)方法制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA中擴(kuò)增含有編碼相當(dāng)于PS2蛋白質(zhì)基因的N末端一側(cè)的44氨基酸殘基(信號肽30個氨基酸殘基和成熟細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的14個氨基酸殘基)區(qū)和啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)。為了構(gòu)建與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶融合基因，序列號17給出的引物含有編碼成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端一側(cè)的氨基酸序列的堿基序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號17)5’-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3’<序列表說明>序列號17PCR引物以實(shí)施例1(1)中測定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列為基礎(chǔ)，合成序列號8和9所示的引物，利用PCR法從實(shí)施例1(1)中得到的pUITG擴(kuò)增成熟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因區(qū)。
接下來，將擴(kuò)增的含有編碼相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白質(zhì)N末端一側(cè)的44個氨基酸殘基的區(qū)域和啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl與已擴(kuò)增的成熟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，擴(kuò)增含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)44個氨基酸殘基的區(qū)域相連的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.7kb的擴(kuò)增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點(diǎn)，得到pVKTG3。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認(rèn)構(gòu)建了象預(yù)想那樣的融合基因。
通過用KpnI和XbaI消化pVKTG3，切出大約1.7kb的含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)44氨基酸殘基的區(qū)相連的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收，然后將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建pPKTG3。
(2)利用谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列進(jìn)行成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌用構(gòu)建的質(zhì)粒pVKTG3或pPKTG3(兩者中由啟動子和信號肽以及N末端14個氨基酸殘基構(gòu)成的基因都源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869，成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因源自茂原鏈輪絲菌)轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVKTG3或pPKTG3的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液體培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot。結(jié)果在兩種菌株的培養(yǎng)上清中能夠檢測出少量的具有與成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶大致相同分子量的分泌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。實(shí)施例3利用與谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽相連的源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌生產(chǎn)(1)具有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)的構(gòu)建參考谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成序列號18、序列號19、序列號20以及序列號21所示的引物。使用序列號14和序列號18、或序列號14和序列號19、或序列號14與序列號20、或者序列號14與序列號21的組合通過PCR法從實(shí)施例1(2)方法制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA中擴(kuò)增出分別編碼相當(dāng)于PS2蛋白質(zhì)的N末端一側(cè)的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的編碼區(qū)域(含有信號肽30個氨基酸殘基)和含有啟動子的5’-上游區(qū)。
為了構(gòu)建與帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，序列號18、19、20和21給出的引物含有編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端一側(cè)的氨基酸序列的堿基序列。(序列號18)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3(序列號19)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3(序列號20)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3(序列號21)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3<序列表說明>序列號18～21PCR引物以實(shí)施例1(1)中測定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列為基礎(chǔ)，合成序列號22和9所示的引物，利用PCR法從實(shí)施例1(1)中得到的pUITG中擴(kuò)增轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因區(qū)。(序列號22)5’-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3’<序列表說明>序列號22PCR引物接下來，將擴(kuò)增的含有相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白質(zhì)基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的堿基序列的PCR反應(yīng)液各1μl，與已擴(kuò)增的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，分別擴(kuò)增含有相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的各個堿基序列區(qū)相連的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的融合基因，即與谷氨酸棒桿菌ATCC13869表面蛋白質(zhì)基因的啟動子結(jié)合的外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因片段。
通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出從大約1.8kb到1.9kb的擴(kuò)增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收這些片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點(diǎn)，分別得到pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認(rèn)構(gòu)建了象預(yù)想那樣的融合基因。
通過用KpnI和XbaI消化pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4，切出從大約1.8kb到1.9kb的含有相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)的30個、31個、44個以及68個氨基酸殘基的各個序列區(qū)相連的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收，然后將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4。(2)利用谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列分泌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原用構(gòu)建的質(zhì)粒pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液體培養(yǎng)基于30℃分別培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Westernblot。結(jié)果可以確認(rèn)無論pVC7，還是pPK4載體都有大致等量的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌，但相當(dāng)于PS2蛋白質(zhì)的成熟蛋白質(zhì)的N末端一側(cè)氨基酸殘基的長度不同，可看出相應(yīng)的分泌量存在明顯的差別。表1給出了有代表性的分泌量。表1.利用谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列獲得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌生產(chǎn)量
(3)通過分散酶消化來切斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原和檢測活性向攜有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4的谷氨酸棒桿菌ATCC13869培養(yǎng)上清加入作為蛋白酶的分散酶(Boeringer Manheim公司制)，添加的比例為底物∶酶＝1∶1，于pH7.5、37℃下反應(yīng)1小時。分散酶消化反應(yīng)后，通過SDS-PAGE確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原被切情況，再經(jīng)氧肟酸酯(hydroxamate)法[J.Biol.chem.，241，5518-5525(1966)]確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，可確認(rèn)具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。實(shí)施例4利用具有產(chǎn)氨棒桿菌(C.ammoniagenes)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽編碼序列和源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶編碼序列的融合基因進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌生產(chǎn)(1)具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原)的構(gòu)建參考產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的基因序列[特開平10-108675]，合成序列號23和序列號24所示的引物，利用PCR法從常規(guī)方法制備的產(chǎn)氨棒桿菌的柒色體DNA中擴(kuò)增含有相當(dāng)于細(xì)胞表面蛋白(S1pA)基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)的25個氨基酸殘基(信號肽)的區(qū)域。為了構(gòu)建與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，序列號24給出的引物含有編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的N末端一側(cè)的氨基酸序列的堿基序列。(序列號23)5’-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3’(序列號24)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3<序列表說明>序列號23、24PCR引物接下來，將擴(kuò)增的含有相當(dāng)于產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)與編碼N末端一側(cè)的25個氨基酸殘基的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl，與在實(shí)施例3(1)中擴(kuò)增的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號23和序列號9進(jìn)行交叉PCR，擴(kuò)增含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白(S1pA)基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼N末端一側(cè)25氨基酸殘基的區(qū)域相連的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原)。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.7kb的擴(kuò)增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到pVC7的SmaI位點(diǎn)，得到pVSPTG1。(2)啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)換；與谷氨酸棒桿菌ATCC13869的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)基因的啟動子的結(jié)合參考谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成序列號14、序列號25所示的引物。通過PCR法從實(shí)施例1(2)制備的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的染色體DNA中擴(kuò)增含有相當(dāng)于PS2蛋白質(zhì)基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)。為了構(gòu)建與具有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)基因的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)，序列號25給出的引物含有編碼產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的N末端一側(cè)的氨基酸序列的堿基序列。(序列號25)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3<序列表說明>序列號25PCR引物另外，以具有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的融合基因序列為基礎(chǔ)，合成序列號26和9所示的引物，利用PCR法從實(shí)施例4(1)中得到的pVSPTG1中擴(kuò)增具有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因區(qū)。(序列號26)5’-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3’<序列表說明>序列號26PCR引物接下來，將擴(kuò)增的含有相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白質(zhì)基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl，與已擴(kuò)增的具有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，擴(kuò)增具有含有相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2蛋白基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)的、帶有與編碼產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)N末端一側(cè)25個氨基酸殘基的區(qū)域相連的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴(kuò)增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點(diǎn)，得到pVKSPTG1。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認(rèn)構(gòu)建了象預(yù)想那樣的融合基因。
另外，通過用KpnI和XbaI消化pVKSPTG1，切出大約1.8kb的具有含有相當(dāng)于谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2細(xì)胞表面蛋白基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)的、帶有與編碼產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)N末端一側(cè)25個氨基酸殘基(信號肽)區(qū)域相連的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)，通過瓊脂糖凝膠電泳回收。然后通過將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建pPKSPTG1。質(zhì)粒pVKSPTG1和pPKSPTG1都是由源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子、源自產(chǎn)氨棒桿菌的S1pA的信號肽和源自茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因構(gòu)成的。(3)轉(zhuǎn)換為E.coli的tac啟動子參考E.coli的tac啟動子被克隆的質(zhì)粒pKK223-3(AmershamPharmacia公司制)的序列，合成序列號27和28所示的引物。通過PCR法從pKK223-3的DNA擴(kuò)增相當(dāng)于tac啟動子的區(qū)域。為了構(gòu)建具有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)，序列號28給出的引物含有編碼產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的N末端一側(cè)的氨基酸序列的堿基序列。(序列號27)5’-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3’(序列號28)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3<序列表說明>序列號27、28PCR引物接下來，將擴(kuò)增的相當(dāng)于tac啟動子區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl，和在實(shí)施例4(2)擴(kuò)增的具有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因區(qū)的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號27和序列號9進(jìn)行交叉PCR，擴(kuò)增具有tac啟動子的、帶有與編碼產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)N末端一側(cè)的25個氨基酸殘基的區(qū)域相連的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因)。通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出大約1.5kb的擴(kuò)增片段。使用EASYTRAP Ver.2(寶酒造公司制)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到特開平9-070291所述的pVC7的SmaI位點(diǎn)，得到pVTSPTG1。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認(rèn)構(gòu)建了象預(yù)想那樣的融合基因。
另外，通過用KpnI和XbaI消化pVTSPTG1，切出大約1.5kb的具有tac啟動子的、帶有與編碼產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白(S1pA)N末端一側(cè)25個氨基酸殘基的區(qū)域相連的前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，通過瓊脂糖凝膠電泳回收。然后將該片段插入到特開平9-322774所述的pPK4的KpnI-XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建pPTSPTG1。質(zhì)粒pVTSPTG1和pPTSPTG1都是由源自于E.coli的tac啟動子，源自于產(chǎn)氨棒桿菌的S1pA的信號肽，源自茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因構(gòu)成的。(4)利用產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列分泌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原用構(gòu)建的質(zhì)粒pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素或25mg/l的卡那霉素的上述MM液體培養(yǎng)基于30℃下分別培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)所述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Westernblot。結(jié)果無論pVC7，還是pPK4載體都可以確認(rèn)有大致等量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。表2給出了有代表性的分泌量。表2.利用產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列獲得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌生產(chǎn)量
(5)通過分散酶消化來切斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原和檢測活性向攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1和pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869培養(yǎng)上清加入作為蛋白酶的分散酶(BoeringerManheim公司制)，添加的比例為底物∶酶＝1∶1，于pH7.5、37℃下反應(yīng)1小時。分散酶消化反應(yīng)后，通過SDS-PAGE確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原被切情況，再經(jīng)氧肟酸酯(hydroxamate)法確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，可確認(rèn)具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。實(shí)施例5通過茂原鏈輪絲菌的培養(yǎng)液和菌體切斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原和檢測活性(1)通過茂原鏈輪絲菌IFO13819株的培養(yǎng)液切斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原和檢測活性茂原鏈輪絲菌IFO13819菌株用ISP2液體培養(yǎng)基(將酵母提取物4g、麥芽提取物10g、葡萄糖4g用水配成1L溶液，pH調(diào)節(jié)為7.3)于30℃下培養(yǎng)24小時。向10ml該培養(yǎng)液中添加在實(shí)施例4(5)中也應(yīng)用過的蓄積了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1或pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的經(jīng)膜過濾器過濾的培養(yǎng)上清10ml，于30℃下保持6小時。然后進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被切情況，再經(jīng)氧肟酸酯法確認(rèn)具有與天然型大致一樣的比活性(約20U/mg)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。另外，在SDS-PAGE后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)移將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene-defluoride，PVDF)膜上(用于基因克隆的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析，東京化學(xué)同人(1993))。蛋白轉(zhuǎn)移后，可以用考馬斯亮藍(lán)對膜進(jìn)行染色、脫色、風(fēng)干。將成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質(zhì)序列儀(Model 476A，Perkin Elmer Co.Ltd制)解析N末端氨基酸序列。解析結(jié)果可以確認(rèn)具有與序列號5所示的天然型成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶一樣的N末端氨基酸序列。(2)通過茂原鏈輪絲菌IFO13819株的菌體切斷帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和檢測活性茂原鏈輪絲菌IFO13819菌株用ISP2液體培養(yǎng)基于30℃下培養(yǎng)24小時。將10ml該培養(yǎng)液經(jīng)離心分離收集菌體，用生理鹽水洗2次。將最后收集的菌體懸浮于10ml的生理鹽水中，然后添加在實(shí)施例4(5)中也應(yīng)用過的蓄積了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的攜有pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1或pPTSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的經(jīng)膜過濾器過濾的培養(yǎng)上清10ml，于30℃下保持6小時。然后進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被切情況，再經(jīng)氧肟酸酯法確認(rèn)具有與天然型大致一樣比活性(約20U/mg)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。另外，在SDS-PAGE后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)移將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(用于基因克隆的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析，東京化學(xué)同人(1993))。蛋白轉(zhuǎn)移后，可以用考馬斯亮藍(lán)對PVDF膜進(jìn)行染色、脫色、風(fēng)干。將成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質(zhì)序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結(jié)果可以確認(rèn)具有與序列號5所示的天然型成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶一樣的N末端氨基酸序列。實(shí)施例6利用具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列、以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的編碼序列的融合基因進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌生產(chǎn)(1)具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列、以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的編碼序列的融合基因的構(gòu)建肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列已經(jīng)確定(特原平11-295649)。人們推定第1位到第32位的氨基酸序列為酶的前導(dǎo)(pre)部分的序列，而33到86位的氨基酸序列為前體(pro)部分的序列，而87到416位的氨基酸序列為成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列。推定的前體結(jié)構(gòu)和成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如序列號4和43所示。而用含有該基因的質(zhì)粒pUJ-MTG轉(zhuǎn)化的大腸桿菌AJ13669于1999年1O月14日以FERM P-17602寄存于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(日本國 305-8566茨城縣筑波市東1丁目1-3)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2000年8月28日進(jìn)行移交，寄存號為FERM BP-7287。
首先用限制酶BamHI從pUI-MTG中切出覆蓋前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的全長的約3.5kb片段的區(qū)域，然后將它插入pUCl9的BamHI位點(diǎn)，制作pUCSCTG。
以pUCSCTG為模板，合成序列號44和序列號45所示的引物，通過同樣的PCR法使含有源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的基因區(qū)域擴(kuò)增。(序列號44)5’-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3’(序列虧45)5’-GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3’<序列表說明)序列號44、45PCR引物接下來，以實(shí)施例4(2)構(gòu)建的pPKSPTG1為模板，通過序列號46和序列號47組合，利用PCR法使含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)域的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的信號序列的區(qū)域擴(kuò)增。
為了構(gòu)建與源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，序列號47給出的引物含有編碼源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的N末端一側(cè)的氨基酸的堿基序列。(序列號46)5’-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3’(序列號47)5’-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GG C C-3’<序列表說明>序列號46、47PCR引物接下來，將擴(kuò)增的編碼含有源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的基因區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl，與擴(kuò)增的含有PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號46和序列號45進(jìn)行交叉PCR，使含有PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列相連的外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因片段擴(kuò)增。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴(kuò)增片段。該片段用EcoRI和BamHI消化后，從瓊脂糖凝膠中回收該片段，插入到pUC19的EcoRI-BamHI位點(diǎn)，得到pUKSPTG2’。按照上述方法測定插入片段的堿基序列，確認(rèn)構(gòu)建了象預(yù)想那樣的融合基因。用EcoRI消化該pUKSPTG2’，使用Blunting kit(寶酒造公司制)進(jìn)行平端化，插入帶有5’-末端磷酸化的5’-CTCTAGAG-3’序列的XbaI接頭(寶酒造公司制)，再環(huán)化構(gòu)建pUKSPTG2。通過用XbaI消化pUKSPTG2，切出大約1.8kb的融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852)，通過瓊脂糖凝膠電泳回收。然后通過將該片段插入到上述pPK4的XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建pPKSPTG2。
然后構(gòu)建帶有前體結(jié)構(gòu)部分的N末端的一部分被茂原鏈輪絲菌的前體結(jié)構(gòu)部分替換的嵌合前體結(jié)構(gòu)部分的前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因(成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因和前體結(jié)構(gòu)部分的一部分源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852)。
首先從實(shí)施例4(2)構(gòu)建的質(zhì)粒pPKSPTG1(用于表達(dá)茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原)切出EcoRI-BamHI的含有大約1.8kb的前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的片段，然后插入到pUC19的EcoRI-BamHI位點(diǎn)(pUKSPTG1)。pUKSPTG1用AatII消化，切出大約1.2kb的片段，同時pUKSPTG2’也用AatII消化，制備除去大約1.2kb片段后的約3.3kb片段。將該約3.3kb片段與源自pUKSPTG1的約1.2kb片段連接，按照常規(guī)的基因操作法篩選插入了AatII片段的克隆。為了了解其中AatII片段插入的方向，依次進(jìn)行測序，篩選按目的方向(編碼前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原)插入的克隆(pUKSPTG3’)。而對pUKSPTG3’也要象對pUKSPTG2’操作那樣使其EcoRI位點(diǎn)平端化，插入XbaI接頭，構(gòu)建pUKSPTG3。通過從pUKSPTG3切出XbaI的大約1.8kb片段，插入到pPK4的XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建pPKSPTG3。(2)利用產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列分泌源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原用構(gòu)建的質(zhì)粒pPKSPTG2和pPKSPTG3轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在上述含有25mg/l的卡那霉素的CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG2和pPKSPTG3的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分別用含有25mg/l的卡那霉素的MMTG液體培養(yǎng)基(將葡萄糖60g、硫酸鎂7水合物0.4g、硫酸銨30g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鐵7水合物0.01g、硫酸錳5水合物0.01g、硫胺素鹽酸鹽450μg、生物素450μg、DL-蛋氨酸0.15g、碳酸鈣50g用水配成1L溶液，pH調(diào)節(jié)為7.5)分別于30℃條件下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。該抗體雖然是抗源自茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的抗體，但對源自肉桂鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶也有反應(yīng)性。結(jié)果可以確認(rèn)，分泌了約30～50mg/L的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。實(shí)施例7通過將源自茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分替換為源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的前體結(jié)構(gòu)部分(制作雜化體)進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌生產(chǎn)合成序列號14和序列號48所示的引物，利用PCR法分別從pPKSPTG2或pPKSPTG3擴(kuò)增含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分序列的區(qū)域的堿基序列。
為了構(gòu)建含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列、以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因(源自茂原鏈輪絲菌IFO13819)的融合基因(外源融合前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原)，序列號48給出的引物含有編碼源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端一側(cè)氨基酸的堿基序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號48)5’-GGG GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG GGG GCC CGG GAG GGC GCG CTG G-3’<序列表說明>序列號48PCR引物另外，以實(shí)施例1(1)測定的源自茂原鏈輪絲菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因序列為基礎(chǔ)，合成序列號8和序列號9所示的引物，利用PCR法從實(shí)施例1(1)中得到的pUITG擴(kuò)增源自茂原鏈輪絲菌的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因區(qū)域。(序列號8)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’(序列號9)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’<序列表說明>序列號8、9PCR引物接下來，將分別擴(kuò)增的含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分序列的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl，與已擴(kuò)增的源自茂原鏈輪絲菌的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因編碼區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌ATCC13869的PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白(S1pA)的信號序列以及源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因(源自茂原鏈輪絲菌IFO13819)的融合基因片段擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的擴(kuò)增片段。使用ScaI和EcoO65I消化該擴(kuò)增片段，從瓊脂糖凝膠中回收生成的約800bp的片段，通過與從實(shí)施例4(2)構(gòu)建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構(gòu)建pPKSPTG4和pPKSPTG5。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’(2)利用產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列和源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852的前體結(jié)構(gòu)部分分泌源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用構(gòu)建的質(zhì)粒pPKSPTG4和pPKSPTG5轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在上述含有25mg/l的卡那霉素的CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG4和pPKSPTG5的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分別用含有25mg/l的卡那霉素的MMTG液體培養(yǎng)基于30℃條件下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Westernblot解析。結(jié)果可以確認(rèn)帶有源自肉桂鏈輪絲菌IFO12852前體結(jié)構(gòu)部分的源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。表3給出了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的產(chǎn)量。用pPKSPTG1作對照，其基因構(gòu)成上的特點(diǎn)是前體結(jié)構(gòu)部分源自茂原鏈輪絲菌。pPKSPTG4具有其前體結(jié)構(gòu)部分源自肉桂鏈輪絲菌的基因結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)。pPKSPTG5具有其前體結(jié)構(gòu)部分的N末端開始的16個氨基酸源自茂原鏈輪絲菌，而C末端的40個氨基酸源自肉桂鏈輪絲菌的嵌合前體結(jié)構(gòu)的基因結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)。除此之外，其他方面三者是共同的。結(jié)果可以看出由于前體結(jié)構(gòu)的氨基酸序列的不同其分泌量存在著明顯的差異。具有嵌合前體結(jié)構(gòu)的分泌量最高。表3.由于前體結(jié)構(gòu)部分的不同對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原分泌產(chǎn)量的影響
實(shí)施例8絲氨酸蛋白酶(SAMP45)基因的克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建評價(1)具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的絲氨酸蛋白酶(SAMP45)基因(外源融合絲氨酸蛋白酶(SAMP45)基因)的構(gòu)建作為白灰淺鏈霉菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶SAMP45的基因序列已經(jīng)確定[J.Baceriol.，179，430-438(1997)]。參考該序列，合成序列號49和序列號50所示的引物，按照先前敘述的方法利用PCR法擴(kuò)增含有SAMP45的N末端前體結(jié)構(gòu)、成熟SAMP45以及C末端前體結(jié)構(gòu)的基因區(qū)。(序列號49)5’-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3’(序列號50)5’-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3’<序列表說明>序列號49、50PCR引物接下來，以實(shí)施例4(2)構(gòu)建的pPKSPTG1為模板，通過序列號51和序列號52組合，利用相同PCR法擴(kuò)增含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)域的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA基因的信號序列的區(qū)域。
為了構(gòu)建帶有前體結(jié)構(gòu)部分的絲氨酸蛋白酶的融合基因，序列號52含有編碼絲氨酸蛋白酶原的N末端一側(cè)的氨基酸的堿基序列。(序列號51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’(序列號52)5’-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3’<序列表說明>序列號51、52用于構(gòu)建融合前絲氨酸蛋白酶原基因的PCR引物接下來，將分別擴(kuò)增的編碼SAMP45的N末端前體結(jié)構(gòu)、成熟SAMP45以及含有C末端前體結(jié)構(gòu)的基因區(qū)域的PCR反應(yīng)液各1μl，與已擴(kuò)增的含有PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)與含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA基因的信號序列的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，用序列號51和50進(jìn)行交叉PCR，使含有PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列相連的外源融合前絲氨酸蛋白酶原基因片段擴(kuò)增。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約3.9kb的擴(kuò)增片段。使用HindIII和EcoRI消化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中回收約3.9kb的片段，通過插入到上述的pVC7的HindIII-EcoRI位點(diǎn)，分別得到pVSS1。按照先前敘述的方法測定插入片段的堿基序列，可確認(rèn)構(gòu)建了預(yù)想那樣的融合基因。(2)利用產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白的信號序列分泌絲氨酸蛋白酶用構(gòu)建的質(zhì)粒pVSS1轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下培養(yǎng)70小時。該培養(yǎng)液1ml經(jīng)離心分離，將培養(yǎng)上清與菌體分離。菌體懸浮于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中。絲氨酸蛋白酶活性測定按如下步驟進(jìn)行。向含有0.25mM的Bz-Phe-Val-Arg-pNA(Bachem Co.Ltd.制)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中加入培養(yǎng)上清或菌體懸浮液50μl，總?cè)芤毫繛?.6ml，于30℃下反應(yīng)20分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應(yīng)。測定410nm的吸光度，通過算出游離的pNA(對硝基酰替苯胺)的量確定活性。而一個酶單位為在一分鐘內(nèi)使1μm的pNA游離所需的酶量。測定結(jié)果表明，在培養(yǎng)上清中沒有檢測出絲氨酸蛋白酶的活性，而在菌體懸浮液中可以檢測到活性。通過從檢測出的活性值和文獻(xiàn)[J.Bacteriol.，179，430-438(1997)]中記載的比活值計(jì)算的結(jié)果，可以確認(rèn)有約相當(dāng)于9mg/l的絲氨酸蛋白酶分泌在菌體表面。(3)通過在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達(dá)的絲氨酸蛋白酶切去帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分用構(gòu)建的質(zhì)粒pVSS1轉(zhuǎn)化攜有實(shí)施例4(2)所述的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1、pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下培養(yǎng)70小時。取培養(yǎng)結(jié)束后的上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。結(jié)果表明SAMP正常分泌表達(dá)，而且分泌的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分被切去，并可確認(rèn)分泌具有與天然的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶大致相同分子量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
對該培養(yǎng)上清用上述的氧肟酸酯法確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性時，確認(rèn)具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。
另外，在SDS-PAGE后，按照先前敘述的方法經(jīng)半干轉(zhuǎn)移將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。蛋白轉(zhuǎn)移后，用考馬斯亮藍(lán)對膜進(jìn)行染色、脫色、風(fēng)干。將成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質(zhì)序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結(jié)果可以確認(rèn)，序列號5所示的源自茂原鏈輪絲菌的天然型的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶帶有前體結(jié)構(gòu)部分的C末端一側(cè)氨基酸的Phe-Arg-Ala-Pro 4個氨基酸的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例9脯氨酸特異性肽酶(svPEP)基因的克隆和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建評價(1)茂原鏈輪絲菌生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的純化將800ml的ISP2液體培養(yǎng)基(將酵母提取物4g、麥芽提取物10g、葡萄糖4g用水配成1L溶液，pH調(diào)節(jié)為7.3)加到5L坂口燒瓶中，將茂原鏈輪絲菌IFO13819株從板上移植到培養(yǎng)基中，于30℃下，以120rpm速度振蕩培養(yǎng)48小時。
對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，去除培養(yǎng)上清回收菌體。用含有25mg/l的卡那霉素的20mM Tris-HCl緩沖液洗凈后，將得到的菌體懸浮于含有25mg/l的卡那霉素的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。于冰上振蕩4小時后，通過離心分離回收上清。用硝酸纖維素膜(孔徑0.22μm，Satrius公司制)過濾滅菌后，用FPLC(Amarsham Pharmacia公司制)通過用1.5M硫酸銨/50mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的丁基-瓊脂糖4FF(Amarsham Pharmacia公司制)柱(1.6φ×10cm)，用同一緩沖液中硫酸銨1.5-0M的線性濃度梯度進(jìn)行洗脫。回收含有活性成分的組分，再于相同的條件通過苯基-瓊脂糖HP柱(1ml，AmarshamPharmacia公司制)，回收活性組分，然后對50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)于4℃下透析過夜。通過以上操作可獲得部分純化的酶液。
表4給出了上述各個階段的總蛋白量、總活性、比活性、收率以及純化程度。而各個階段的酶活性的測定按照芳本等人的方法(鶴·船津編；生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法31蛋白質(zhì)分解酶II，學(xué)會出版中心(1993)，p187)按如下步驟進(jìn)行。
向含有0.25mM的Ala-Ala-Pro-pNA(Bachem公司制)的20mM磷酸鈉緩沖液中加入酶溶液，總?cè)芤毫繛?.6ml，于30℃下反應(yīng)5分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應(yīng)。測定410nm的吸光度，通過算出游離的pNA的量確定活性。一個酶活性單位為在1分鐘內(nèi)使1μmol的pNA游離所需的酶量。表4.茂原鏈輪絲菌生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的純化純化步驟體積總活性 總蛋白量比活性收率 純化度(ml)(單位)(mg) (單位/mg) (％) (倍)粗酶提取液 550 308 385 0.80 100 1丁基-瓊脂糖 45.6 213 8.9823.7 69 304FF苯基-瓊脂糖 5.8 136 3.8335.5 44 44HP(2)茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的N末端氨基酸序列的解析部分純化的酶液用反相柱色譜進(jìn)一步純化。反相柱色譜的條件如下。HPLC裝置泵HITACHI L-6300，檢測器L-4000H柱子PROTEIN C4 214TP5410(VYDAC公司制)洗脫條件24-40％乙腈線性梯度/0.1％三氟乙酸(20分鐘)，于室溫下進(jìn)行洗脫流速1.0ml/min檢測波長280nm將上述條件下純化的酶樣品用Membrane Cartridge(PerkinElmer公司制)轉(zhuǎn)移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene-defluoride，PVDF)膜上，利用氣相蛋白測序儀PPSQ-10(島津制作所制)解析N末端氨基酸序列。結(jié)果可得到序列號53所示的N末端的20個氨基酸殘基序列。(序列號53)Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile leu Lys Ile Pro1 5 10Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys15 20(3)茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)的特性評價就以下特性對茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶進(jìn)行了評價(i)底物特異性(a)以帶有發(fā)色基團(tuán)pNA的肽為底物時向含有附加了pNA的各種肽(濃度都是0.25mM)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)加入純化的酶溶液，總?cè)芤毫繛?.6ml，于37℃下反應(yīng)5分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應(yīng)。測定410nm的吸光度，求出酶切活性。(b)以帶有發(fā)色基團(tuán)βNA(β-萘甲酰胺)的肽為底物時向含有各種肽(濃度都是0.3mM)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)加入純化的酶溶液，總?cè)芤毫繛?.0ml，于37℃下反應(yīng)5分鐘后，加0.4ml的Fastgarnet GBC溶液(用10％Triton X-100/1M乙酸鈉(pH4.0)溶解，使?jié)舛葹?.1％)終止反應(yīng)。測定550nm的吸光度，求出酶切活性。(c)以肽為底物時以配成1mg/ml的肽溶液為底物，加酶液，于30℃下反應(yīng)1小時。通過以下條件的HPLC確認(rèn)酶切活性。柱子YMC-PACK ODS-A 4.6×150mm(YMC)洗脫液0.1％三氟乙酸(TFA)-乙腈流速1ml/min檢測波長UV220nm結(jié)果表明，該酶是特異切斷脯氨酸的羧基側(cè)肽鍵的酶，能很好地依次識別Ala-Ala-Pro-pNA、Pro-Arg-Ala-Xaa(序列號68)(式中Xaa代表Pro-pNA，pNA代表對硝基酰替苯胺)、Ala-Phe-Pro-pNA，對含有從N末端開始的第3位或第4位脯氨酸的肽有很高的反應(yīng)性。但對含有從N末端開始的第2位或第5位脯氨酸的肽沒有作用(表5)。
表5.svPEP的特異性P52
PNA對硝基酰替苯胺，βNAβ-萘甲酰胺<序列表說明>序列號68svPEP用底物(ii)最適pHpH4～620mM乙酸鈉緩沖液pH5.5～820mM磷酸鈉緩沖液pH6.5～9.520mM Tris-HCl緩沖液分別使用以上3種緩沖液，以Ala-Ala-Pro-pNA為底物，于30℃下反應(yīng)5分鐘。以20mM磷酸鈉緩沖液pH6.5時的活性為100％，算出使用各種緩沖液時的相對活性。結(jié)果表明，最適pH為6～6.5。(iii)pH穩(wěn)定性使用pH3至10的0.15M GTA緩沖液(由3，3-二甲基戊二酸、三(羥甲基)氨基甲烷、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇配成的緩沖液)，向20μl純化的酶液中加入各種pH的緩沖液40μl，于4℃下放置過夜后，將pH調(diào)到7.0，溶液量調(diào)到120μl。取出其中的50μl加入Ala-Ala-Pro-pNA，于30℃下反應(yīng)5分鐘。以pH為7.0、以及在與上述相同條件下保存時的活性為100％，各個pH下的相對底物分解量為殘余活性。結(jié)果表明在pH4～9范圍內(nèi)穩(wěn)定。(iv)最適溫度向50μl純化的酶液中加入0.5ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)，然后加入Ala-Ala-Pro-pNA，使其終濃度為0.25mM，從20℃到60℃進(jìn)行5分鐘的分解反應(yīng)。以25℃下的底物分解量為100％時的各個溫度的相對分解量作為相對活性。結(jié)果表明最適溫度為25～30℃。(v)溫度穩(wěn)定性向50μl純化的酶液中加入0.5ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)，于4℃或20℃到60℃處理15分鐘，冰冷后加入Ala-Ala-Pro-pNA，使其終濃度為0.25mM，于30℃下反應(yīng)5分鐘。以上述4℃下處理時的活性為100％算出殘余活性。結(jié)果表明20℃以下時穩(wěn)定。(vi)抑制劑向含有如表6所示濃度的各種化合物的20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中加入純化的酶溶液，于室溫下放置10分鐘。然后加入Ala-Ala-Pro-pNA，于30℃下反應(yīng)5分鐘。以對沒有添加化合物時的Ala-Ala-Pro-pNA的活性為100％，以添加各種化合物時的相對底物分解量為相對活性。結(jié)果表明，雖然也受到作為SH酶抑制劑的對氯汞苯甲酸等的一些抑制，但受到作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的苯基甲基磺酰氟(Nakaraitesk公司制)和氨基乙基苯磺酰氟鹽酸鹽(BoeringerManheim公司制)的抑制作用比較強(qiáng)。表6.抑制劑對茂原鏈輪絲菌IFO13819生成的脯氨酸特異性肽酶活性的影響
(3)源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)基因的獲得在從測定的svPEP的N末端20個氨基酸序列中推定的堿基序列中選出簡并少的部位Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-G1u-Glu-Lys，制備序列號54所示的合成寡核苷酸。以該合成寡核苷酸為探針，用識別6堿基序列的各種限制酶消化按照常規(guī)方法制備的茂原鏈輪絲菌IFO13819的染色體DNA，通過Southern blot雜交進(jìn)行解析，可檢測出經(jīng)SacI剪切的約6kb的單一帶。于是再用SacI消化按照前面方法制備的茂原鏈輪絲茵IFO13819的染色體DNA，利用EASYTRAPVer.2(寶酒造公司制)通過瓊脂糖凝膠電泳回收約6kb片段。將回收的片段插入到pUC18的SacI位點(diǎn)后，導(dǎo)入大腸桿菌IM109(寶酒造公司制)的感受態(tài)細(xì)胞，制備文庫。通過用32P標(biāo)記的序列號54所示的合成寡核苷酸作為探針，對制備的文庫用茵落雜交來進(jìn)行文庫的篩選，篩選攜有svPEP基因片段被克隆的質(zhì)粒的菌株，獲得目的基因。從該菌株回收的質(zhì)粒命名為pUMP1。(序列號54)5’-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3’<序列表說明>序列號54用于篩選svPEP的探針測定以pUMP1克隆的片段的堿基序列。序列號41給出了對應(yīng)于svPEP的svPEP基因序列。推定該基因編碼的氨基酸序列時，發(fā)現(xiàn)了由先前純化的酶蛋白測定的N末端部分氨基酸序列(20個殘基)，進(jìn)而確定了序列號40所示的成熟型svPEP的氨基酸一級序列。另外也確定了含有序列號42所示的svPEP的信號序列以及估計(jì)為前體結(jié)構(gòu)的區(qū)域的整個氨基酸一級序列。
用pUMP1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌AJ13691以FERM BP-7160編號于2000年5月15日按照布達(dá)佩斯條約寄存于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(日本國 305-8566茨城縣筑波市東1丁目1-3)。(4)具有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白的信號序列的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的脯氨酸特異性肽酶(svPEP)基因(外源融合前脯氨酸特異性肽酶(svPEP)原基因)的構(gòu)建以實(shí)施例9(3)測定的svPEP的序列為參考，以實(shí)施例9(3)構(gòu)建的pUMP1為模板，合成序列號55和序列號56所示的引物，按照前面同樣的方法利用PCR法擴(kuò)增含有svPEP的前體結(jié)構(gòu)以及成熟svPEP的基因區(qū)域。(序列號55)5’-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3’(序列號56)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’<序列表說明>序列號55、56PCR引物接下來，用實(shí)施例4(2)中構(gòu)建的pPKSPTG1為模板，通過序列號51和序列號57的組合，利用PCR法擴(kuò)增含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)域的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA基因的信號序列的區(qū)域。
為了構(gòu)建與帶有前體結(jié)構(gòu)部分的svPEP的融合基因，序列號57所示的引物含有編碼svPEP的N末端一側(cè)的氨基酸的序列。(序列號51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’(序列號57)5’-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3’<序列表說明>序列號57PCR引物接下來，將分別擴(kuò)增的含有svPEP的前體結(jié)構(gòu)以及成熟svPEP的基因區(qū)域的PCR反應(yīng)液各1μl，與已擴(kuò)增的含有PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號51和序列號56進(jìn)行交叉PCR，使含有PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列相連的外源融合前svPEP原基因片段擴(kuò)增。(序列號51)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’(序列號56)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約2.1kb的擴(kuò)增片段。使用HindIII消化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中回收約2.1kb的片段，通過插入到實(shí)施例8(1)所述的pVSS1的HindIII位點(diǎn)，分別得到pVSSSP1。按照常規(guī)方法測定插入片段的堿基序列，可確認(rèn)構(gòu)建了預(yù)想那樣的融合基因。(5)利用產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白的信號序列分泌脯氨酸特異性肽酶用構(gòu)建的質(zhì)粒pVSSSP1轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSSSP1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下培養(yǎng)70小時。該培養(yǎng)液1ml經(jīng)離心分離，將培養(yǎng)上清與菌體分離。菌體懸浮于0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。svPEP的活性按下述步驟測定。向含有0.25mM的Ala-Ala-Prp-pNA(Bachem Co.Ltd.制)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中加入培養(yǎng)上清或菌體懸浮液50μl，總?cè)芤毫繛?.6ml，于30℃下反應(yīng)20分鐘后，加0.4ml的50％醋酸終止反應(yīng)。測定410nm的吸光度，通過算出游離的pNA的量確定活性。而一個酶單位為在一分鐘內(nèi)使1μm的pNA游離所需的酶量。測定結(jié)果表明，在培養(yǎng)上清中沒有檢測出svPEP的活性，而在菌體懸浮液中可以檢測到活性。通過從檢測出的活性值和實(shí)施例9(1)的比活性值計(jì)算的結(jié)果可以確認(rèn)有約相當(dāng)于50mg/l的svPEP分泌在菌體表面。(6)利用在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達(dá)的絲氨酸蛋白酶和脯氨酸特異性肽酶切去帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分用構(gòu)建的質(zhì)粒pVSSSP1轉(zhuǎn)化攜有實(shí)施例4(2)所述的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSSSP1、pPKSPTG1的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下培養(yǎng)70小時。取培養(yǎng)結(jié)束后的上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。結(jié)果表明SAMP45和svPEP正常分泌表達(dá)，而且分泌的帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分被切去，能夠確認(rèn)與天然的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有大致相同分子量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。
對該培養(yǎng)上清用上述的氧肟酸酯法確認(rèn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性時，確認(rèn)具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。
另外，在SDS-PAGE后，按照先前敘述的方法經(jīng)半干轉(zhuǎn)移將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。蛋白轉(zhuǎn)移后，用考馬斯亮藍(lán)對膜進(jìn)行染色、脫色、風(fēng)干。將成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質(zhì)序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結(jié)果可以確認(rèn)獲得了與序列號5所示的源自茂原鏈輪絲菌的天然型成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶一樣的，N末端的氨基酸為Asp的序列。實(shí)施例10源自茂原鏈輪絲菌IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分的部分缺失體構(gòu)建和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌生產(chǎn)(1)前體結(jié)構(gòu)部分的部分缺失型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的構(gòu)建首先為了構(gòu)建前體結(jié)構(gòu)部分的C末端一側(cè)的氨基酸殘基的部分缺失型，以實(shí)施例1(1)測定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因序列為基礎(chǔ)，合成如序列號8和9所示的引物，利用與前面相同的PCR法從實(shí)施例1(1)中得到的pUITG中擴(kuò)增成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因區(qū)域。
接下來，用實(shí)施例4(2)中構(gòu)建的pPKSPTG1為模板，通過序列號14和序列號58的組合，或者序列號14與序列號59的組合，利用PCR法使含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2的啟動子區(qū)域的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的信號序列以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的基因區(qū)域擴(kuò)增。
為了構(gòu)建與成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，序列號58所示的引物含有缺失了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的C末端2個氨基酸殘基序列Ala-Pro的基因序列，序列號59所示的引物具有缺失了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的C末端4個氨基酸殘基序列Phe-Arg-Ala-Pro的基因序列，同時還都含有編碼成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端一側(cè)的氨基酸的序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTCATTTAG-3’(序列號58)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC CGG AAC GAC GGG CCG GCG C-3’(序列號59)5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC GAC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’<序列表的說明>序列號58、59PCR引物接下來，將分別擴(kuò)增的含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列以及各個變異前體結(jié)構(gòu)部分的區(qū)域的基因區(qū)域的PCR反應(yīng)液各1μl，與已擴(kuò)增的編碼成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分缺失型前體結(jié)構(gòu)部分相連的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因片段分別擴(kuò)增。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的各個擴(kuò)增片段。從瓊脂糖凝膠中回收使用ScaI和EcoO65I消化這些片段生成的約800bp的片段，通過與從實(shí)施例4(2)構(gòu)建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構(gòu)建pPKSPTG1ΔAP(Ala-Pro缺失型)和pPKSPTG1ΔFRAP(Phe-Arg-Ala-Pro缺失型)。
為了構(gòu)建前體結(jié)構(gòu)部分的N末端一側(cè)的氨基酸殘基的部分缺失型，以實(shí)施例1(1)測定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因序列為基礎(chǔ)，合成如序列號60和61所示的引物，通過序列號60和序列號9的組合，或者序列號61和序列號9的組合，利用PCR法從實(shí)施例1(1)中得到的pUITG中擴(kuò)增轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的基因區(qū)域。(序列號60)5’-AAT GGC GCG GGG GAA GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC T-3’(序列號61)5’-GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC TAC CGC CTC ACG GCG G-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’<序列表說明>序列號60、61PCR引物接下來，用實(shí)施例4(2)中構(gòu)建的pPKSPTG1為模板，通過序列號14和序列號62的組合，或者序列號14與序列號63的組合，利用PCR法使含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)域的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的信號序列的區(qū)域擴(kuò)增。
為了構(gòu)建與產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的信號序列的融合基因，序列號62所示的引物具有缺失了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的N末端1個氨基酸殘基Asp的基因序列，序列號63所示的引物具有缺失了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的N末端6個氨基酸殘基的序列Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu的基因序列，同時還都含有編碼產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的信號序列的C末端一側(cè)的氨基酸的序列。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號62)5’-GTC TCT TCC CCC GCG CCA TTT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3’(序列號63)5’-TCG GCG TAG GAC TTC GTC TCT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3’<序列表說明>序列號62、63PCR引物接下來，將分別擴(kuò)增的含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列的區(qū)域的基因區(qū)域的PCR反應(yīng)液各1μl，與已擴(kuò)增的編碼前體結(jié)構(gòu)部分的N末端部分缺失的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分缺失型前體結(jié)構(gòu)部分相連的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因片段擴(kuò)增。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出大約1.8kb的各個擴(kuò)增片段。從瓊脂糖凝膠中回收用ScaI和EcoO65I消化這些片段生成的約800bp的片段，通過與從實(shí)施例4(2)構(gòu)建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構(gòu)建pPKSPTG1ΔD(Asp缺失型)以及pPKSPTG1ΔDNGAGE(Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu缺失型)。(2)前體結(jié)構(gòu)部分缺失型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌用構(gòu)建的質(zhì)粒pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下分別培養(yǎng)48小時。取培養(yǎng)結(jié)束后的上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。結(jié)果可以確認(rèn)前體結(jié)構(gòu)部分部分缺失的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。雖然帶有pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD的重組體分別都表現(xiàn)出與天然型(pPKSPTG1)同等的分泌性，但帶有pPKSPTG1ΔDNGAGE的重組體的分泌量只是天然型(pPKSPTG1)分泌量的一半。(3)利用在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達(dá)的絲氨酸蛋白酶切去前體結(jié)構(gòu)部分缺失型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分用實(shí)施例8(1)構(gòu)建的質(zhì)粒pVSSSP1轉(zhuǎn)化攜有實(shí)施例10(2)所述的前體結(jié)構(gòu)部分缺失型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1和pPKSPTG1ΔAP、pPKSPTG1ΔFRAP、pPKSPTG1ΔD或pPKSPTG1ΔDNGAGE的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下分別培養(yǎng)70小時。取培養(yǎng)結(jié)束后的上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。
結(jié)果表明SAMP45正常分泌表達(dá)，而且分泌的前體結(jié)構(gòu)部分缺失型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分被切去，能夠確認(rèn)與天然的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有大致相同的分子量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。
另外，在SDS-PAGE后，按照先前敘述的方法經(jīng)半干轉(zhuǎn)移將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。蛋白轉(zhuǎn)移后，用考馬斯亮藍(lán)對膜進(jìn)行染色、脫色、風(fēng)干。將成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質(zhì)序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結(jié)果可以確認(rèn)，攜有pPKSPTG1△AP的重組體在序列號5所示的天然成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端附加了Phe-Arg；攜有pPKsPTG1△FRAP的重組體在成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端附力口了Ser-Ala-Gly-Pro-Ser；攜有pPKSPTG1△D及pPKSPTG1△DNGAGE重組體在成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中附加了Phe-Arg-Ala-Pro。實(shí)施例11源白茂原鏈輪絲茵IFO13819的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的前體結(jié)構(gòu)部分的變異體構(gòu)建和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌生產(chǎn)(1)前體結(jié)構(gòu)部分變異型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因的構(gòu)建以實(shí)施例1(1)測定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因序列為基礎(chǔ)，合成如序列號8和9所示的引物，利用PcR法從實(shí)施例1(1)中得到的puITG中擴(kuò)增成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的基因區(qū)域。
接下來，用實(shí)施例4(2)中構(gòu)建的pPKSPTG1為模板，通過序列號14和序列號64的組合，或者序列號14與序列號65的組合，或者序列號14與序列號66的組合，序列號14與序列號67的組合，利用PcR法使含有谷氨酸棒桿茵的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)域的5’-上游區(qū)和含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)S1pA的信號序列以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的區(qū)域擴(kuò)增。
序列號64所示的引物含有將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的C末端3個氨基酸殘基序列Arg-Ala-Pro轉(zhuǎn)換為Gly-Pro-Lys的基因序列，而序列號65所示的引物含有將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分的C末端3個氨基酸殘基序列Arg-Ala-Pro轉(zhuǎn)換為Gly-Pro-Arg的基因序列。序列號66所示的引物含有將前體結(jié)構(gòu)部分的C末端5個氨基酸殘基序列Ser-Phe-Arg-Ala—Pro僅轉(zhuǎn)換為Lys的基因序列，而序列號67所示的引物具有將Ser-Phe-Arg-Ala-Pro僅轉(zhuǎn)換為Arg的基因序列。
為了構(gòu)建與成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合基因，還都舍有編碼成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端一側(cè)的氨基酸序列的序列。(序列號14) 5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號64) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTG GGG CCG AAC GAC GGG C-3’(序列號65) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGG GGG CCG AAC GAC GGG C-3’(序列號66) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’(序列號67) 5’-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGC GGG CCG GCG CTC GAA G-3’<序列表說明>序列號64～67PCR引物接下來，將分別擴(kuò)增的含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和編碼含有產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列以及變異型前體結(jié)構(gòu)部分的區(qū)域的基因區(qū)域的PCR反應(yīng)液各1μl，與已擴(kuò)增的編碼成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的區(qū)域的PCR反應(yīng)液1μl混合作為模板，使用序列號14和序列號9進(jìn)行交叉PCR，使含有谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PS2基因的啟動子區(qū)的5’-上游區(qū)和產(chǎn)氨棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白S1pA的信號序列以及變異型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分相連的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因片段擴(kuò)增。(序列號14)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’(序列號9) 5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約1.8kb的0000擴(kuò)增片段。從瓊脂糖凝膠中回收用ScaI和EcoO65I消化該片段后生成的約800bp的片段，通過與從實(shí)施例4(2)構(gòu)建的pPKSPTG1用ScaI和EcoO65I切出的片段替換來構(gòu)建pPKSPTG11(Gly-Pro-Lys變異型)和pPKSPTG12(Gly-Pro-Arg變異型)，pPKSPTG13(缺失Phe-Arg-Ala-Pro，Lys插入變異型)和pPKSPTG14(缺失Phe-Arg-Ala-Pro，Arg插入變異型)。(2)前體結(jié)構(gòu)部分變異型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌用構(gòu)建的質(zhì)粒pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下分別培養(yǎng)48小時。取培養(yǎng)結(jié)束后的上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。結(jié)果可以確認(rèn)帶有前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。(3)利用在谷氨酸棒桿菌ATCC13869中分泌表達(dá)的絲氨酸蛋白酶切去帶有變異型前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分用實(shí)施例8(1)構(gòu)建的質(zhì)粒pVSS1轉(zhuǎn)化攜有實(shí)施例11(2)所述的帶有改造的前體結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869，篩選在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述CM2S瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌株。然后將篩選出的攜有pVSS1和pPKSPTG11、pPKSPTG12、pPKSPTG13或pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869用含有5mg/ml的氯霉素和25mg/l的卡那霉素的上述MMTG液體培養(yǎng)基于30℃下分別培養(yǎng)70小時。取培養(yǎng)結(jié)束后的上清液10μl進(jìn)行SDS-PAGE，然后用上述的抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體，按照常規(guī)方法進(jìn)行Western blot解析。結(jié)果表明SAMP45正常分泌表達(dá)，而且分泌的帶有變異型前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的變異型前體結(jié)構(gòu)部分被切去，能夠確認(rèn)與天然的成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有大致相同分子量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分泌。
另外，在SDS-PAGE后，按照常規(guī)方法經(jīng)半干轉(zhuǎn)移將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。蛋白轉(zhuǎn)移后，用考馬斯亮藍(lán)對膜進(jìn)行染色、脫色、風(fēng)干。將成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的部分切下來，使用蛋白質(zhì)序列儀解析N末端氨基酸序列。解析結(jié)果可以確認(rèn)攜有pVSS1和pPKSPTG11、或者pVSS1和pPKSPTG12的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分泌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列是與序列號5所示的天然型成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶一樣的，N末端為Asp的序列。另外攜有pVSS1和pPKSPTG13、或者pVSS1和pPKSPTG14的谷氨酸棒桿菌ATCC13869分泌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶序列是在天然型成熟轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶附加了Ser-Ala-Gly-Pro-Lys(序列號69)，或者Ser-Ala-Gly-Pro-Arg(序列號70)的序列。
前者具有與天然型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶一樣氨基酸序列的培養(yǎng)上清用氧肟酸酯法確認(rèn)有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，而且具有大致與天然型一樣的比活性(約20U/mg)。<序列表說明>序列號69、70附加在天然的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列利用本發(fā)明可以通過棒桿菌屬細(xì)菌使有用的外源蛋白、特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶大量生成，并有效地分泌到菌體外。由于通過本發(fā)明生成的蛋白質(zhì)可釋放到培養(yǎng)基中，所以利用已知的適當(dāng)?shù)姆椒梢院啽愣掖笠?guī)模地從培養(yǎng)基中直接回收蛋白質(zhì)。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法<130>Y1H0862<140><141><150>JP 11-280098<151>1999-09-30<150>JP 2000-194043<151>2000-06-28<160>70<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<400>1Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala20 25 30<210>2<211>25<212>PRT<213>產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)<400>2Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala1 5 10 15Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala
20 25<210>3<211>45<212>PRT<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<400>3Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg1 5 10 15Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala20 25 30Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro35 40 45<210>4<211>54<212>PRT<213>肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<400>4Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr1 5 10 15Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr20 25 30Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser35 40 45Ala Pro Ser Arg Ala Pro50<210>5<211>331<212>PRT<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<400>5Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met1 5 10 15Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn20 25 30Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg35 40 45Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys50 55 60Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu65 70 75 80Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn85 90 95Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val100 105 110Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu115 120 125Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser130 135 140Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala145 150 155 160Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn165 170 175Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg180 185 190Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg195 200 205Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg210 215 220Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile225 230 235 240Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr245 250 255Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp260 265 270Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met275 280 285His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp290 295 300Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn305 310 315 320Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro325 330<210>6<211>782<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(579)..(782)<400>6aaattcctgt gaattagctg atttagtact tttcggaggt gtctattctt accaaatcgt 60caagttgtgg gtagagtcac ctgaatatta attgcaccgc acgggtgata tatgcttatt 120tgctcaagta gttcgaggtt aagtgtattt taggtgaaca aatttcagct tcgggtagaa 180gactttcgat gcgcttcaga gcttctattg ggaaatctga caccacttga ttaaatagcc 240tacccccgaa ttgggggatt ggtcattttt tgctgtgaag gtagttttga tgcatatgac 300ctgcgtttat aaagaaatgt aaacgtgatc agatcgatat aaaagaaaca gtttgtactc 360aggtttgaag cattttctcc gattcgcctg gcaaaaatct caattgtcgc ttacagtttt 420tctcaacgac aggctgctaa gctgctagtt cggtggccta gtgagtggcg tttacttgga 480taaaagtaat cccatgtcgt gatcagccat tttgggttgt ttccatagca atccaaaggt 540ttcgtctttc gatacctatt caaggagcct tcgcctct atg ttt aac aac cgt atc 596Met Phe Asn Asn Arg Ile1 5cgc act gca gct ctc gct ggt gca atc gca atc tcc acc gca gct tcc 644Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala Ile Ser Thr Ala Ala Ser10 15 20ggc gta gct atc cca gca ttc gct cag gag acc aac cca acc ttc aac 692Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn25 30 35atc aac aac ggc ttc aac gat gct gat gga tcc acc atc cag cca gtt 740Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ile Gln Pro Val40 45 50gag cca gtt aac cac acc gag gaa acc ctc cgc gac ctg act 782Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu Arg Asp Leu Thr55 60 65<210>7<211>68<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<400>7Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala1 5 10 15Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu20 25 30Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly35 40 45Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu50 55 60Arg Asp Leu Thr65<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>8gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc 30<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>9cgctcacatc acggccagcc ctgctttacc 30<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>10gtgaccctgt cgtcggagtc20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>11ggcatcctgt cgagcggctc 20<210>12<211>1809<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<220><221>CDS<222>(578)..(1798)<400>12gtcgacgcgg gccgggaggg ggtgcggcgg cgcccttcgg ctgtgtggac gaagcgtcgg 60gtcggagggg cggccggata tcgtccttgg ggcggggtgg ccggaattgc cgccatggtg 120ttgccgggga atcgacccga agacatgatc acttctcgta tccacccgat cacgtatccg 180ggagtcgaga agtgttacgc cgtgcccctg tccgcgtcct cacccctgtc gccgtgacag 240cgacccgcgt tcttccactc gcacggacgg ccccacagga cctttcggcc cgggctcgcc 300ccgccgcctc ggtgacggcc tccgaataac gcggccgccg gggcctcggc cggttgaccg 360atccgggtca cgcgccccgc cgggcgggcg gccacgtccg gtctcgcccc gcccgacatc 420ggctgcgact gccttcgctc gcacttcttc ccgcctcccg gccgcgtttt tccgccgccg 480aaggtgcggc gacgcgtacc gaatccccct tcatcgcgac gtgcttccgc acggccgcgt 540tcaacgatgt tccacgacaa aggagttgca ggtttcc atg cgc ata cgc cgg aga 595Met Arg Ile Arg Arg Arg1 5gct ctc gtc ttc gcc act atg agt gcg gtg tta tgc acc gcc gga ttc 643Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val Leu Cys Thr Ala Gly Phe10 15 20atg ccg tcg gcc ggc gag gcc gcc gcc gac aat ggc gcg ggg gaa gag 691Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu25 30 35acg aag tcc tac gcc gaa acc tac cgc ctc acg gcg gat gac gtc gcg 739Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala40 45 50aac atc aac gcg ctc aac gaa agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggc 787Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly55 60 65 70ccg tcg ttc cgg gcc ccc gac tcc gac gac agg gtc acc cct ccc gcc 835Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala75 80 85gag ccg ctc gac agg atg ccc gac ccg tac cgt ccc tcg tac ggc agg 883Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg90 95 100gcc gag acg gtc gtc aac aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac 931Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr105 110 115agc cac cgc gac ggc agg aag cag cag atg acc gag gag cag cgg gag 979Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu120 125 130tgg ctg tcc tac ggc tgc gtc ggt gtc acc tgg gtc aat tcg ggt cag 1027Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln135 140 145 150tac ccg acg aac aga ctg gcc ttc gcg tcc ttc gac gag gac agg ttc 1075Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe155 160 165aag aac gag ctg aag aac ggc agg ccc cgg tcc ggc gag acg cgg gcg 1123Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala170 175 180gag ttc gag ggc cgc gtc gcg aag gag agc ttc gac gag gag aag ggc 1171Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Sar Phe Asp Glu Glu Lys Gly185 190 195ttc cag cgg gcg cgt gag gtg gcg tcc gtc atg aac agg gcc ctg gag 1219Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu200 205 210aac gcc cac gac gag agc gct tac ctc gac aac ctc aag aag gaa ctg 1267Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu215 220 225 230gcg aac ggc aac gac gcc ctg cgc aac gag gac gcc cgt tcc ccg ttc 1315Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe235 240 245tac tcg gcg ctg cgg aac acg ccg tcc ttc aag gag cgg aac gga ggc 1363Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly250 255 260aat cac gac ccg tcc agg atg aag gcc gtc atc tac tcg aag cac ttc 1411Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe265 270 275tgg agc ggc cag gac cgg tcg agt tcg gcc gac aag agg aag tac ggc 1459Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly280 285 290gac ccg gac gcc ttc cgc ccc gcc ccg ggc acc ggc ctg gtc gac atg 1507Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met295 300 305 310tcg agg gac agg aac att ccg cgc agc ccc acc agc ccc ggt gag gga 1555Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly315 320 325ttc gtc aat ttc gac tac ggc tgg ttc ggc gcc cag acg gaa gcg gac 1603Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp330 335 340gcc gac aag acc gtc tgg acc cac gga aat cac tat cac gcg ccc aat 1651Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn345 350 355ggc agc ctg ggt gcc atg cat gtc tac gag agc aag ttc cgc aac tgg1699Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp360 365 370tcc gag ggt tac tcg gac ttc gac cgc gga gcc tat gtg atc acc ttc1747Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe375 380 385 390atc ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc gac aag gta aag cag ggc tgg1795Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp395 400 405ccg tgatgtgagc g 1809Pro<210>13<211>407<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<223>人工序列的描述PGR引物<400>13Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val1 5 10 15Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp20 25 30Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu35 40 45Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro50 55 60Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp65 70 75 80Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr85 90 95Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg100 105 110Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met115 120 125Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr130 135 140Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser145 150 155 160Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg165 170 175Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser180 185 190Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val195 200 205Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp210 215 220Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu225 230 235 240Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe245 250 255Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val260 265 270Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala275 280 285Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly290 295 300Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro305 310 315 320Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly325 330 335Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn340 345 350His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu355 360 365Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly370 375 380Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp385 390 395 400Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro405<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>14aaattcctgt gaattagctg atttag26<210>15<211>44<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>15gagctctccg gcgtatgcgc atagaggcga aggctccttg aata 44<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial 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Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>52cggccgtgct gttctccccg tttgccgttg ccacaggtgc ggcc 44<210>53<211>20<212>PRT<213>茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)<400>53Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe1 5 10 15Val Glu Glu Lys20<210>54<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述svPEP的探針<400>54aagatccccg ggatgaagtt cgtcgaggag aag 33<210>55<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>55gaggcggcgt cgatcaccgc ccc23<210>56<211>32<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>56gccaagcttg aagcaccggc ggcggcaccc gg 32<210>57<211>46<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>57ggggcggtga tcgacgccgc ctctgccgtt gccacaggtg cggcca46<210>58<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>58gtgaccctgt cgtcggagtc ccggaacgac gggccggcgc 40<210>59<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述PGR引物<400>59gtgaccctgt cgtcggagtc cgacgggccg gcgctcgaag 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1.一種外源分泌型蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，對攜有在棒桿菌中發(fā)揮功能的啟動子的下游連接編碼源自棒桿菌的信號肽區(qū)的核酸序列、再在編碼上述信號肽區(qū)的核酸序列的下游連接編碼含有前體結(jié)構(gòu)部分的外源分泌型蛋白質(zhì)的核酸序列的表達(dá)基因重組體的棒桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，使上述外源分泌型蛋白質(zhì)在上述棒桿菌中生成并分泌、然后從上述外源分泌型蛋白質(zhì)中切除前體結(jié)構(gòu)部分。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，外源分泌型蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，信號肽是源自棒桿菌的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，信號肽是源自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中，信號肽具有序列號1或29所示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，信號肽是源自產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號肽。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，信號肽具有序列號2所示的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法，其中，前體結(jié)構(gòu)部分相當(dāng)于源自放線菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的前體結(jié)構(gòu)部分。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，前體結(jié)構(gòu)部分具有序列號3或4所示的序列。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其中，前體結(jié)構(gòu)部分包括序列號3或4所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸發(fā)生置換、或缺失、或插入、或添加、或它們的組合。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，前體結(jié)構(gòu)部分的氨基酸序列為序列號30～38所示的氨基酸序列中任意一種。
12.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，前體結(jié)構(gòu)部分的切除是通過蛋白酶實(shí)施的。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，生成和分泌外源分泌型蛋白質(zhì)的棒桿菌還生成蛋白酶。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中，前體結(jié)構(gòu)部分的切除是通過蛋白酶和肽酶實(shí)施的。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，生成和分泌外源分泌型蛋白質(zhì)的棒桿菌還生成蛋白酶和肽酶。
16.權(quán)利要求12或14所述的方法，其中，蛋白酶源自放線菌。
17.權(quán)利要求12或14所述的方法，其中，蛋白酶源自白灰淺鏈霉菌(Streptomyces albogriseolus)。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中，肽酶源自放線菌。
19.權(quán)利要求14所述的方法，其中，肽酶源自茂原鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)。
20.權(quán)利要求2～11任一項(xiàng)所述的方法，其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是源自放線菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是源自茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有序列號5所示的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是源自肉桂鏈輪絲菌(Streptoverticillium cinnamoneum)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有序列號43所示的氨基酸序列。
25.一種分泌生產(chǎn)成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，在棒桿菌中生成和分泌在源自棒桿菌的信號肽的下游連接成熟型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的融合蛋白。
26.具有以下性質(zhì)的脯氨酸特異性肽酶，(1)可作用于以下含脯氨酸的肽中的至少一個肽，并可在脯氨酸的羧基側(cè)切斷該肽、Ala-Ala-Pro-pNA、Ala-Phe-Pro-pNA、Phe-Arg-Ala-Pro-pNA(式中，pNA表示對硝基酰替苯胺)(2)最適pH為6.0～6.5、(3)pH4～9時穩(wěn)定、(4)最適溫度為25～30℃、(5)20℃以下時穩(wěn)定、(6)活性可被苯基甲基磺酰氟、氨基乙基苯磺酰氟鹽酸鹽抑制、(7)等電點(diǎn)為10.2、(8)分子量大約為50,000。
27.權(quán)利要求26所述的脯氨酸特異性肽酶，它源自放線菌。
28.一種多肽，它含有序列號40所示的氨基酸序列，并具有權(quán)利要求26所述的脯氨酸特異性肽酶活性。
29.一種多肽，它包括序列號40所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸發(fā)生置換、或缺失、或插入、或添加、或它們的組合，并具有權(quán)利要求26所述的脯氨酸特異性肽酶活性。
30.一種核酸分子，它編碼權(quán)利要求28或29所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及在棒桿菌中分泌生產(chǎn)外源蛋白,特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。本發(fā)明提供通過使工業(yè)生產(chǎn)上有用的外源蛋白,特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在棒桿菌中生成,并有效地釋放到菌體外(分泌生產(chǎn))來制備外源蛋白,特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法。使用編碼源自棒桿菌的信號肽區(qū)的序列下游結(jié)合含有前體結(jié)構(gòu)部分的目的外源蛋白質(zhì)基因序列,特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因序列的表達(dá)重組體,將該表達(dá)型基因重組體導(dǎo)入棒桿菌,培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的棒桿菌,釋放到菌體外的蛋白質(zhì)通過用蛋白酶等進(jìn)行處理切去前體結(jié)構(gòu)部分,制備目的外源蛋白質(zhì),特別是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
文檔編號C12N9/52GK1377413SQ00813733
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
發(fā)明者菊池慶實(shí), 伊達(dá)雅代, 梅澤有希子, 橫山敬一, 松井裕 申請人:味之素株式會社