一種來源于煙曲霉的植酸酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來源于煙曲霉的植酸酶，并通過將植酸酶基因?qū)肜锸夏久怪?，?gòu)建了能重組表達該植酸酶的里氏木霉工程菌株。該工程菌株能高效表達植酸酶，搖瓶發(fā)酵酶活為880U/mL。本發(fā)明制備得到的植酸酶可廣泛應(yīng)用于飼料中，能大大提高養(yǎng)殖動物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排泄量降低了13.3%，從而有利于增加養(yǎng)殖效益，降低對環(huán)境的污染。
【專利說明】一種來源于煙曲霉的植酸酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來源于煙曲霉的植酸酶及其以應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植酸酶(Phytase)即肌醇六憐酸水解酶(Myo-1-nositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。植酸酶具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸鹽降解為無機磷和肌醇，同時釋放出植酸鹽結(jié)合的其他營養(yǎng)物質(zhì)?？蓮V泛用作飼料添加劑。目前，利用植酸酶飼喂單胃動物的效果已經(jīng)得到了驗證。飼料中添加植酸酶后，可以減少5-70%無機磷的用量，糞便中磷的排放量減少了 30-40%以上，不僅大大降低了植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)作用，增加生產(chǎn)效益，還能有效的降低環(huán)境污染，因此對植酸酶的研究具有重要的意義。
[0003]目前在天然材料中植酸酶的表達水平較低，酶學(xué)性能也不能滿足飼料加工的應(yīng)用，采用基因工程的手段，不僅可以提高植酸酶的酶活力，還能通過構(gòu)建工程菌株改造酶的部分性質(zhì),使之更加適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的條件。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種來源于煙曲霉的植酸酶，并通過將煙曲霉來源的植酸酶基因轉(zhuǎn)化入里氏木霉中，構(gòu)建了能高效表達該植酸酶的里氏木霉工程菌株。經(jīng)木霉表達后，植酸酶的作用溫度和pH都更適合作為飼料添加劑，從而有效提高養(yǎng)殖動物的生產(chǎn)性能，減少磷的排放量，降低環(huán)境污染。
[0005]本發(fā)明一方面提供了一種植酸酶，其特征在于:
Ca)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的植酸酶；
(b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有植酸酶活性的酶。
[0006]用于編碼上述植酸酶的基因，其中一種編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0007]本發(fā)明另一方面涉及上述植酸酶在飼料中的應(yīng)用。
[0008]有益效果
本發(fā)明提供了一種新型的植酸酶，并構(gòu)建了重組表達該酶的里氏木霉工程菌株，搖瓶發(fā)酵酶活高達880U/mL。本發(fā)明制備得到的植酸酶可廣泛應(yīng)用于飼料中，能大大提高養(yǎng)殖動物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排泄量降低了 13.3%，從而有利于增加養(yǎng)殖效益，降低對環(huán)境的污染。
[0009]
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0011]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋。
[0012]實施例1煙曲霉植酸酶基因的克隆
以煙曲霉(As/76?r^777w5.基因組總DNA為模板,利用上下游引物進行擴增。
[0013]PCR 擴增條件為 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個循環(huán)；72°C7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，進行測序分析。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。經(jīng)過NCBI Blast比對發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與煙曲霉的植酸酶序列相似性為89%，為一新的等位基因。
[0014]實施例2表達載體的構(gòu)建
將實施例1中回收的擴增產(chǎn)物連接到PMD18-T載體，獲得克隆載體pMD-TR質(zhì)粒，然后用NcoI和KpnI進行雙酶切，回收TR片段；取2 μ I回收產(chǎn)物與NcoI和KpnI雙酶切pKDN_5載體連接過夜導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質(zhì)粒pKDN-TR。
[0015]實施例3轉(zhuǎn)化與 篩選
3.1原生質(zhì)體制備
接種里氏木霉reesei )菌絲于PDA平板上生長4天；切取直徑約3 cm的菌落置于約60 mlYEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養(yǎng)基中，30°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置于盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小時；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000 rpm，離心 10 min ;棄上清，加 10-20 ml STC 液(20% 蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mMCaCl2)懸浮,3000 rpm,離心 10 min ;加適量 STC 懸浮分裝(150 μ?/管，IO8 個/ml )。
[0016]轉(zhuǎn)化與驗證
取2Pg pKDN-TR DNA加入到150μ1原生質(zhì)體中，接著加入500μ1 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置25 min ;然后分2_3次再加Iml 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置25min，把原生質(zhì)體加到50 ml左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養(yǎng)基(0.l%MgS04, 1%KH2P04,0.6% (NH4) 2S04, 1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入含100μδ/ml潮霉素下層基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(2%葡萄糖，(λ 5% (ΝΗ4) 2S04, 1.5%KH2P04, 0.06%MgS04,0.06%CaCl2，1.5%瓊脂)，28°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天至轉(zhuǎn)化子長出。
[0017]提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物擴增潮霉素基因驗證轉(zhuǎn)化子。PCR擴增條件為 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物并進行測序分析。將其中一株陽性轉(zhuǎn)化子命名為里氏木霉TR-01(Trichoderma reesei TR-01)。
[0018]實施例4發(fā)酵與酶活測定
4.1發(fā)酵驗證將陽性轉(zhuǎn)化子Trichoderma reesei TR-Ol接種于麗發(fā)酵培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5% 玉米漿，0.44%(NH4)2SO4,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐溫-80，
0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時，然后25°C培養(yǎng)48小時；所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000 g條件下離心10 min，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳檢測，在23kDa左右處出現(xiàn)一條帶，即為重組表達的植酸酶。
[0019]酶活測定
酶活定義:在溫度為37°C、pH為5.0的條件下，每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉中釋放I μ mo I無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
[0020]測定方法:準(zhǔn)確稱取0.6804g在105°C烘至恒重的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀(5.9)于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液(5.1)溶解，并定容至100ml，濃度為50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸緩沖液(5.2)稀釋成不同濃度，與待測試樣一起反應(yīng)測定。以無機磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程(y=ax + b )。
[0021]反應(yīng)后的試樣在水浴中靜置IOmin，在離心機(6.7)上以4000r/min離心IOmin，上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(6.3)415nm波長處測定樣品空白(Atl)和樣品溶液(A)的吸光值，A-Atl為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。
[0022]植酸酶活性按下式計算 U=FXC / (mX30)
式中:
U 一試樣中植酸酶的活性，U/g
C 一根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的酶活性，U。
[0023]F 一試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)。
[0024]m 一試樣質(zhì)量，g。
[0025]30 —反應(yīng)時間，min。
[0026]采用上述方法測得里氏木霉工程菌搖瓶發(fā)酵上清液酶活約為880U/mL。
[0027]本發(fā)明構(gòu)建的里氏木霉工程菌能夠高效重組表達煙曲霉的植酸酶，且多次傳代后，依然能保持遺傳穩(wěn)定性。
[0028]實施例5養(yǎng)殖動物飼喂實驗
采購I日齡羅氏308白羽肉公雞，分為對照組和實驗組，每個處理組16個重復(fù)，每個重復(fù)8羽雞，生產(chǎn)試驗期為35天，其中對照組為飼喂普通商品日糧，實驗組為飼喂添加本發(fā)明重組植酸酶的普通商品日糧，測量試驗過程中采食量、料重比、體重的變化以及磷的排放情況，實驗結(jié)果如表1和表2所示:
表1肉雞生產(chǎn)性能統(tǒng)計結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種植酸酶，其特征在于: Ca)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的植酸酶； (b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有植酸酶活性的酶。
2.用于編碼權(quán)利要求1所述植酸酶的基因。
3.權(quán)利要求2所述基因，其一種核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.權(quán)利要求1所述植酸`酶在飼料中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23K1/165GK103667204SQ201310608176
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】李佩佩, 張青, 王華明, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司