本發(fā)明涉及一種具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌，以及該菌株在果樹及大田作物病害防治中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

小麥、果樹是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，常年受到多種病害的危害，每年因病害造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)。目前農(nóng)藥是防控病蟲害的最有效手段之一，但是因化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用而引起的各種問題也隨之而來，如農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病蟲害抗藥性的產(chǎn)生等，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，禁止和限制大量高毒、高殘留農(nóng)藥的使用，開發(fā)和使用生物源農(nóng)藥已成為保護(hù)環(huán)境和促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要研究課題。

生物防治是指利用生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病蟲害方法。它的實(shí)質(zhì)就是利用生物種間關(guān)系、種內(nèi)關(guān)系，調(diào)節(jié)有害生物種群密度，即生物群防治生物群。與傳統(tǒng)的防治技術(shù)相比，生物防治技術(shù)具有不污染環(huán)境、對(duì)人和其他生物安全、產(chǎn)品無殘留、易于同其他植物保護(hù)措施協(xié)調(diào)配合并能節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，必將在有害生物綜合防治中發(fā)揮著越來越重要的作用。到目前為止，真菌、細(xì)菌、放線菌、酵母菌都可用于生物防治。利用細(xì)菌防治有害微生物是開發(fā)和利用微生物資源的重要研究領(lǐng)域之一，亦是最具有潛力、應(yīng)用前景最為廣闊的有效途徑之一。細(xì)菌防治優(yōu)勢(shì)主要有以下幾點(diǎn)：一是繁殖速度快、培養(yǎng)成本低廉；二是對(duì)病原菌的作用方式較廣，如細(xì)菌素、抗生素、胞外裂解酶、脂肽類等多種形式，三是有些細(xì)菌具有防病阻生的雙重作用。

近年來，生物防治迅速發(fā)展，其中假單胞菌在植物病蟲害防治中發(fā)揮了非常重要的作用。主要通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌降解微生物的酶及抗生作用等實(shí)現(xiàn)其生物防治作用。在我國(guó)，綠針假單胞菌主要用于多種蔬菜作物病原真菌、細(xì)菌引起的病害的有效防治，而針對(duì)果樹及大田作物真菌病害的綠針假單胞菌未見報(bào)道。目前，研究者通過大量試驗(yàn)篩選到能夠拮抗多種果樹、病原真菌的綠針假單胞菌株，并初步取得顯著成效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)果樹及大田作物病害的生物防治，尤其是蘋果輪紋病、櫻桃疫病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、葡萄霜霉病、小麥紋枯病，提供了一種具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌及其應(yīng)用，其菌體和發(fā)酵液對(duì)于多種果樹病害及大田作物病害具有較好的防治效果。

一種具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌，分類命名為綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)，株號(hào)為ytbta14，已于2016年3月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱為cctcc，地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為cctccno:m2016099，16srdna序列如序列表所示。

所述的綠針假單胞菌的形態(tài)特征為：菌體為桿狀，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革蘭氏染色陰性，無芽孢，單極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，在kmb培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可形成1.2mm菌落，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊。

所述的綠針假單胞菌的生理生化特征為：能產(chǎn)生熒光色素，能水解精氨酸雙水解酶、脂酶、氧化酶、過氧化氫酶、檸檬酸鹽、明膠，不水解淀粉，也不產(chǎn)生h2s，都不能利用聚β-羥基丁酸鹽作碳源。最適培養(yǎng)溫度為28℃～30℃，最適生長(zhǎng)ph值為7.0～7.5，可產(chǎn)生橙色非熒光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖，不產(chǎn)生膿青素，也不進(jìn)行反硝化作用。

一種具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌由蒲公英根中分離得到，具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌的獲取方法，其特殊之處在于，該方法包括以下步驟：

⑴.用自來水洗凈表面并晾干，分別取其根、莖、葉進(jìn)行表面消毒，加純凈水磨碎，靜置10min；

⑵.取80ul上清液，稀釋涂布na固體培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單菌落，純化后保存，即得內(nèi)生細(xì)菌菌餅；

⑶.將蘋果輪紋病菌、櫻桃疫霉病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、葡萄霜霉病菌、小麥紋枯病菌在專用培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待病原菌長(zhǎng)滿平板后用打孔器在平板邊緣打取菌塊，放于另一個(gè)無菌平板中央；

⑷.在病原菌菌塊的四周沿四個(gè)方向等距離2.5cm處放置相同直徑的內(nèi)生細(xì)菌菌餅，并置于25℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)；

⑸.觀察、記錄，篩選出具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌。

一種具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特殊之處在于，該方法包括以下步驟：

⑴.將綠針假單胞菌菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)2~4天，得到種子液；

⑵.將步驟⑴制備的種子液接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30℃下培養(yǎng)2~3天，得到發(fā)酵液；

⑶.離心提取沉淀，取上清液，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾，獲得具有廣譜抗菌活性的無菌發(fā)酵液。

優(yōu)選地，所述步驟⑵中種子液的接種量為1～2%。

所述具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌制成的菌劑。

所述具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌在蘋果輪紋病、櫻桃疫病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、葡萄霜霉病、小麥紋枯病方面的應(yīng)用。

本發(fā)明具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌，其發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性良好，以20℃、40℃、60℃、80℃、100℃處理30min，121℃高壓滅菌處理20min，抗菌活性除121℃高溫處理后有所下降外，其余溫度下抗菌活性均保留85%以上。

本發(fā)明具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌，其菌體和發(fā)酵液均具有較強(qiáng)的廣譜的果樹真菌病害抗菌活性，且抗菌效果持久、穩(wěn)定，具備從中開發(fā)出新型、高效、廣譜生防殺菌劑的巨大潛力，為微生物應(yīng)用于生物防治的開發(fā)提供了新的途徑。

附圖說明

綠針假單胞菌于2016年3月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱為cctcc)；保藏編號(hào)為cctccno:m2016099。

圖1：綠針假單胞菌ytbta14的菌落形態(tài)圖；

圖2：綠針假單胞菌ytbta14的16srdna系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖3：綠針假單胞菌ytbta14對(duì)蘋果輪紋病菌（a）、櫻桃疫病菌（b）、葡萄炭疽病菌（c）、葡萄白腐病菌（d）的平板拮抗效果圖；

圖4：綠針假單胞菌ytbta14對(duì)小麥紋枯病菌的平板拮抗效果圖；

圖5：綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液菌落生長(zhǎng)速率法拮抗蘋果輪紋病菌效果圖；

圖6：綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液菌落生長(zhǎng)速率法拮抗櫻桃疫病菌效果圖；

圖7：綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液菌落生長(zhǎng)速率法拮抗葡萄炭疽病菌效果圖；

圖8：綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液菌落生長(zhǎng)速率法拮抗葡萄白腐病菌效果圖；

圖9：綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液菌落生長(zhǎng)速率法拮抗小麥紋枯病菌效果圖；

圖10：綠針假單胞菌ytbta14葉盤法拮抗葡萄霜霉病菌效果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的具體實(shí)施方式，用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

綠針假單胞菌ytbta14菌株的獲得

首先，從田間采集健康的蒲公英植株，用自來水洗凈表面并晾干，分別取其根、莖、葉進(jìn)行表面消毒，加10ml純凈水磨碎，靜置10min，取80ul上清液，稀釋涂布在na固體培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落，純化后在斜面培養(yǎng)基上保存。

再次，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗多種果樹及大田作物病害的綠針假單胞菌ytbta14菌株。將蘋果輪紋病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、櫻桃疫霉病菌、小麥紋枯病菌在專用培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待病原菌長(zhǎng)滿平板后用打孔器在平板邊緣打取菌塊，后放于另一個(gè)無菌平板中央，待病原菌長(zhǎng)滿平板后用打孔器在平板邊緣打取菌塊，放于另一個(gè)無菌平板中央，在病原菌菌塊的四周沿四個(gè)方向等距離2.5cm處放置相同直徑的經(jīng)保存的綠針假單胞菌，并置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每天觀察并記錄對(duì)病原菌有拮抗作用的菌株，初篩出具有拮抗作用的菌株，然后再用相同的方法進(jìn)行復(fù)篩，挑選出抑菌帶最寬的菌株，即為最終篩選出的具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌ytbta14菌株。

綠針假單胞菌ytbta14菌株的鑒定與保藏

對(duì)上述篩選出的綠針假單胞菌ytbta14依據(jù)其菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、16srdna序列等均進(jìn)行鑒定。

綠針假單胞菌ytbta14個(gè)體形態(tài)與菌落特征如下：菌體為桿狀，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革蘭氏染色陰性，無芽孢，單極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，在kmb培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可形成1.2mm菌落，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊，如圖1所示。

綠針假單胞菌ytbta14生理生化特征為：能產(chǎn)生熒光色素，能水解精氨酸雙水解酶、脂酶、氧化酶、過氧化氫酶、檸檬酸鹽、明膠，不水解淀粉，也不產(chǎn)生h2s，都不能利用聚β-羥基丁酸鹽作碳源。最適培養(yǎng)溫度為28℃～30℃，最適生長(zhǎng)ph值為7.0～7.5，可產(chǎn)生橙色非熒光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖，不產(chǎn)生膿青素，也不進(jìn)行反硝化作用。

通過16srdna同源性分析：以綠針假單胞菌ytbta14菌株的基因組dna為模板，利用細(xì)菌通用引物27-f/1492-r進(jìn)行16srdna基因的pcr擴(kuò)增。引物序列為：27-f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'，1492-r:5'-ggttaccttgttacgactt-3'。pcr產(chǎn)物為單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。該菌株的16srdna序列見序列表，其序列長(zhǎng)度為1386bp。同時(shí)將該菌株的16srdna序列與genbank數(shù)據(jù)庫收錄的代表菌株的16srdna基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果與綠針假單胞菌菌株的同源性均高達(dá)100%。用軟件分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見附圖2：綠針假單胞菌ytbta14菌株與pseudomonas屬的pseudomonaschlororaphis細(xì)菌處于一個(gè)大的分支內(nèi)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化性狀，同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，可確定篩選出的綠針假單胞菌ytbta14菌株為綠針假單胞菌。

綠針假單胞菌ytbta14菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵條件

⑴.將綠針假單胞菌ytbta14菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)2~4天，得到種子液。

⑵.將步驟⑴制備的種子液以2%接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30℃下培養(yǎng)2~3天，得到發(fā)酵液。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基以250ml三角瓶盛裝100ml液體量，轉(zhuǎn)速150r/min。

⑶.發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速5000r/min下離心10min，取沉淀即為具有抗菌活性的菌體，取上清液，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾，獲得具有廣譜抗菌活性的無菌發(fā)酵液。

其中，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂粉15g，水1000ml，ph7.0-8.0。使用前在121℃溫度，0.1mpa壓力下蒸汽滅菌20分鐘。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-8.0。使用前在121℃溫度，0.1mpa壓力下蒸汽滅菌20分鐘。

綠針假單胞菌ytbta14菌株及發(fā)酵液的廣譜抗菌活性分析

取5個(gè)指示菌（蘋果輪紋病菌、櫻桃疫霉病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、小麥紋枯病菌）直徑約為6mm菌餅放置在土豆固體培養(yǎng)基平板中間，采用十字交叉法在四周接種拮抗菌綠針假單胞菌ytbta14，見附圖3、4。下表為綠針假單胞菌ytbta14對(duì)不同作物病原真菌的抑菌帶的大小。

表1綠針假單胞菌ytbta14對(duì)不同病原真菌的抑菌帶的大小

取本發(fā)明的綠針假單胞菌ytbta14的無菌發(fā)酵液，按照1:50比例加入到已滅菌的土豆固體培養(yǎng)基中，混勻后配制平板，冷卻后向平板中央加入直徑為6mm的指示菌（葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌、蘋果輪紋病菌、櫻桃疫霉病菌、小麥紋枯病菌）菌餅，采用菌落生長(zhǎng)速率法，確定拮抗菌綠針假單胞菌ytbta14對(duì)不同病原真菌的抑菌效果，結(jié)果見附圖5-9。下表為綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液對(duì)不同果樹及大田作物病原真菌的抑制效果：

表2綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液對(duì)不同病原真菌的抑菌效果

取本發(fā)明的綠針假單胞菌ytbta14的無菌發(fā)酵液稀釋50倍后，浸泡健康葡萄葉片2h后晾干，打成直徑10mm的葉碟，背面朝上保濕培養(yǎng)，滴上20μl新鮮的葡萄霜霉病菌孢子懸浮液（鏡檢濃度達(dá)1×10⁶個(gè)/ml），25℃溫度下培養(yǎng)，7天后通過發(fā)病情況計(jì)算抑菌率，病情調(diào)查采用6級(jí)記載法，根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分率劃分病級(jí)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的6%～25%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的26%～50%；7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的51%～75%；9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的75%以上。根據(jù)以下公式計(jì)算病情指數(shù)，通過計(jì)算病情指數(shù)分析不同葡萄品種對(duì)霜霉病的抗感病情況。

確定綠針假單胞菌ytbta14對(duì)葡萄霜霉病菌的抑菌效果，見附圖10。處理后霜霉病發(fā)生病指為33.33，對(duì)照病指為73.33，抑菌率為54.55%。

從附圖3-10可以看出，本發(fā)明的綠針假單胞菌ytbta14對(duì)以上指示病菌均有抵抗或抑制作用。

綠針假單胞菌ytbta14產(chǎn)生的廣譜抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性分析：將綠針假單胞菌ytbta14的無菌發(fā)酵液分別置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃溫度下處理30min，121℃、0.1mpa下高溫高壓處理20min，將上述處理后的無菌發(fā)酵液與pda培養(yǎng)基以體積比為1:50的比例制成平板，再將直徑為6mm的病原菌菌塊接于平板中央，以未處理的發(fā)酵液抑菌率作為對(duì)照。其中，以葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和蘋果輪紋病菌作為指示菌，采用菌落生長(zhǎng)速率法，于28℃溫度下培養(yǎng)3~7d后，測(cè)量菌落直徑。并計(jì)算處理后的綠針假單胞菌ytbta14發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率，作為抑菌性能的衡量指標(biāo)。

試驗(yàn)結(jié)果表明：20℃~100℃下對(duì)葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和蘋果輪紋病菌的抑制作用無明顯變化，說明隨溫度的升高，綠針假單胞菌ytbta14的拮抗物質(zhì)活性幾乎沒有變化，抗菌活性均保留85%以上；在121℃高溫下處理20min對(duì)葡萄炭疽病菌抑制活性明顯下降，對(duì)蘋果輪紋病菌和葡萄白腐病菌抑制活性則略有下降。該試驗(yàn)表明綠針假單胞菌ytbta14的抗菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院

<120>一種具有廣譜抗菌活性的綠針假單胞菌及其應(yīng)用

<160>1

<210>m

<211>1386

<212>dna

<213>綠針假單胞菌（pseudomonaschlororaphis）

<400>m

tgcagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgg50

gtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccggaaa100

cggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgg150

gccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggta200

atggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtc250

acactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggg300

aatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaa350

gaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggtacttac400

ctaatacgtgagtattttgacgttaccgacagaataagcaccggctaact450

ctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaatt500

actgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaatcc550

ccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtatggt600

agagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaa650

ggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggt700

gcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccg750

taaacgatgtcaactagccgttgggagccttgagctcttagtggcgcagc800

taacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactc850

aaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattc900

gaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttcca950

gagatggattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgt1000

cgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaac1050

ccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgc1100

cggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccct1150

tacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgcca1200

agccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgca1250

gtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcag1300

aatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1350

catgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaa1386