本發(fā)明涉及一種菌核曲霉及其制備青霉酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青霉酸主要是曲霉菌(a.sclerotiorum,a.ostianus,a.terreus,a.ochraceus)和青霉菌(p.melinii,p.brasilianum,p.puberulum,p.cyclopium)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性。
青霉酸對(duì)多株腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞(mda-mb-435)和人肝腹水腺癌細(xì)胞(hct-8)的ic50分別為4.43和8.76μg/ml(chem.&biodiv.2012,9(10),2203-2209)；對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(nci-h460)、人乳腺癌(mcf-7)、人神經(jīng)癌細(xì)胞(sf-268)、胰腺癌(miapaca-2)和人胚肺細(xì)胞(wi-38)的ic50分別為5.80、12.80、20.00、8.00和57.50μm(j.nat.prod.2004,67,1985-1991)；對(duì)小鼠骨肉瘤細(xì)胞株(pos1)的ic50為7.8μm(j.nat.prod.2013,76,297-301)；對(duì)人胃癌細(xì)胞(mkn45)、結(jié)腸癌細(xì)胞(lovo)、人肺腺癌細(xì)胞系(a549)、人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞(mda-mb-435)、人肝癌細(xì)胞(hepg2)和人急性早幼粒白血病細(xì)胞(hl-60)的ic50分別為2.85、2.21、7.46、6.28、3.67和0.80μg/ml(appl.microbiol.biotechnol.2013,97(17),7617-7625)。
青霉酸還具有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophilia)、鰻弧菌(vibrioanguillarum)和哈氏弧菌(vibrioharveyi)的最小抑菌濃度(mic)分別為：1.0、32和0.5mg/ml(phytochem.lett.2015,12,232-236)；對(duì)金黃色釀膿葡萄球菌(staphylococcusaureus)和大腸桿菌(escherichiacoli)的最小抑菌濃度均為128g/ml(phytochem.2017,137,165-173)。
青霉酸具有抗瘧疾的活性，其ic50為16.8μm(phytochem.2017,137,165-173)。青霉酸具有很強(qiáng)的除草(japanpatent08-053310，1996)和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的活性(phytochem.2005,66,1012-1016)。
申請(qǐng)人在研究菌核曲霉(a.sclerotiorum)jh42的液態(tài)搖床發(fā)酵產(chǎn)物的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該菌可以大量產(chǎn)生青霉酸，可規(guī)?；a(chǎn)，對(duì)青霉酸在醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)、研究和應(yīng)用具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)青霉酸的菌核曲霉，及其制備青霉酸的方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種菌核曲霉，分類命名為(aspergillussclerotiorum)，株號(hào)為jh42，已于2017年01月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號(hào)為cgmccno.13562，18srrna序列如序列表所述。
菌核曲霉是從山東省沾化縣套爾河?xùn)|沙子島附近鹽堿地土壤樣品中分離、純化獲取得到，其獲取方法包括以下具體步驟：
⑴.將鹽堿地土壤樣品與無(wú)菌陳海水按照質(zhì)量比1:5混合，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
⑵.取0.5ml上述混合物均勻涂布在pda培養(yǎng)基中，后放于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后根據(jù)菌株的形態(tài)特征進(jìn)行挑選，即得菌核曲霉菌株，并命名為jh42。
菌核曲霉制備青霉酸的方法，菌核曲霉jh42經(jīng)發(fā)酵得到含有青霉酸的發(fā)酵物，發(fā)酵物經(jīng)提取純化得到青霉酸。
菌核曲霉制備青霉酸的方法，包括如下具體步驟：
⑴.將菌核曲霉jh42種到pda培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到種子；
⑵.將步驟⑴制備的種子接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，得到發(fā)酵物；
⑶.發(fā)酵物經(jīng)分離得到發(fā)酵液和菌絲體，將發(fā)酵液經(jīng)萃取劑萃取，菌絲體用浸提劑浸提，后減壓濃縮至不含浸提劑，再用萃取劑萃??；
⑷.發(fā)酵液萃取液和菌絲體萃取液合并，減壓濃縮操作得浸膏；
⑸.將步驟⑷所得浸膏進(jìn)行重結(jié)晶，得到青霉酸晶體和母液；
⑹.將步驟⑸所得母液進(jìn)行硅膠柱層析分離，先用體積比為1:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，再用體積比為2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，并收集最終的洗脫液；
⑺.將步驟⑹中所得洗脫液進(jìn)行重結(jié)晶，得到青霉酸。
制備青霉酸過(guò)程中，所述pda培養(yǎng)基的配制方法為：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分鐘，紗布過(guò)濾得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖和18g瓊脂，并用海水定容至1l，在121℃高溫高壓下蒸汽滅菌30min。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為：50-1000g去皮土豆切丁后用海水煮20分鐘，紗布過(guò)濾得浸汁，于浸汁中添加1-100g葡萄糖、1-100g麥芽糖、1-100g甘露醇、0.1-30g酵母膏、0.1-1g七水硫酸鎂、0.1-2g磷酸二氫鉀；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為自然ph值。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法為：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分鐘，紗布過(guò)濾得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖、20g麥芽糖、10g甘露醇、3g酵母膏、0.3g七水硫酸鎂、0.5g磷酸二氫鉀，并用海水定容至1l，在121℃高溫高壓下蒸汽滅菌30min。
所述步驟⑵中發(fā)酵培養(yǎng)條件為在20-28℃、100-170rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間為5-15天。
較好的，所述步驟⑵中發(fā)酵培養(yǎng)條件為在28℃、170rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間為9天。
所述萃取劑為氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯或正丁醇中的至少一種；浸提劑為丙酮、甲醇或乙醇中至少一種；重結(jié)晶溶劑為丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的至少一種。
菌核曲霉制備的青霉酸，其為無(wú)色塊狀晶體，分子式為c8h10o4，化學(xué)式為：
該菌核曲霉制備青霉酸的方法，產(chǎn)率高達(dá)1.7g/l，且得到的青霉酸純度可達(dá)99％。該制備方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、省時(shí)省力，便于規(guī)模化生產(chǎn)，對(duì)青霉酸在醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)、研究和應(yīng)用具有重要意義。
菌核曲霉于2017年01月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc)，保藏編號(hào)為cgmccno.13562。
具體實(shí)施方式
以下給出本發(fā)明的具體實(shí)施方式，用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
菌核曲霉jh42菌株的獲取
本發(fā)明的菌核曲霉jh42是從山東省沾化縣套爾河?xùn)|沙子島附近鹽堿地土壤樣品中分離、純化得到。
其分離純化方法為：將20g土壤樣品用100ml無(wú)菌陳海水稀釋，充分混合后，取0.5ml混合液均勻涂布在pda培養(yǎng)基中，后放于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后根據(jù)菌株形態(tài)特征進(jìn)行挑選，即得菌核曲霉菌株，并命名為jh42。
所述pda培養(yǎng)基的配制方法為：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分鐘，紗布過(guò)濾得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖、18g瓊脂和0.2g鏈霉素，并用海水定容至1l，在121℃高溫高壓下蒸汽滅菌30min。
菌核曲霉jh42菌株的鑒定
將上述挑選出的菌核曲霉jh42菌株接種到pda培養(yǎng)基上，28℃條件下黑暗培養(yǎng)7d。
菌落特征如下：菌落直徑43mm，質(zhì)地絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)稀少，主要集中在菌落中央，淡黃色；菌落反面淡黃色。
根據(jù)常規(guī)方法提取菌核曲霉jh42菌株的dna，并利用真菌的its區(qū)的通用引物擴(kuò)增其its區(qū)，將其its區(qū)的堿基序列提交genebank，其genbank基因登錄號(hào)為：hq717801，通過(guò)在genbank中進(jìn)行blast檢索，確定該菌株為菌核曲霉jh42。其18srrna序列如序列表所述。
青霉酸的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
⑴.將菌核曲霉jh42種到pda培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到種子；
⑵.將步驟⑴制備的種子接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物；
⑶.發(fā)酵物經(jīng)分離得到發(fā)酵液和菌絲體，將發(fā)酵液經(jīng)萃取劑萃取，菌絲體用浸提劑浸提，后減壓濃縮至不含浸提劑，再用萃取劑萃?。?/p>
⑷.發(fā)酵液萃取液和菌絲體萃取液合并，減壓濃縮操作得浸膏；
⑸.將步驟⑷所得浸膏進(jìn)行重結(jié)晶，得到青霉酸晶體和母液；
⑹.將步驟⑸所得母液進(jìn)行硅膠柱層析分離，先用體積比為1:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，再用體積比為2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脫劑進(jìn)行洗脫；
⑺.將步驟⑹中所得洗脫液進(jìn)行重結(jié)晶，得到青霉酸。
生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取菌核曲霉jh42適量，接種到pda平板培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到種子。
所述pda培養(yǎng)基的配制方法為：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分鐘，紗布過(guò)濾得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖和18g瓊脂，并用陳海水定容至1l，在121℃高溫高壓下蒸汽滅菌30min。
將制備的種子接種到裝有180ml培養(yǎng)液的500ml錐型瓶中，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速為170rpm,搖床培養(yǎng)9天，得到發(fā)酵物34.5l。其中，培養(yǎng)液組成為：200g去皮土豆浸汁、20g葡萄糖、20g麥芽糖、10g甘露醇、3g酵母膏、0.3g七水硫酸鎂、0.5g磷酸二氫鉀，用陳海水定容至1l，培養(yǎng)基的ph值自然。
用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離，將菌絲體用甲醇浸提三次，減壓濃縮至不含甲醇，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次；發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮后得浸膏73g。
浸膏經(jīng)丙酮重結(jié)晶得到青霉酸晶體18g，去除部分青霉酸晶體后的溶液即為母液。母液經(jīng)硅膠(200-300目)柱層析分離，先用體積比為1:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，再用體積比為2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集體積比為2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作為流動(dòng)相洗脫下來(lái)的溶液，收集的洗脫液中含大量青霉酸，經(jīng)丙酮重結(jié)晶，得到青霉酸41g。
上述所得青霉酸驗(yàn)證分析如下：
青霉酸為無(wú)色塊狀晶體，mp81-82℃；uv(meoh)λmax(logε):224(4.02)；ir(atr)νmax3255,1739,1727,1634,1446,1345,1275,1220,1183,1166,1059,1043,1012,997,953,900,802,781,747,692cm-1；hresimsm/z169.0496[m-h]-(calcdforc8h9o4,169.0501),分子式c8h10o4。
1h及13cnmr數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。
綜上所述，本發(fā)明菌核曲霉jh42可大量生產(chǎn)青霉酸。所用培養(yǎng)基原料易得，成本低廉，發(fā)酵周期短。
本發(fā)明菌核曲霉jh42制備青霉酸的產(chǎn)率高，發(fā)酵液提取物(即：浸膏)可達(dá)2.1g/l發(fā)酵液，經(jīng)簡(jiǎn)單的硅膠柱層析分離，再進(jìn)行重結(jié)晶操作即可獲得純度達(dá)99％的青霉酸，分離純化后得到的青霉酸相當(dāng)于1.7g/l，產(chǎn)率達(dá)81％。
本發(fā)明菌核曲霉jh42制備青霉酸的方法利于工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)青霉酸在醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)研究具有重大意義。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>濱州醫(yī)學(xué)院
<120>一種菌核曲霉及其制備青霉酸的方法
<160>1
<210>1
<211>956
<212>rna
<213>菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)
<400>1
ggcaacattgagtgaggtactcggggccaacctcccacccgtgtataccgtaccttgttg60
cttcggcgggcccgccgcgcaagcggccgccgggggggcgtcaaacccccctccctaggc120
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