本發(fā)明屬于醫(yī)藥合成技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利福霉素-異煙肼雜合藥物及其制備方法。

背景技術(shù)：

利福霉素是1975年由意大利lepetti公司等發(fā)現(xiàn)的，他們從法國土壤中分離的地中海鏈絲菌產(chǎn)生得到利福霉素類抗菌素，分為a,b,c,d,e五種類型，其中主要成分為b，后來又在產(chǎn)生菌種的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了利福霉素o,s,sv。利福霉素類抗生素具有廣譜抗菌作用，對結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌、鏈球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽性細(xì)菌，特別是耐藥性金黃利福霉素類抗生素色葡萄球菌的作用都很強(qiáng)。對某些革蘭氏陰性菌也有效，臨床多與其他抗結(jié)核病藥物合用治療各型結(jié)核病和治療耐藥金黃色葡萄球菌的嚴(yán)重感染，還用于治療麻風(fēng)病。對細(xì)菌的作用主要為抑制細(xì)菌細(xì)胞rna聚合酶，作用于抑制的rna合成，它可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)起殺菌作用，對大型病毒有抑制作用。

美國的羅斯公司和施貴寶公司和西德的拜耳公司的研究人員分別獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了異煙肼有極強(qiáng)的抗結(jié)核菌的活性。異煙肼具有殺菌力強(qiáng)、選擇性高、副作用少的優(yōu)點(diǎn)。它的滅菌特性在于：它可以抑制結(jié)核菌菌壁分枝菌酸成份的合成，從而使結(jié)核桿菌喪失多種能力(耐酸染色，增殖力，疏水性)而死亡，異煙肼還能與結(jié)核菌菌體輔酶結(jié)合，起到干擾脫氧核糖核酸和核糖核酸合成的作用，從而達(dá)到殺滅結(jié)核菌的目的。研究還發(fā)現(xiàn)異煙肼對代謝活力強(qiáng)的結(jié)核菌作用更強(qiáng)。異煙肼單用易產(chǎn)生耐藥性，合理聯(lián)合多種抗結(jié)核藥物治療結(jié)核病，可以提高療效，降低毒性，并可延緩甚至預(yù)防結(jié)核分支桿菌耐藥性的產(chǎn)生。

雜合藥物的研究方式是將兩種藥物的藥效結(jié)構(gòu)單元拼接在一個分子中，或?qū)烧叩乃幮Щ鶊F(tuán)通過共價鍵兼容于一個分子中，使形成的藥物或兼具兩者的性質(zhì)，分子中的兩類化學(xué)結(jié)構(gòu)各自與不同的靶標(biāo)結(jié)合，強(qiáng)化藥理作用，減少各自相應(yīng)的毒副作用，或是兩者取長補(bǔ)短，發(fā)揮各自的藥理活性，協(xié)同完成治療作用。利福霉素-異煙肼雜合藥物可以同時作用于不同的受體，雜合藥物的活性更強(qiáng)，作用位點(diǎn)多，具有專一性，副作用較少，不易產(chǎn)生耐藥性，其開發(fā)前景廣闊。但一般雜合藥物制作方法較困難，后處理較復(fù)雜。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種可用作抗生素的利福霉素-異煙肼雜合藥物。這種雜合物能提高對結(jié)核桿菌的活力抑制并減少或克服它的耐藥性，增強(qiáng)療效。

本發(fā)明的另外一個目的是提供利福霉素-異煙肼雜合藥物的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

提供一種利福霉素-異煙肼雜合藥物，它由以下方法制備得到：將利福霉素鈉酸化后與n,n-二羥甲基叔丁胺發(fā)生環(huán)和反應(yīng)合成噁嗪利福霉素，然后將噁嗪利福霉素與哌嗪和異煙肼發(fā)生縮合反應(yīng)，得到利福霉素-異煙肼雜合藥物。

本發(fā)明還提供上述利福霉素-異煙肼雜合藥物的制備方法，其具體步驟如下：

1)合成噁嗪利福霉素：將利福霉素鈉溶于溶劑中，得到利福霉素鈉溶液，加入濃硫酸對利福霉素鈉進(jìn)行酸化，待溶液變?yōu)樯罴t色后升溫至35-50℃，緩慢滴加n,n-二羥甲基叔丁胺，滴加完畢后繼續(xù)環(huán)合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用冰乙酸水溶液析出沉淀物，將沉淀物過濾、水洗、干燥得到噁嗪利福霉素；

2)合成利福霉素-異煙肼雜合藥物：將步驟1)所得噁嗪利福霉素溶于無水乙醇得到噁嗪利福霉素溶液，然后向所述噁嗪利福霉素溶液中加入哌嗪和異煙肼，升溫至55-60℃進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后后處理得到福霉素-異煙肼雜合藥物。

按上述方案，步驟1)所述溶劑為n,n-二甲基甲酰胺；所述利福霉素鈉溶液濃度為0.02-0.08g/ml。

按上述方案，步驟1)所述濃硫酸濃度為95-98％，其中硫酸與利福霉素鈉摩爾比為1:2-4。

優(yōu)選的是，步驟1)所述n,n-二羥甲基叔丁胺與利福霉素鈉質(zhì)量比為0.2-0.4:1。

按上述方案，步驟2)所述噁嗪利福霉素溶液濃度為0.03-0.08g/ml。

按上述方案，步驟2)所述噁嗪利福霉素與哌嗪和異煙肼的質(zhì)量比為20-30:2-4:1。

本發(fā)明還包括包含上述的利福霉素-異煙肼雜合藥物的藥物組合物。

以及上述利福霉素-異煙肼雜合藥物用于治療結(jié)核病的用途。

本發(fā)明制備利福霉素-異煙肼雜合抗結(jié)核藥物是以利福霉素鈉為原料，合成路線如下：

利福霉素類的母核結(jié)構(gòu)為27個碳的大環(huán)內(nèi)酰胺，環(huán)中含一個萘環(huán)，結(jié)構(gòu)式如下：

萘環(huán)上由一脂肪鏈分別與c-2和c-12位碳相連接，構(gòu)成“安莎橋”結(jié)構(gòu)。由噁嗪利福霉素s-na鹽與n,n-二羥甲基叔丁胺在溶劑二甲基酰胺(dmf)中發(fā)生環(huán)合反應(yīng)生成。作為中間體，噁嗪雜環(huán)要具有足夠的穩(wěn)定性，才能經(jīng)得起環(huán)上的加工，完成環(huán)合反應(yīng)。利福霉素芳香族平面上，c-2和c-3位進(jìn)行環(huán)合為六元環(huán)或五元環(huán)形成相應(yīng)的安莎橋環(huán)稠合利福霉素衍生物。c-4上的羥基是不必要的，c-3及c-4位上基團(tuán)的取代，有的能增強(qiáng)對細(xì)菌的抑制能力，有的能增強(qiáng)對病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用。萘環(huán)上的c-3位單取代和c-3/c-4位環(huán)合為雜環(huán)是利福霉素類化合物主要的修飾方法。c-3/c-4位可環(huán)合為五元或六元雜環(huán)，五元雜環(huán)可為噻唑環(huán)、咪唑環(huán)等，六元雜環(huán)可為吩嗪環(huán)、噁嗪環(huán)、噻嗪環(huán)和吡啶環(huán)等，其中咪唑環(huán)和噁嗪環(huán)衍生物活性較好。c-3,c-4位的同時取代，有望能達(dá)到提高對結(jié)核桿菌的活力抑制并減少或克服它的耐藥性，同時希望對革蘭氏陰性菌有較大的活性及在體內(nèi)有極收好的效果。根據(jù)此發(fā)現(xiàn)，本申請人篩選出了目標(biāo)化合物異煙肼對側(cè)鏈上的r1修飾后得到的雜合藥物。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明實施例制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物體外較穩(wěn)定，不易分解且無生物活性，進(jìn)入人體后通過人體相關(guān)酶的分解作用還原成原來的兩種活性藥物，在人體內(nèi)分別發(fā)揮各自的藥理作用，可改善藥物的藥學(xué)和藥物動力學(xué)性質(zhì)；同時雜合藥物本身具有較強(qiáng)的生物活性，具有與利福平相當(dāng)?shù)臍⒕Ч?，在人體內(nèi)不分解，整個分子進(jìn)行多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)。利福霉素-異煙肼雜合藥物可以同時作用于不同的受體，雜合藥物的活性更強(qiáng)，作用位點(diǎn)多，具有專一性，副作用較少，能提高對結(jié)核桿菌的活力抑制并減少或克服它的耐藥性，增強(qiáng)療效，其開發(fā)前景廣闊。

具體實施方式

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實施例1

合成噁嗪利福霉素：在100ml三口瓶中裝入利福霉素鈉1.00g(0.0014mol),加入20mln,n-二甲基甲酰胺將其溶解，放入攪拌用的磁子，常溫下攪拌30分鐘，待充分溶解后，加入0.072g濃硫酸(95％)(0.0007mol)酸化，常溫下攪拌30分鐘，反應(yīng)液由深藍(lán)色變成深紅色，然后升溫至35-50℃，緩緩滴加n,n-二羥甲基叔丁胺0.352g(0.0026mol)，滴畢后，反應(yīng)液由深紅色變?yōu)樯钏{(lán)色，繼續(xù)保溫反應(yīng)2小時(用薄層層析硅膠板跟蹤反應(yīng))，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，向反應(yīng)液中加入滴加了2滴冰乙酸的水溶液200ml，間歇攪拌，有大量藍(lán)色沉淀析出，靜置過夜，過濾，適量水洗，干燥后即可得到藍(lán)色固體物質(zhì)1.03g(0.0013mol)，即噁嗪利福霉素；

合成利福霉素-異煙肼雜合藥物：將步驟1)所得噁嗪利福霉素用20ml無水乙醇溶解，得到噁嗪利福霉素溶液，在100ml三口瓶中裝入噁嗪利福霉素溶液和0.13g(0.0015mol)哌嗪與0.039g異煙肼，升溫至55-60℃，反應(yīng)液由深藍(lán)色變?yōu)榧t棕色，保溫反應(yīng)3小時，反應(yīng)結(jié)束后(用薄層層析硅膠板跟蹤反應(yīng))，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于45℃下將溶劑乙醇旋干，得到磚紅色固體物質(zhì)，即利福霉素-異煙肼雜合藥物。

將本實施例制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物在室溫、干燥避光條件下放置一個月，用紅外進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，說明其穩(wěn)定性良好。

實施例2

測試實施例1所得利福霉素-異煙肼雜合藥物的性能：

活性測試

為了初步測定利福霉素-異煙肼雜合藥物是否具有抑菌活性，隨機(jī)選擇了7株臨床分離株標(biāo)本及1株hr37v標(biāo)準(zhǔn)株，通過mic藥敏試驗來進(jìn)行初步的測試，若具有抗菌活性則進(jìn)行進(jìn)一步的活性測試研究。

藥敏試驗的細(xì)菌：隨機(jī)抽出8株臨床分離株標(biāo)本：13041820敏感株(s)，13040832耐藥r(r)，13040902耐藥hr(dr)，13041817耐藥hrs(mdr)，13040946耐藥hrs(mdr)，13042311耐藥hresofx(xdr)，13062939全耐藥hreskmpaspto(ntm)，13070223全耐藥hreskmpaspto(ntm)及hr37v標(biāo)準(zhǔn)株。

培養(yǎng)條件:在無菌96孔板中每孔加7h9培養(yǎng)基100μl，在玻璃磨菌器底部加入2滴10％tween-80生理鹽水及臨床分離的2～3周菌齡的新鮮培養(yǎng)物，研磨至呈乳酪樣，用生理鹽水稀釋成1號麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫?1mg/ml)，用7h9培養(yǎng)基1:20倍稀釋后1～12孔每孔接種100μl菌液，用無菌膜封板，放入濕盒內(nèi)，置于37℃溫箱中培養(yǎng)5d，第6天加入過濾除菌0.1g/l刃天青顯色液30μl，繼續(xù)溫育24h后觀察結(jié)果。

儀器設(shè)備：電子天平(精度0.1mg)，容量瓶，移液管，玻璃燒杯，電熱恒溫培養(yǎng)箱(dnp-9082bs-ⅲ)，無菌96孔版，20-200排槍及一次性無菌耗材等。

試驗藥劑：95％高效液相色譜純的實施例1制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物和購買的含量98％的利福平(鄭州民眾制藥廠，含量>98％)。

對照藥劑：用不含抗結(jié)核藥原液的7h9培養(yǎng)基作空白對照。

其他試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純級的dmso，10％tween-80生理鹽水，無菌去離子水。

劑量設(shè)置：分別稱取利福霉素-異煙肼雜合藥物和利福平原藥50mg，用dmso溶解后，在50ml的容量瓶用dmso定容，配成1mg/ml濃度的藥液。

試驗方法：

把利福霉素-異煙肼雜合藥物和利福平原藥配好的1mg/ml濃度的藥液，滅菌后，用無菌膜密封起來備用。

顯色法mic測定：

(1)在無菌96孔板(1～12孔)中每孔加7h9培養(yǎng)基100μl，第1孔加適當(dāng)稀釋的抗結(jié)核藥原液100μl，對倍連續(xù)稀釋至第12孔。各孔藥物最終濃度:利福平128～0.06μg/ml，利福霉素-異煙肼雜合藥物128～0.06μg/ml。

(2)在玻璃磨菌器底部加入2滴10％tween-80生理鹽水及臨床分離的2～3周菌齡的新鮮培養(yǎng)物，研磨至呈乳酪樣，用生理鹽水稀釋成1號麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫?1mg/ml)，用7h9培養(yǎng)基1:20倍稀釋后1～8孔每孔接種100μl?？瞻卓诪榕囵B(yǎng)基對照。

(3)用無菌膜封板，放入濕盒內(nèi)，37℃培養(yǎng)5d，第6天加入過濾除菌0.1g/l刃天青顯色液30μl至第12孔，繼續(xù)溫育24h，如空白孔(未加藥物)變成粉紅色，則加同量刃天青顯色液至其他各孔，24h后記錄顏色變化。如空白孔仍為藍(lán)色，分別在第7、9天觀察。顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵搭A(yù)示細(xì)菌生長。

試驗結(jié)果分析：

以不加抗結(jié)核藥原液的培養(yǎng)基為對照組，隨著時間推移，觀察培養(yǎng)基的顯色情況，培養(yǎng)基的顯色情況反映了不同種結(jié)核桿菌的生長情況，進(jìn)一步說明了藥物對結(jié)核桿菌的抑菌活性。

上述實驗經(jīng)10天培養(yǎng)后觀察出現(xiàn)如下表1所示的結(jié)果：

表1

表格中共選擇了8個菌株作為樣本。從a～k作128～0.06μg/ml12個濃度對倍稀釋，1為利福霉素-異煙肼雜合藥物64μg/ml，2為利福平64μg/ml，r為耐藥，s為敏感，l空白對照為7h9培養(yǎng)基。

由表1中數(shù)據(jù)顯示，對于本次實驗選取的七種臨床菌株和一種標(biāo)準(zhǔn)菌株，實施例1制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物取得了與利福平相當(dāng)?shù)臍⒕Ч?。并且其具備雜合藥物的優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)多靶點(diǎn)給藥，可以同時作用于不同的受體、或作用于一個受體的不同結(jié)合位點(diǎn)、或作用于兩個不同的酶、一個酶和一個受體等?？傊s合藥物活性更強(qiáng)，作用位點(diǎn)多，具有專一性，副作用較少，不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。